Sumário

O Minuto 2 (MDM2) proteína de murino duplo é um regulador chave da proliferação celular e da apoptose que actua principalmente por inibição da supressor de tumor p53. Da mesma forma, o da PI3-quinase (PI3K) /Akt é crítica para a sobrevivência das células do factor de crescimento mediado. Além disso, tem sido relatado que a AKT pode fosforilar e activar directamente a MDM2. Neste estudo, que mostram que o IGF-1 regula-se os níveis de proteína MDM2 de uma forma de PI3K /AKT-dependente. A inibição da mTOR por rapamicina ou expressão de um fator de iniciação eucariótico negativo dominante 4E proteína de ligação 1 (4EBP1) proteína mutante, bem como a ablação de eucariota fator de iniciação 4E (eIF4E), suprime eficazmente o IGF-1 mediada por sobre-regulação de MDM2. Além disso, mostramos que a rapamicina inibe eficazmente a expressão de MDM2 e sensibiliza as células cancerosas à quimioterapia. Tomados em conjunto, este estudo revela um novo mecanismo pelo qual o IGF-1 activa MDM2 através da via mTOR, e que a inibição farmacológica de mTOR combinada com a quimioterapia pode ser mais eficaz no tratamento de um subconjunto de cancros que albergam activação aumentada de MDM2.

Citation: Du W, Yi Y, Zhang H, J Bergholz, Wu J, Ying H, et al. (2013) rapamicina inibe a IGF-1-Mediated-regulação de MDM2 e sensibiliza células cancerosas para quimioterapia. PLoS ONE 8 (4): e63179. doi: 10.1371 /journal.pone.0063179

editor: Zhi-Min Yuan, da Universidade de Texas Centro de Ciências da Saúde, em San Antonio /Greehey CCRI, Estados Unidos da América

Recebido: 16 de Novembro, 2012; Aceito: 29 de março de 2013; Publicação: 30 de abril de 2013

Direitos de autor: © 2013 Du et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health (NIH) concede (CA79804) e pelo Programa de Pesquisa básica Key National (973 Programa) da China (2012CB910700) para ZX, e os Estados Unidos Departamento de concessão de Defesa Congressionally Directed Medical Research Programs (W81XWH-10 -1-0161) para JB. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

ativação anormal de murino Duplo Minuto 2 (MDM2) foi estabelecido como um importante fator causal no desenvolvimento do câncer humano. funções de MDM2 como uma ubiquitina-ligase E3 para facilitar a degradação de p53, um regulador chave para a proliferação celular, apoptose e senescência, em resposta a tensões celulares, tais como danos no ADN e stress oncogénica [1]. A amplificação do

gene MDM2

foi observada numa variedade de tumores e cancros humanos, incluindo tumores do tecido mole, osteossarcoma, carcinoma esofágico e [2]. Notavelmente, MDM2 foi demonstrado que possuem funções oncogénicas independente de p53 [3], [4]. Trabalho de nós e outros mostraram que MDM2 pode alvejar e inibir a proteína do retinoblastoma (Rb) via mediada por proteassoma degradação [5], [6], [7], [8], [9]. MDM2 também tem sido demonstrado para complexar com e regular a estabilidade da proteína e /ou a actividade de um subconjunto de proteínas envolvidas na proliferação celular e a morte celular, incluindo p73 [10], [11], E2F1 [12], p21 inibidor de quinase dependente de ciclina [13], beta-arrestina, e G-protein-coupled receptor quinase 2 (GRK2) [14], [15].

tem sido demonstrado que a proteína MDM2 localização subcelular e funções são modulados pela PI3 -Kinase (PI3K) /Akt. AKT pode fosforilar directamente MDM2 em Ser166 e Ser188, facilitando, assim, a translocação nuclear de [16] e a degradação de p53, p300, bem como a interacção [17], [18]. Além disso, a sobre-expressão de AKT foi mostrado para estabilizar a proteína MDM2 [19]. Recentemente, AKT tem emergido como um regulador crítico de mamífero alvo do complexo rapamicina 1 (mTORC1). AKT inibe o complexo TSC2 /TSC1, conduzindo à activação de mTORC1 [20]. Importante, a evidência emergente sugere que a atividade mTORC1 é fundamental para a função oncogénica AKT. Com efeito, o crescimento do tumor acelerado após a activação constitutiva de AKT é invertida pela inibição da mTOR [21]. De modo semelhante, os ratinhos que expressam AKT1 humano na próstata desenvolver um fenótipo neoplásico, que está completamente abolido pela inibição da mTOR [22]. Além disso, a inactivação de AKT leva à inibição da proliferação de células, que é dependente mTORC1 [23]. Estes estudos sugerem que a Akt-mTOR é crucial para o crescimento de células tumorais.

Neste estudo, mostra-se que o factor de crescimento semelhante a insulina 1 (IGF-1) regula-se a expressão de MDM2 através da AKT-mTOR via. A inibição da mTOR por rapamicina, a expressão de um fator de iniciação eucariótico negativo dominante 4E proteína de ligação 1 (4EBP1) mutante ou de silenciamento 4E fator de iniciação eucariótico (eIF4E) anular eficientemente IGF-1 mediada por sobre-regulação de MDM2. Além disso, mostramos que a rapamicina inibe eficazmente a expressão de MDM2 e sensibiliza as células cancerosas à apoptose induzida por fármacos quimioterápicos.

Resultados

IGF-1 induz MDM2 Expressão em uma maneira dependente da PI3K e não faz alter MDM2 estabilidade da proteína ou do estado estacionário níveis de mRNA

Nós temos mostrado previamente que o IGF-1 modula a p21 inibidor da quinase dependente da ciclina de impacto sobre a sobrevivência das células após estresse genotóxico [24]. Uma vez que o IGF-1 é conhecida para activar a via PI3K /AKT, estávamos interessados ​​em decifrar o papel da via PI3K /AKT na sobrevivência mediada por células-IGF-1. Como mostrado na Figura 1A, o IGF-1 de tratamento de células U2-OS de osteossarcoma humano privadas de soro (p53 do tipo selvagem) conduziu claramente a activação AKT, como mostrado por um aumento da fosforilação de AKT. Notavelmente, o IGF-1 induziu a expressão da proteína MDM2, como demonstrado por um aumento de ambas as bandas de proteína MDM2 detectados por um anticorpo específico para MDM2, SMP14, consistente com relatos anteriores [6], [9], [25]. Este efeito de IGF-1 em MDM2 foi eficazmente bloqueada por tratamento com LY294002, um inibidor de PI3K selectiva [26], mas não por PD98059, um inibidor de MAP-quinase-quinase (MEK), ou por SB203580, um inibidor específico de stress p38 proteína quinase activada [27]. Estes dados sugerem que o IGF-1 regula-se-expressão da proteína MDM2 através da cascata de sinalização de PI3K-AKT.

(A) U2-OS células foram privadas de soro durante 24 horas e depois pré-tratados ou com PI3- -quinase (PI3K) inibidor de LY294002 (20 uM), a MAP-quinase-quinase (MEK) PD98059 inibidor (25 uM), ou p38 proteína SB202190 inibidor da cinase activada pelo stress (10 uM) durante quatro horas, seguido de tratamento com IGF-1 (50 ng /ml) durante seis horas. As células foram lisadas e sujeitas a análise de Western blot. (B) As células H1299 foram por incubação na ausência de FBS durante 24 horas e tratou-se com o IGF-1, durante seis horas, tal como indicado privadas de soro. Os lisados ​​celulares foram sujeitos a análise de Western blot. S: exposição de curta; L:. A exposição a longo

Uma vez que temos mostrado previamente que o IGF-1 pode ativar p53 e MDM2 é um alvo p53 jusante directo [24], foi perguntado se o efeito do IGF-1 no expressão de MDM2 é dependente de p53. Foram tratados células H1299 de carcinoma do pulmão de células não-pequenas humano p53 com IGF-1. IGF-1 era ainda capaz de induzir a expressão da proteína MDM2 em células H1299 de um modo dependente da dose (Figura 1B), o que indica que o IGF-1 mediada por sobre-regulação de MDM2 é independente de p53.

Em seguida, investigou-se o IGF-1 regula-se os níveis de proteína MDM2, aumentando a sua estabilidade da proteína. Como esperado, o IGF-1 aumentou a expressão da proteína MDM2 (Figura 2A). No entanto, o IGF-1 de tratamento não alterou significativamente a meia-vida da proteína MDM2, como determinado por meio de tratamento com ciclo-heximida o inibidor da biossíntese de proteínas (Figura 2A e 2B) e por experiências de pulse-chase (Figura 2C e 2D). Nós, então, examinou se IGF-1 induz MDM2, aumentando os seus níveis de mRNA. No entanto, a análise de PCR quantitativa (Q-PCR) demonstrou que os níveis de ARNm de MDM2 não foram significativamente afectadas por IGF-1 de tratamento (Figura 2E), indicando que o IGF-1 não afecta os níveis de mRNA de estado estacionário.

( a) As células U2-OS foram privadas de soro durante 24 horas antes do tratamento com IGF-1 (50 ng /ml) durante seis horas. As células foram então tratadas com 50 ug /ml de ciclo-heximida (CHX) na presença ou na ausência de IGF-1 e recolhidas nos tempos indicados. Os lisados ​​celulares foram sujeitos a análise de Western blot para MDM2 e actina. (B) As análises quantitativas de níveis de proteína MDM2 a partir de células tratadas com CHX foram realizadas por varrimento de densitometria de cada banda de proteína MDM2 individual e a banda de proteína actina correspondente. A proporção de MDM2 mais de actina no ponto de tempo zero foi arbitrariamente definida como 100 por cento. Três experimentos independentes foram realizados com resultados semelhantes. células (C) U2-OS foram tratados com IGF-1 (50 ng /ml) durante seis horas e metabolicamente marcada com

35S-metionina, durante quarenta minutos, e depois perseguida com metionina fria. Os lisados ​​celulares com quantidades iguais de radioactividade foram imunoprecipitados com anticorpo contra SMP14 MDM2. As proteínas foram separadas por SDS-PAGE e visualizadas por autorradiografia. (D) A análise quantitativa foi realizada por densitometria de varrimento usando o software ImageQuant. células (E) privadas de soro U2-OS foram tratados com IGF-1 (50 ng /ml) durante seis horas. Os níveis de expressão do gene MDM2 foram determinadas por PCR quantitativa (Q-PCR) e normalizado para a expressão de GAPDH. Dados apresentados como médias e SE de dois experimentos independentes realizadas em duplicado.

A inibição do mTOR por rapamicina Blocos de IGF-1 e heregulina mediadas-regulação de MDM2

AKT tem foi demonstrado ser um importante regulador da actividade mTORC1. Assim, investigou-se a via mTOR desempenha um papel em IGF-1 mediada por sobre-regulação de MDM2. Para este fim, privadas de soro e, em seguida, pré-tratados células U2-OS com a rapamicina, um inibidor selectivo de mTOR [28], antes de IGF-1 de tratamento. Como esperado, a rapamicina bloqueado fosforilação da proteína ribossomal S6 (Figura 3A). Notavelmente, a rapamicina também bloqueou induzida por IGF-1 de MDM2 a sobre-regulação (Figura 3A). Resultados semelhantes foram observados em células H1299, em que a rapamicina revogados induzida por IGF-1 de MDM2-regulação e fosforilação de 4EBP1 (Figura 3B). Além disso, a expressão de AKT constitutivamente activa (mirístico-AKT) conduziu a um aumento dos níveis de proteína MDM2, que foi completamente bloqueada na presen de rapamicina (Figura 3C). Tomados em conjunto, estes dados suportam fortemente a noção de que uma via sensível à rapamicina é crítico para a regulação positiva de MDM2 via de sinalização de IGF-1 /PI3K /AKT.

U2-OS (A) ou H1299 (B) As células foram privadas de soro e pré-tratados com rapamicina (50 nM) durante quatro horas, e, em seguida, tratado com IGF-1 (50 ng /ml) durante seis horas. As células foram lisadas e sujeitas a análise de Western blot. análises quantitativas dos níveis de proteína MDM2 foram realizadas por densitometria para cada banda de proteína MDM2 indivíduo e da banda de proteína actina correspondente. A proporção de MDM2 mais de actina na amostra de controlo foi arbitrariamente definida como 1,0. células (C) U2-OS foram infectadas com adenovírus recombinante que codifica GFP ou miristico-AKT durante 24 horas antes do tratamento com rapamicina (100 nM) durante quatro horas. lisados ​​celulares foram submetidos à análise western blot.

Desde heregulina pode activar AKT, nós nos perguntamos se este ligando podia-se-regular MDM2 em uma maneira dependente da mTOR. Células MCF-7 ou H1299 células foram privadas de soro antes do tratamento com rapamicina, e, em seguida, tratado com heregulina-beta (HRG). Como mostrado na Figura 4A, a activação da sinalização de Akt por HRG eficazmente induzida a expressão da proteína MDM2, que foi completamente bloqueado por rapamicina em ambas as MCF-7 e células H1299 (Figura 4A e 4B). Além disso, o inibidor de PI3K LY294002 inibiu eficazmente o efeito de HRG a sobre-regulação de MDM2 (Figura 4B), indicando que Heregulina mediada por sobre-regulação de MDM2 é dependente de PI3K. Em conjunto, estes dados indicam que uma via sensível à rapamicina é necessária para a regulação positiva de MDM2 pela IGF-1 ou heregulina vias de sinalização.

(A) células MCF-7 foram tratadas pré-privadas de soro e com rapamicina (50 nM) durante quatro horas, e depois tratado com heregulina-beta (HRG; 25 ng /mL) durante 24 horas. As células foram lisadas e sujeitas a análise de Western blot. (B) As células H1299 privadas de soro foram pré-tratados com rapamicina (50 nM) ou o LY294002 (20 uM) durante quatro horas, e, em seguida, tratado com heregulina-beta (25 ng /mL) durante 24 horas. lisados ​​celulares foram submetidos à análise western blot.

Expressão de um mutante 4EBP1 defeituoso em mTOR fosforilação Atenua IGF-1 mediada pelo aumento da regulação do MDM2

A seguir, determinou se eIF4E, um dos principais alvos a jusante de mTOR, está envolvida em IGF-1 mediada por sobre-regulação de MDM2. Desde mTOR fosforila 4EBP1, resultando na sua dissociação de eIF4E e levando à formação do complexo de iniciação da tradução [29], foram utilizados 4EBP1-5A mutante, a que falta os sítios de fosforilação cinco Ser /Thr alvo de mTOR e, portanto, actua como um dominante inibidor negativo pela ligação elF4E para prevenir a iniciação da tradução [30]. Para este fim, as células H1299 foram transfectadas transientemente com quer de tipo selvagem ou 4EBP1 4EBP1-5A, seguido por privação de soro e de IGF-1 de tratamento. Como mostrado na Figura 5A, o IGF-1 de tratamento conduziu a um aumento acentuado na fosforilação de AKT, S6 e 4EBP1, correlacionada com um aumento marcado na expressão de MDM2. Notavelmente, a expressão do tipo selvagem 4EBP1 não alterou significativamente o efeito do IGF-1 sobre a expressão de MDM2, provavelmente devido a fosforilação eficaz de 4EBP1 em células H1299. No entanto, o IGF-1 mediada por MDM2-regulação foi significativamente inibida pela expressão ectópica de 4EBP1-5A. Em seguida, a fim de investigar o papel de eIF4E directamente, que ablated eIF4E endógena utilizando pequeno ARN interferente (siRNA) em células U2-OS. Embora o silenciamento eIF4E não afectou significativamente a expressão de MDM2 basal (Figura 5B), knockdown de eIF4E revogada completamente o efeito do IGF-1 sobre o aumento dos níveis de MDM2, apesar evidente 4EBP1 fosforilação (Figura 5C).

(A) H1299 As células foram transitoriamente transfectadas com o tipo selvagem 4EBP1, 4EBP1-5A, ou vector plasmídeo. Vinte e quatro horas após a transfecção, as células foram divididas e mantida durante mais 24 horas anteriores ao soro de fome durante 24 horas. As células foram então tratadas com ou sem IGF-1 (50 ng /ml) durante seis horas. As células foram lisadas e submetidas a transferência de Western. análises quantitativas dos níveis de proteína MDM2 foram realizadas por densitometria para cada banda de proteína MDM2 indivíduo e da banda de proteína actina correspondente. A proporção de MDM2 mais de actina na amostra de controlo (pista 1) foi arbitrariamente definida como 1,0. (B) células U2-OS foram transitoriamente transfectadas com siRNA específica contra eIF4E (si4E) ou um controle mexidos (siScr). Os lisados ​​celulares foram sujeitos a Western blotting, como mostrado. (C) Células U2-OS transfectadas com si4E ou siScr foram-privadas de soro durante 24 horas antes do tratamento com ou sem 5 ng /ml de IGF-1, durante seis horas. Os lisados ​​celulares foram sujeitos a Western blotting, como mostrado. células (D) U2-OS foram transitoriamente transfectadas com siRNA específica contra S6K (siS6K) ou um siRNA mexidos (siScr). Os lisados ​​celulares foram sujeitos a Western blotting, como mostrado. (E) Células U2-OS transfectadas com siS6K ou siScr foram-privadas de soro durante 24 horas antes do tratamento com ou sem 5 ng /ml de IGF-1, durante seis horas. Os lisados ​​celulares foram sujeitos a Western blotting, como mostrado.

Além de fosforilar e inibir 4EBP1, mTOR fosforila e activa a proteína ribossomal S6 quinase (S6K), que por sua vez fosforila e activa a proteína ribossómica S6 em a fim de melhorar a tradução da proteína. Assim, ablated S6K por siRNA em células U2-OS. Tal como mostrado na Figura 5D e 5E, observou-se efeitos similares como eIF4E knockdown, indicando IGF-1 mediada por MDM2-regulação requer sinalização mTOR, que envolve tanto as vias de eIF4E e S6K.

A rapamicina O tratamento reduz a expressão de MDM2 e sensibiliza células cancerosas para a apoptose induzida por doxorrubicina

Desde MDM2 é um regulador negativo chave da p53, o que é essencial para o ADN de apoptose induzida por danos, investigámos o efeito da rapamicina sobre a apoptose induzida por doxorrubicina em p53-positiva células cancerosas. Nós escolhemos células MCF-7 de cancro da mama, porque eles abrigam uma mutação somática no gene PIK3CA que confere uma via AKT-mTOR constitutivamente activa [31]. As células MCF-7 foram pré-tratados com rapamicina, seguido de tratamento com uma dose baixa de doxorrubicina. A viabilidade celular foi avaliada por ensaio de exclusão de azul de tripano e análise de Western blot para a clivagem de poli polimerase de ADP-ribose (PARP), um marcador bioquímico para a apoptose. Sob estas condições, nem rapamicina nem doxorubicina sozinha induziu significativamente a apoptose. morte celular No entanto, na presença de rapamicina, doxorrubicina induzida eficaz (Figura 6A). Notavelmente, a rapamicina completamente bloqueada sobre-regulação de MDM2, mas não da p53 (Figura 6B). Fenómenos semelhantes foram observados em células de osteossarcoma humano SJSA-1, que abrigam amplificação de MDM2 [25] (Figura 6C e 6D). Em conjunto, estes dados sugerem que a rapamicina inibe a expressão da proteína MDM2, resultando na sensibilização das células cancerosas à doxorrubicina induzida morte celular.

(A-B), as células MCF-7 foram mantidas em meio de crescimento normal, pré-tratados com rapamicina (100 nM) durante 48 horas, e depois tratou-se com doxorrubicina (0,6 ug /ml) durante 24 horas. Ambas as células flutuantes foram recolhidas e aderentes, e sujeito a ensaio de exclusão de azul de tripano (A) e análise por Western blot (B). A viabilidade celular é apresentada como uma percentagem de células vivas sobre o total de células contadas. Dados apresentados como médias e DP de três experiências independentes realizadas em triplicado. (C) SJSA-1 foram mantidas em meio de crescimento normal, pré-tratados com rapamicina (100 nM) durante 48 horas e depois tratou-se com doxorrubicina (1 ug /ml) durante 36 horas. Ambas as células flutuantes foram recolhidas e aderentes, e sujeitas a análise de Western blot. (D) Morfologia das células SJSA-1 foi gravado por microscopia de contraste de fase (100 ×).

A seguir, investigou se a regulação negativa de MDM2 desempenha um papel causal na sensibilização de células a doxorrubicina por rapamicina tratamento. Foram tratados células U2-OS com rapamicina e doxorrubicina, quer na presença ou ausência de expressão ectópica de MDM2. Como mostrado na Figura 7A, a expressão de MDM2 reverteu drasticamente os níveis de PARP clivada em comparação com células que expressam um controlo de vector. Notavelmente, a expressão de MDM2 reduziu os níveis de proteína p53, assim como a fosforilação de Ser15 em p53. Além disso, a expressão de MDM2 eficazmente resgatados da morte celular induzida por rapamicina mais o tratamento combinação doxorrubicina (Figura 7B e 7C). Estes dados indicam que a inibição da MDM2-regulação por rapamicina é em grande parte responsável pela sensibilização de células de quimioterápicos tratamento.

(A-B) células U2-OS foram transitoriamente transfectadas com MDM2 ou de um controle de vetores. Vinte e quatro horas após transf ecções, as células foram pré-tratadas com rapamicina (100 nM) durante 48 horas e depois tratou-se com doxorrubicina (1 ug /ml) durante 36 horas. Ambas as células flutuantes foram recolhidas e aderentes, e submetida a Western blotting (A) ou citometria de fluxo (B). (C) Morfologia das células U2-OS foi gravado por microscopia de contraste de fase (100 ×).

Discussão

Neste estudo, demonstramos que IGF-1 up-regula MDM2 os níveis de proteína pela via mTOR, acrescentando assim uma outra camada de regulação fina para a via MDM2-p53 pela IGF-1 cascata de sinalização /AKT. AKT tem sido mostrado previamente para interagir fisicamente com fosforilar e MDM2, o que facilita a translocação nuclear de MDM2 [16]. A fosforilação de MDM2 aumenta a interacção de MDM2 com p300, aumentando assim a actividade de ubiquitina-ligase E3 para p53 e p53 facilitar a ubiquitinação e degradação [17]. Além disso, a fosforilação de MDM2 em Ser166 e Ser188 por AKT foi mostrado para estabilizar a proteína MDM2 inibindo a sua auto-ubiquitinação [19]. No entanto, também foi relatado que a fosforilação mediada por AKT de MDM2 não parece afectar dramaticamente MDM2 localização subcelular [18]. Assim, embora seja claro que a AKT regula positivamente MDM2, os mecanismos moleculares precisos parecem ser células de tipo e dependente do contexto.

Estudos anteriores sugerem que MDM2 pode ser regulada ao nível da tradução. tradução reforçada de MDM2 tem sido observada em linhas de células de coriocarcinoma humano [32]. O mARN MDM2 contém uma região 5 ‘não traduzida distinta (UTR) que desempenha um papel na eficiência de translação [33]. Além disso, o aumento da expressão de MDM2 induzida por expressão de BCR /ABL associadas com tradução é MDM2 melhorada devido à regulação na UTR 5 ‘do ARNm de MDM2 [34]. Além disso, a inibição de IGF-1 de sinalização, quer por nocaute do receptor de IGF-1 (IGF-1R), ou por um inibidor de IGF-1R cinase, tem sido demonstrado para diminuir a tradução MDM2 mediada via o seu 5 ‘UTR [35]. Notavelmente, tem sido relatado que o factor de crescimento de hepatócitos (HGF) facilita a tradução MDM2 via mTOR em hepatócitos embrionárias [36].

Neste estudo, que mostram que tanto a sinalização de IGF-1 e heregulina activar MDM2 através da AKT -mTOR via. Este estudo tem duas implicações importantes. Em primeiro lugar, as respostas celulares a uma variedade de tensões convergem na via p53-MDM2, que serve como o sensor central para o stress. Em segundo lugar, existem dois principais mecanismos de regulação para modular os níveis de proteína MDM2: regulação da transcrição dependente de p53 e controle de translação dependente da mTOR. sinais de estresse, incluindo danos no DNA, hipoxia, privação de nutrientes e estresse oxidativo, ativar p53, que por sua vez transcricionalmente up-regula a expressão MDM2. sinalização de factor de crescimento, por outro lado, activa o Akt-mTOR para melhorar a tradução da proteína MDM2. Este regulamento delicado de MDM2 garante que p53 está sob controlo apertado. Além disso, os nossos dados mostram que eIF4E S6K ou ablação não afectam significativamente os níveis basais de MDM2. No entanto, o silenciamento de qualquer eIF4E ou S6K completamente abolida IGF-1 induzida por MDM2-regulação. Estes resultados indicam que a via mTOR é necessária para o crescimento mediada pelo factor de sobre-regulação de MDM2.

A inibição da mTOR usando inibidores farmacológicos específicos resulta na paragem do ciclo celular G1 /S, a atenuação do crescimento celular e apoptose [37 ]. Estudos pré-clínicos indicam que a rapamicina e os seus derivados inibem o crescimento do cancro e proliferação celular, que tem sido demonstrado tanto in

in vitro

e numa variedade de cancros humanos em modelos animais [38]. Além disso, foi relatado que a inibição da apoptose através de mTOR promove controlo da tradução de Mcl-1, Bcl-2 um membro da família como [39]. No entanto, na maioria dos casos, a inibição da mTOR por si só não induz a apoptose eficazmente; em vez disso, sensibiliza células para apoptótica estímulos. Por exemplo, a rapamicina aumenta a capacidade de cisplatina para induzir a apoptose em linhas celulares de leucemia promielocítica humanos e linhas celulares de cancro do ovário [40]. RAD001, um derivado de rapamicina, foi mostrado para sensibilizar um número de células cancerosas de p53-positivos à apoptose induzida pela cisplatina por inibição da expressão da proteína p21 através da repressão da tradução geral [41]. Além disso, a rapamicina sensibilizados várias linhas celulares de mieloma a apoptose induzida por dexametasona, associados com a diminuição da expressão de ciclina D2 e ​​survivina [42]. Também tem sido relatado que a expressão do mutante imita 4E-BP1 constitutivamente activa o efeito da rapamicina na intensificar a apoptose em várias células de mieloma, o que sugere que os inibidores de mTOR sensibilizar células através da inibição dependente do tampão de tradução [43]. Consistente com esta noção, pequenas moléculas que têm como alvo a iniciação da tradução dependente da tampa pela inibição da eIF4A pode restaurar a sensibilidade de drogas em um modelo de linfoma do rato [44].

Neste estudo, observou-se que o tratamento rapamicina e doxorrubicina combinação levou a expressão de MDM2 reduzida, o que resultou num aumento da apoptose, implicando que a p53 pode estar envolvida neste processo. Os nossos dados mostraram que a doxorrubicina sobre-regulada de p53, tal como esperado. No entanto, enquanto a rapamicina /doxorrubicina tratamento de combinação não afectou de forma significativa os níveis de proteína p53, a fosforilação em serina 15 na p53 foram aumentados, sugerindo que foi induzida actividade de p53. Importante, expressão ectópica de MDM2 revertida apoptose, concomitante com níveis de proteína p53 reduzidos e serina 15 de fosforilação. No entanto, também podem ter MDM2 funções independentes de p53 para inibir a apoptose na presença de tratamento de combinação de doxorrubicina /rapamicina.

Em resumo, este estudo mostra que a rapamicina sensibiliza as células cancerosas à apoptose induzida por fármacos quimioterápicos e sugere que mTOR -targeted anticancerígeno terapia combinada com a quimioterapia pode ser mais eficaz no tratamento de cânceres p53 positivo.

Materiais e Métodos

cultura de células, tratamentos com drogas e Plasmids

materno carcinoma de células MCF-7, osteossarcoma células U2-OS e células H1299 de carcinoma do pulmão de células não-pequenas foram mantidas em meio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) contendo 4,5 g /l de glucose suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS; certificada, GIBCO) , 100 unidades /mL de penicilina (GIBCO), 100 ug /ml de estreptomicina (GIBCO), e 2 mM de L-glutamina (GIBCO). Todas as linhas celulares foram passadas utilizando 0,05% de solução de Tripsina-EDTA (GIBCO). As células foram mantidas numa atmosfera humidificada a 37 ° C sob uma incubadora de CO a 5%

2 atmosfera. As células foram obtidas da American Type Culture Collection (ATCC). MCF-7, U2-OS ou células H1299 a 60-70% de confluência foram privadas de soro durante 24 horas em DMEM isento de soro, antes de IGF-1 de tratamento. IGF-1 (Sigma) foi preparado como uma solução estoque /ml 100 ug em água. inibidores químicos LY294002, PD98059, SB202190 (Calbiochem) e Rapamicina (Sigma) foram preparados como 1.000 × soluções estoque. A doxorubicina (Sigma) foi preparado como uma solução estoque a 2 mg /mL. Heregulina-beta (Upstate) foi preparado como uma solução de 20 ug /ml em PBS. Para o tratamento de UV, os meios foram removidos e as células irradiadas com tampas removidas num Spectrolinker XL-1000 UV Crosslinker (Spectronics Corporation). Após a irradiação, os meios foram adicionados às placas e as células foram cultivadas como indicado para cada experiência antes da recolha de ambas as células flutuantes e aderentes.

A infecção adenoviral, transfecção transiente e o ARN de interferência

em Células 60% de confluência foram infectadas com adenovírus codificador de AKT ou um controlo de vector e incubou-se durante duas horas a 37 ° C com agitação suave em intervalos de vinte minutos, seguido pela adição de meio de cultura e incubou-se a 37 ° C com 5% de CO

2 durante 24 horas. células H1299 em 80% ou confluência de células U2-OS a 50% de confluência foram transfectados utilizando Lipofectamina 2000 reagente de transfecção (Invitrogen), de acordo com as instruções do fabricante. Os meios foram substituídos oito (H1299) ou seis (U2-OS) horas após a transfecção. Pequeno ARN interferente contra eIF4E (AAGCAAACCUGCGGCUGAUCU), S6K (GGACATGGCAGGAGTGTTT) e mexidos siARN controla oligonucleótido específico para cada ARNsi foram adquiridos a partir de Xangai GenePharma Co., Ltd. e transfectadas utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen).

Análise Western Blot

As células foram recolhidas, lavadas com PBS e ressuspensas em EBC

250 tampão de lise (NaCl 250 mM, Tris 50 mM, pH 8,0, 0,5% de Nonidet P-40, NaF 50 mM, fluoreto de fenilmetilsulfonilo 1 mM , 2 ug /ml de aprotinina, e 2 ug /mL de leupeptina). A concentração de proteína foi determinada utilizando o Bio-Rad Protein Assay Reagent (Bio-Rad). Quantidades iguais de proteína foram carregadas, separadas por SDS-PAGE, transferidos para membranas de PVDF (Millipore), e hibridado com um anticorpo primário apropriado e anticorpo secundário conjugado com HRP para a detecção subsequente por quimioluminescência aumentada. O anticorpo monoclonal específico para MDM2 SMP14 (Santa Cruz) foi utilizado a 1:200 diluições. O anticorpo monoclonal DO-1 específico para p53 (Santa Cruz) foi utilizado a uma diluição de 1:250. O anticorpo policlonal C-11, específico para a actina (Santa Cruz) foi utilizado a uma diluição de 1:1000. Os anticorpos específicos para PARP (# 9542), fosfo-AKT (Ser473; # 9271), AKT total (# 9272), Phospho-S6 ribossomal de proteínas (serina 235/236; # 2211), S6 ribossomal Proteína (# 2217), S6 quinase (# 9202), eIF4E, Phospho-4EBP1 (Ser65; # 9456) ou 4EBP1 (# 9452) foram adquiridas da Cell Signaling Technology e usado em 1:1000 diluições

Fluxo de Análise de Citometria

As células foram tripsinizadas, lavadas com PBS frio e fixadas em 70% de etanol a 4 ° C durante a noite. As células foram coradas com iodeto de propídio (PI) suplementado com 80 ug /ml de RNase A a 37 ° C no escuro durante uma hora. As células foram então submetidas a análise por citometria de fluxo FACScan Citómetro de fluxo (Becton Dickson), e os dados foram analisados ​​utilizando o software celular Quest (Becton Dickson).

PCR quantitativa

O ARN total foi extraído a partir de células usando Tryzol de acordo com as instruções do fabricante (Gibco). O ARN foi transcrito de forma inversa utilizando o kit de síntese de ADNc iScript (BioRad). A reacção foi também levada a cabo na ausência de transcriptase inversa para servir como um controlo negativo. Q-PCR foi realizada em volumes de reacção de 25 ul (8 ng de cDNA, 12,5 uL de Taqman Universal PCR Master Mix, 1,25 mL Gene Expression Demanda reagente; Applied Biosystems) para ambos MDM2 e GAPDH. A reacção de Q-PCR foi realizada em um sistema de detecção de sequência ABI Prism 7000 (Applied Biosystems). As condições de Q-PCR foram as seguintes: 10 minutos a 95 ° C, seguido de 40 ciclos de desnaturação a 95 ° C durante 15 segundos e estendendo-se de recozimento /a 60 ° C durante um minuto. valores quantificação relativa foram calculados utilizando o método ΔΔCt.

Viabilidade Celular Ensaio

Ambos flutuante e as células aderentes foram recolhidas e novamente suspensas em PBS. Volumes iguais de solução de azul de tripano mancha (0,4%; Gibco) e suspensão de células foram misturados e coradas durante cinco minutos à temperatura ambiente. Os números de células coradas e não coradas foram contadas com um hemacitómetro. Pelo menos 500 células por amostra foram contadas. A percentagem de viabilidade representa a proporção de células não-coradas, as células totais. Estudante de

t-

teste foi utilizado para determinar a significância estatística das diferenças entre os grupos.

Reconhecimentos

Agradecemos ao Dr. J Lawrence (University of Virginia, Charlottesville, Virginia) para pCMV4-4EBP1 e pCMV4-4EBP1-5A plasmídeos.