Abstract

CDKN2A

(codifica p16

INK4A e p14

ARF) exclusão, o que resulta em ambos Rb e p53 inactivação, é a anomalia cromossômica mais comum em humanos cancros. Para mapear precisamente os pontos de quebra de deleção é importante para entender o mecanismo molecular de rearranjo genómico e pode também ser útil para aplicações clínicas. No entanto, os métodos actuais para a determinação do ponto de interrupção são ou de baixa resolução ou requerem o isolamento de células cancerosas relativamente puro, o que pode ser difícil para amostras clínicas que são tipicamente contaminados com diversas quantidades de células hospedeiras normais. Para superar este obstáculo, desenvolvemos uma nova abordagem, designada Primer aproximação Multiplex PCR (PAMP), para o enriquecimento de sequências de ponto de interrupção seguido de hibridização matriz azulejos genômica para localizar os pontos de interrupção. Em uma série de experimentos de prova de conceito, fomos capazes de identificar derivados de câncer

CDKN2A

breakpoints genômicas quando mais de 99,9% do tipo genoma selvagem estava presente em um sistema modelo. Este projeto pode ser ampliado com o apoio bioinformática e pode ser aplicado para validar loci associado a um cancro outro candidato que são revelados por outros ensaios de rendimento mais sistêmicos, mas inferiores

Citation:. Liu YT, Carson DA (2007) A nova abordagem para a Determinação Cancer Genomic pontos de interrupção na Presença de DNA normal. PLoS ONE 2 (4): E380. doi: 10.1371 /journal.pone.0000380

Editor do Academic: David Levens, National Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 20 de fevereiro de 2007; Aceito: 27 de março de 2007; Publicação: 18 de abril de 2007

Direitos de autor: © 2007 Liu, Carson. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho é apoiado em parte por doações para o NanoTumor Centro UCSD de Excelência para o cancro Nanotecnologia (CA119335), CA23100 (DAC) e AI36214-12S1 (YT L.) dos Institutos Nacionais de Saúde

Conflito de interesses:. o autores (Y.-TL DAC) tenham apresentado um pedido provisório de patente com base neste estudo

Introdução

os tumores evoluem através da acumulação contínua e seleção de genes mutados aleatoriamente.. Embora conjuntos de mutações vantajosas são seleccionados em tumores, as mutações neutras ou mesmo ligeiramente prejudicial também pode ocorrer devido à instabilidade genómica e deriva genética. Recentemente, muito esforço tem sido dispendido para identificar em cancros humanos primários apontar mutações nos exons de genes relacionados ao câncer. No entanto, o mapeamento sistêmico de rearranjos de DNA genómico ficou para trás, devido a dificuldades técnicas na detecção de deleções menores, a heterogeneidade do tumor, bem como a necessidade de purificar maligna das células normais [1]. Historicamente, tal trabalho foi realizado por demorado e trabalhoso genética e clonagem molecular em linhas celulares de cancro estabelecidas [2], [3], [4]. Um dos exemplos mais marcantes é a deleção homozigótica do

CDKN2A

(

INK4A /ARF

) lócus supressor de tumor, que foi descoberto neste e em outros laboratórios [3], [4], [5], [6], [7], [8]. O

CDKN2A

eliminações ocorrem no início do desenvolvimento do tumor [9], [10], [11]. O p16

INK4a (um dos

produtos CDKN2A

[12]) proteína restringe progressão do ciclo celular pela via Rb e pode ser responsável pela diminuição no potencial de replicação das células-tronco durante o envelhecimento [13] . O p14

ARF (o outro quadro de leitura alternativa de

CDKN2A

[14]) produto do gene regula a expressão de MDM2, o volume de negócios de p53, e, assim, controla a resposta celular ao estresse (revisto em [6 ], [7], [8], [15], [16], [17]). Porque o Rb e as vias de p53 são centrais para o câncer gate-keeping e caretaking [18], [19], existem pressões seletivas fortes para o rompimento de toda a

CDKN2A

segmento de gene em ambos os cromossomos. Poucas outras exclusões são bem caracterizado, embora espera-se que mais será encontrado quando mais dados de matriz com base hibridização genômica comparativa (array-CGH) são relatados e também através do projeto Cancer Genome Atlas (TCGA) [20], [21 ], [22], [23], [24]. Será importante para validar a relevância desses rearranjos genômicos para o desenvolvimento do cancro uma vez que muitas das mudanças estruturais genómicas pode ser simplesmente devido ao genoma instabilidade no câncer. estudos de grande escala com amostras clínicas será a confirmação mais fiável.

Enquanto mutações pontuais e muito pequenas inserções ou deleções no DNA genómico pode ser detectado pelo exão re-sequenciação, que pode ser mais difícil de detectar alterações do gene de dosagem fragmentos genómicos maiores, especialmente de deleções [1]. As técnicas atuais estabelecidas para o mapeamento de exclusão, incluindo Southern blotting [25], fluorescente

in situ

fluorescente (FISH) [26], a PCR quantitativa [26], [27], [28], [29], [ ,,,0],30], e gama-CGH [31] se basear na ausência de um sinal de tipo selvagem detectável [1]. Isto é problemático quando um número significativo de células normais estão presentes numa amostra de tumor. Matriz-CGH tem o potencial para analisar as alterações do número de cópias de ADN em grande escala do genoma com resolução relativamente alta, dependendo se BACs, produtos de PCR ou oligonucleótidos são usados ​​para os elementos da matriz. No entanto, estas técnicas frequentemente falham onde existe uma população heterogénea de células ou amostras de baixa qualidade [31]. FISH é menos vulnerável à presença das populações heterogéneas de células, mas tem resolução relativamente baixa e é difícil escalar. Com excepção de peixe, as outras técnicas mencionadas não são práticos para o mapeamento de translocações e inversões genômicas. -Seqüenciamento final profiling foi desenvolvido para resolver este problema, mas a abordagem era caro e difícil de escalar [32]. Portanto, há uma necessidade de desenvolver uma abordagem escalável para detectar tais mudanças estruturais genômicas em tumores sólidos, onde populações de células heterogéneas estão presentes.

Aqui nós relatamos uma nova abordagem, designada como Primer aproximação Multiplex PCR (PAMP), para enriquecer pequenas quantidades de sequências de ADN genómico suprimido na presença de ADN do tipo selvagem. As localizações genômicas das sequências enriquecidos são posteriormente decodificado por um conjunto azulejos genômica e confirmado por sequenciação.

Resultados

CDKN2A

lócus

O

CDKN2A

está localizado no cromossoma 9p21 (Figura 1). Ele codifica duas proteínas em diferentes fases de leitura: p16

INK4A e p14

ARF, que ambos têm 3 exons e compartilhar exons 2 e 3.

CDKN2B

(p15

INK4B) e

MTAP

(metiltioadenosina-fosforilase) (não mostrado) são genes centroméricos e teloméricas vizinha, respectivamente [3], [17], [33], [34]. BAC clone RP11-149I2 contém o todo

CDKN2A

fragmento genómico e foi usado como modelo para gerar sondas (excluindo regiões repetitivas) para impressão na matriz azulejos minigenomic. A frequência de sequências repetitivas previstas por RepeatMasker é mostrado na parte inferior do diagrama.

O mapa genômico abrange cerca de 55 kb em torno de

CDKN2A

acordo com Ensemble [59].

CDKN2A

/B localiza-se no cromossoma 9p21 e os seus produtos de ARN são codificados pela cadeia inversa.

CDKN2A

codifica proteínas 2 (p16

INK4A e p14

ARF) que compartilham os mesmos exons 2 e 3. Os primeiros exons de

INK4A

e

ARF

são cerca de 20 kb de distância.

CDKN2B

codifica p15

INK4B que é homólogo ao p16

INK4A. Além de transcrições, o mapa também mostra sequências repetitivas (REPETIÇÃO) e disponível clone BAC (clones tilepath Humano), RP11-149I2.

Primer aproximação Multiplex PCR (PAMP)

é difícil detectar uma pequena fracção de ADN genómico mutante suprimida na presença de um vasto excesso de ADN do tipo selvagem com CCG matriz ou outras ferramentas de biologia molecular conhecidos [26], [27], [35]. Em amostras de tumor tipicamente contaminados, o ADN genómico é composta de várias proporções de WT e

CDKN2A

ADN deficiente. Procurou-se tirar proveito do facto de uma sequência de genoma suprimido mais curto deve ser preferencialmente amplificado em comparação com uma sequência muito mais tempo WT usando “aproximado” flanqueando iniciadores (Figura 2A) [36].

A eficiência de amplificação por PCR está inversamente relacionado com a distância de iniciadores a montante e a jusante. Neste exemplo, os iniciadores para amplificar as sequências genómicas de todo o sítio de interesse (LOI) são divididos em grupos de 20: 10 de cada um para a frente (F1-F10) e reverso (os grupos R1-R10) (A). Enquanto todos os possíveis para a frente e reverso pares de iniciadores estão muito longe uns dos outros para a amplificação por PCR no genoma de tipo selvagem, determinado par de iniciadores é aproximar ( “aproximado”) devido a deleção (F3 e R3) no genoma mutado. reacções de PCR multiplex são definidas e representada como uma matriz para incluir uma para a frente e um grupo iniciador inverso. Os resultados de PCR esperados estão mostrados como sombras escala de cinzentos da matriz (B). Este exemplo mostra que apenas pares de grupos perto de ponto de interrupção dar produtos de PCR (F3-R3, R4-F3, F4-R3).

A abordagem está ilustrada na Figura 2. Neste exemplo, mesmo relativamente Cartilhas -spaced (média de 1 kb de intervalo) que cercam o locus de interesse estão divididos em 20 grupos de PCR. Existem 10 grupos de cada um dos iniciadores directos, F1, F2 …, F10 e o iniciador inverso R1, R2, …, R10, respectivamente (Figura 2A). Portanto, existem 100 pares (F1-R1, R2-F1, …, F1-R10; F2-R1, R2-F2, …, F2-R 10; …;. F10-R1, R2-F10, …, F10- R10) de reacções de PCR (Figura 2B). Espera-se que apenas um ou dois pares de reacções de PCR produzirá produtos de PCR específicas abrangendo o limite eliminação, uma vez que os outros pares de iniciadores deve ser demasiado longe do ponto de interrupção para a amplificação eficiente. Em seguida, alíquotas de cada reacção podem ser misturados para hibridar com uma única matriz de ladrilhos genómico. Ao contrário tradicional matriz-CGH, ​​espera-se que apenas os pontos que representam as sequências genómicas próximos pontos de interrupção será teoricamente iluminada, o que foi confirmado em experiências que se seguem.

A fim de aumentar o rendimento e reduzir o custo de reagentes , cada frente (F1-10) eo grupo iniciador inverso (R1-10) pode ter vários primers. Portanto, cada grupo PCR (por exemplo, F1-R1) par torna-se PCR multiplex. Portanto, nós designado este procedimento como Primer aproximação Multiplex PCR (PAMP).

Supressão breakpoint clonagem por PAMP e matriz azulejos minigenomic

Nós relatado anteriormente que a linha de células 562 Detroit tem um valor aproximado de 20 kb (incluindo

INK4A

exons 1 e 2) deleção no cromossomo 9p21 [3]. Nós usamos esta linha de células para testar a nossa abordagem de varredura eliminação. Quatro grupos (F

A, F

B, R

Y e R

Z) de iniciadores foram utilizados para quatro reacções PAMP (Figura 3a), utilizando molde de ADN genómico, quer a partir de Detroit 562 (

CDKN2A

deficiente) ou HEK293 (

CDKN2A

linhas de células de tipo selvagem). Alíquotas de todos os 4 produtos de reacção PAMP foram reunidas e marcado para hibridação em uma

INK4A

matriz ladrilhos minigenomic que abrange cerca de 25 kb, incluindo todos os exões de

INK4A

. Como previsto na figura 2, apenas com as sondas pontos próximos dos pontos de interrupção hibridaram com os fragmentos amplificados quando Detroit 562 ADN genómico foi utilizado como um modelo (Figura 3B). Quase nenhum sinal foi detectado quando o ADN genómico HEK293 foi utilizado como um modelo. A amostra de controlo HEK293 tinha um sinal significativamente maior em Cot-1 spots de DNA, apesar de sua intensidade geral absoluta do sinal é baixa.

(A) Cinco grupos de primers (F

A, F

B, R

x, R

Y e R

Z, as setas pequenas e cabeças de seta) perto de pontos de interrupção potenciais foram gerados para PAMP com base em nosso mapeamento anterior [3]. O mapeados

CDKN2A

pontos de interrupção da linha de células 562 Detroit (Figura 5) são indicados para o esclarecimento. O “E1”, “E2” e designações “E3” (fontes azuis) são as posições relativas de

INK4A

exons. O primeiro exão do

ARF

é mais para a direita deste diagrama e não está abrangido por esta matriz. As sondas da telha para a matriz são indicados com duas cores alternadas (linhas pretas e laranja curtas) para facilitar a identificação. (B) A primeira linha do

INK4A

matriz minigenomic foi manchado com as sondas telha mostrados no painel A. Cot-1 DNA (seqüência repetitiva de ADN genómico) pontos são indicados nesta matriz. O resto das manchas são de ADN de esperma de arenque. Ambos DNA do esperma Cot-1 e arenque são usados ​​como controles não-específicos. Esta matriz foi hibridado com amostras marcadas derivadas a partir de duas linhas celulares. Os mesmos conjuntos de iniciadores (F

A, F

B, R

Y e R

Z) foram utilizadas para reacções PAMP em Detroit 562 (mutante) e HEK293 (tipo selvagem) do ADN genómico de mapear os potenciais

CDKN2A

pontos de interrupção. Os produtos de amplificação foram marcados com diferentes corantes, dando origem a um sinal verde (Cy-3) para a amostra mutante e um sinal vermelho (Cy-5) para a amostra do tipo selvagem, para serem hibridados simultaneamente na matriz (matriz de duas cores). Os dois pontos verdes sobre a primeira linha revelou a localização ponto de interrupção, como foi discutido na Figura 2.

Além disso, as quatro matrizes separadas foram utilizadas para hibridar os produtos PAMP individuais descritos acima. Uma trama simples de sinal de relação de intensidade de produtos de PCR mutante /peso na matriz ladrilhos revelou a localização genómica do ponto de interrupção (Figura 4). Esta análise mostra uma leitura-o muito simples localização da eliminação é delimitada por dois picos. Apenas F

B-R

Y (matriz 27) e todos os produtos de agrupamento (29) de matriz de produzir o mesmo resultado, como mostrado na Figura 3. Em contraste, os outros três pares produziu apenas sinais fracos fundo sobre as matrizes. Este resultado indica que o produto PAMP recíprocas, com uma análise de matriz única dá a mesma informação de ponto de interrupção como quatro matrizes individuais. Os dados confirmam as previsões experimentais originais, e sugerem que o procedimento deve ser aplicáveis ​​em geral para eliminação e digitalização de translocação.

Quatro grupos (F

A, F

B, R

Y e R

Z) dos iniciadores foram utilizados para quatro reacções PAMP cada emparelhando todo o possível para a frente e para trás grupos de primers utilizando Detroit 562 (mutante) e HEK293 (controle) como modelos. O procedimento foi descrita brevemente na Figura 3. Os produtos foram marcados e utilizados para hibridação matriz: F

A-R

Y para a matriz 25; F

A-R

Z para série 26; F

BR

Y de matriz 27 e F

AR

Z para matriz 28. As alíquotas das amostras PAMP individuais também foram agrupados e rotulados para a hibridização matriz (array 29, a sua imagem matriz é mostrado na Figura 3B). Os resultados são apresentados com intensidade de sinal de relação (eixo dos Y) de amostras de Detroit 562 (mutante) e HEK293 (controlo) contra o local da sonda (eixo X). Os pontos de interrupção pode ser identificada através deste lote, encontrando os dois picos que são análogas às manchas verdes brilhantes na Figura 3B.

A fim de identificar mais precisamente a área de exclusão, nested PCR com pares de primers específicos foi projetado de acordo com os resultados anteriores PAMP. O produto de PCR foi marcado para hibridação matriz, obtendo-se um resultado muito semelhante ao mostrado na Figura 4 e é mostrado na Figura 5A. Além disso, o produto principal único das reacções de PCR foi resolvido por electroforese em gel de agarose, controlou, extraiu-se e sequenciado (Figura 5B). O ponto de interrupção clonado está de acordo com outros dois relatórios (Figura 5B) [37], [38].

Para mapear o ponto de interrupção exacto, um conjunto aninhado de iniciadores de PCR foram concebidos para PCR Uniplex baseado no PAMP anterior resultados (Figuras 3 e 4). Os produtos de PCR foram utilizados para a rotulagem e hibridado na matriz e também por electroforese em gel de agarose. A matriz de dados é mostrado como o mesmo lote na Figura 4. Uma banda principal única em gel de agarose foi excisada e purificada para sequenciação (B). O ponto de interrupção é indicada (de # 21.975.226 para o # 21960809 de acordo com NCBI seqüência do genoma humano construir 36).

Para imitar a população heterogênea de células cancerosas e de acolhimento normalmente encontrados em tumores sólidos, várias quantidades de genômica DNA derivado de Detroit 562 (mutante) e HEK293 (tipo selvagem) foram misturados para PAMP e hibridação array. A fim de testar a sensibilidade da nossa abordagem, foi realizada uma experiência de titulação. O ADN genómico total para cada ensaio foi mantida constante (100 ng). Isto é equivalente a cerca de 28.000 cópias de genoma haplóide (com base na estimativa de 2,8 × 10

5 moléculas /ug do genoma haplóide). O

CDKN2A

suprimido linha de células de Detroit 562 foi diluída em série com

CDKN2A

tipo selvagem HEK293 como mostrado na Tabela 1. O ensaio era capaz de detectar aproximadamente uma sequência de ponto de interrupção, na presença de um aproximadamente 2.000 vezes em excesso de genoma do tipo selvagem com a sensibilidade de tais moléculas 5-16 (Tabela 1). Assim, a abordagem PAMP proporciona um método para a detecção de deleções de ADN genómico na presença de ADN de tipo selvagem mais do que 99,9%.

A estratégia de clonagem PAMP ponto de interrupção foi confirmada em uma outra linha de células. Porque a nossa gama abrange apenas 25 kb do genoma, nós fizemos a varredura nossa informação mapeamento anterior em 100 linhas de células de encontrar um que pode ter pontos de interrupção dentro desta região [3], [33]. A linha de células do cancro da mama Hs578T tem uma deleção em p16

exons INK4a 1-3. Com iniciadores dentro e telomérica (F

A e R

X grupos, Tabela 2) para o fragmento genómico, realizou-PAMP e hibridação matriz, e identificado um único local na matriz (mostrado como um único pico na Figura 6A). A sequência desta sonda está localizado 69.971-71.219 na sequência RP11-149I2 BAC (GenBank AL449423 adesão). Portanto, o fim centromérica do ponto de interrupção deve ser localizado perto desta região. Uniplex PCR com iniciadores a partir dos dois grupos foi realizada para PAMP para sequenciação. Um produto de PCR de cerca de 2 kb foi gerado com um par de iniciadores e foi sujeito a sequenciação directa (Figura 6B). A extremidade centromérica do ponto de interrupção identificado por PAMP é consistente com um relatório anterior [37]. O fim telomérica do ponto de interrupção foi inferida a partir dos primers utilizados para PAMP e também confirmados por sequenciação directa, embora não houvesse nenhuma sonda genômica perto do ponto de interrupção que foi incluído na matriz

Dois grupos de primers:. F

a (F

A1-F

A4) e R

X (R

X1-R

X5) foram usadas para PAMP mapeamento baseadas na nossa anterior. O produto foi marcado para hibridação matriz (A). Apenas pico único é evidente a partir do enredo. Ele indica a localização do outro ponto de interrupção não é coberto por esta matriz minigenomic. Dois iniciadores (R

X3 e R

X4) localizada perto do local genómico da sonda (cromossomo humano 9, 21.969.229-21.970.477, NCBI construir 36) que foi cruzados e dois primers (F

A1 e F

A2) localizado fora da cobertura da matriz foram escolhidos para PCR Uniplex. A F

A2-R

par X3 deverá ter a distância mais curta quando ocorre uma deleção. Uma faixa de cerca de 2 kb no gel de agarose foi excisado a partir do gel, purificado e sequenciado (B). O ponto de interrupção e localização é indicada (de # 21.955.827 para o # 21968338 de acordo com NCBI seqüência do genoma humano construir 36).

Discussão

Nós desenvolvemos uma estratégia geral que pode ser aplicado para identificar os pontos de interrupção genômicas em cânceres primários não purificados. O protocolo de amplificação e azulejos descrito aqui permite a

CDKN2A

clonagem ponto de interrupção simples e precisa, utilizando DNA contaminado como um modelo. Em contraste com as atuais técnicas disponíveis para mapeamento de eliminação (incluindo transferência de Southern, fluorescente

in situ

hibridação, PCR em tempo real, e matriz CGH) que contam com a ausência de um sinal de tipo selvagem detectável, PAMP mede diretamente o ADN suprimido. Por conseguinte, esta abordagem é muito menos vulnerável a problemas associados com a contaminação de células normais. O procedimento experimental é suficientemente robusto para detectar deleções na presença de pelo menos 99,9% de contaminação sequência de tipo selvagem, que não podia ser alcançado através de outros procedimentos de [3], [5], [26], [27], [28], [33], [35], [39].

aproximação Primer PCR de triagem tem sido uma ferramenta útil para isolar mutantes de deleção em

C. elegans

[36]. O método baseia-se na identificação de uma única banda que é o produto de uma reacção de PCR bem sucedida quando um par de primers específicos é reunido por deleção, num gel de agarose. O procedimento só pode identificar exclusões que acontecem em um pequeno fragmento genómico (3 kb) de uma forma relativamente baixa taxa de transferência. Também sofre de relativamente elevada taxa de falsos positivos, porque a identidade das bandas no gel de agarose é difícil saber. No entanto, através da aplicação de PCR em multiplex em conjunto com uma matriz de ladrilhos genómico, pode-se pesquisar simultaneamente uma gama mais vasta de regiões genómicas [40]. Além disso, a amplificação preferencial das sequências perto dos pontos de corte gera uma leitura relativamente simples na matriz de ladrilhos. O sinal para a taxa de ruído nas manchas hibridadas é óbvia em comparação com a leitura da matriz CGH (ver Figura 4). A junção pode ser facilmente identificado, desde que uma das extremidades do local genómico nas proximidades dos pontos de ruptura é coberta pela matriz de ladrilhos, como demonstrado no caso de células de cancro da mama Hs578T (Figura 6). Uma vez que as matrizes de alta densidade da telha genómicos estão comercialmente disponíveis, esta abordagem pode ser facilmente adoptadas. Além disso, de alto rendimento a tecnologia de sequenciamento do genoma também podem identificar a sequência de ponto de interrupção exacto após PAMP, ignorando a necessidade de hibridação array [41], [42], [43].

Usamos PCR multiplex para reduzir o carga de trabalho e custo para PAMP. Fomos capazes de multiplex 28 primers facilmente em uma única reação de PCR. Teoricamente, pode-se cobrir mais de 90% dos 0,5 Mb de fragmento genómico torno de

CDKN2A

local com um total de 500 primers em uma reação de PCR única através de simulação computacional, que serão descritos em outra parte (manuscrito submetido). Um estudo recente relatou um PCR multiplex bem sucedido com mais de 1000 pares de primers com a ajuda de design computacional [44]. A abordagem PAMP metas tamanhos de exclusão entre 10 kb e 1 Mb. As delecções menores ou maiores podem ser detectadas por FISH e resequencing respectivamente.

Tal como outras tecnologias de PCR, PAMP pode ser facilmente adoptado para um sistema robótico para fins clínicos e de investigação. Um exemplo de um potencial de aplicação clínica é a utilização da sequência de ponto de interrupção única como um biomarcador específico do cancro personalizado para a monitorização da doença após o tratamento, quando o ponto de interrupção precisa foi mapeado. Por exemplo, ao contrário de muitos marcadores tumorais atuais, como CA19-9, CA125 e PSA, que não são verdadeiramente específicos de câncer, o

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breakpoints são específicos e únicos para cada cancro com esse locus excluído. Um ensaio altamente sensível, tal como PCR em tempo real, pode ser concebido para monitorizar o estado de progressão do cancro no sangue ou outros fluidos corporais. O ensaio deve ser muito específico, porque a amplificação está prevista para ocorrer apenas a partir de ADN contendo supressão devido à muito longa distância entre os iniciadores no genoma de tipo selvagem (ver Figura 2). Isto é análogo à detecção de uma sequência de vírus estrangeira, o que tem sido aplicada como um biomarcador útil para o vírus associado carcinoma nasofaríngeo de Epstein-Barr [45], [46].

A nossa abordagem pode também facilitar trabalhoso tradicional experiências intensas que visam compreender como pontos de interrupção genômica são gerados durante o desenvolvimento do câncer, especialmente em tumores primários. Embora ilegítima V (D) J recombinação pode ser responsável pela criação

CDKN2A

deleções em leucemia linfoblástica aguda, mais dados de sequência de ponto de interrupção serão necessárias para outros tipos de cancros para delinear os mecanismos moleculares [37], [38] [47], [48]. Além disso, a técnica descrita no presente documento pode ser utilizado não só para o mapeamento de eliminação, mas também pode ser aplicado para mapear outros tipos de rearranjo genómico, tais como translocações e inversões. Semelhante ao caso de eliminação genómica (ver Figura 2), apenas “aproximada” primers pode gerar produtos de amplificação quando esses primers estão perto dos fragmentos genômicos que são reposicionados em translocações e inversões.

Usando sequências de ponto de interrupção como específico do cancro biomarcadores para monitorar as doenças residuais mínimas tem sido explorado [49], [50], [51], [52], [53]. de controlo da doença com base no ponto de interrupção personalizado ADN genómico é considerado abordagem altamente atractiva para várias razões [49]. Em primeiro lugar, muitos rearranjos de DNA genómico estão diretamente relacionados ao processo oncogênico, portanto, são verdadeiramente específico do cancro e estável ao longo do tempo. Isto está em contraste com o ensaio baseado Ig /TCR rearranjo mais conveniente. De fato, encontramos exatamente o mesmo

CDKN2A

pontos de interrupção das duas linhas de células utilizadas neste estudo como relatado por outros. Em segundo lugar, o ADN é mais estável do que o ARN embora seja mais fácil para mapear transcrito de fusão, se ela existe, tal como o

BCR-ABL

. Em terceiro lugar, os pontos de interrupção genómicas são muito provável que seja diferente a partir de cada paciente e tornar-se biomarcadores personalizados, por conseguinte, reduzindo o risco de resultados falsos positivos devido à contaminação cruzada. No entanto, este é também o maior obstáculo a superar. Por exemplo, muitos esforços para melhorar a gama de amplificação de PCR para detectar

translocações C-MYC

/imunoglobulina tiveram sucesso limitado porque os pontos de interrupção estão espalhados por uma região mais de 300 kb [54], [55], [ ,,,0],56]. A nossa estratégia pode ser útil para essa aplicação.

A nossa abordagem visa identificar pontos de interrupção dentro de um fragmento genómico 1 Mb como peixes ou outras técnicas de citogenética estão disponíveis para rearranjos genômicos maiores e os custos e trabalho aumentar significativamente quando a região alvo se expande. Nós somos capazes de produzir uma matriz barata azulejos cobrindo um fragmento genômico de 0,5 Mb de todo o

CDKN2A

com resolução de 1 kb. Estamos atualmente trabalhando em métodos para aumentar a multiplexação e reduzir o volume de cada reação PAMP para aplicações mais amplas.

Materiais e Métodos

Cultura de células e preparação de amostra

As linhas celulares descrito no documento foram obtidos a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) e cultivadas como recomendado. O DNA genômico foi extraído com DNAzol (Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, OH) seguindo as instruções do fabricante.

array azulejos Minigenomic

Criamos um

INK4A

array azulejos minigenomic cobrindo um fragmento de 25 kb no

CDKN2A

locus para provar o conceito da nossa abordagem. As sondas de ADN foram gerados por PCR com RP11-149I2 clone de BAC (obtido a partir de BacPac Centro de Recursos do Instituto do Hospital Pediátrico de Oakland Research, Oakland, CA) como molde e as sequências genómicas evitando repetitivos que foram preditos por RepeatMasker. Os produtos de PCR foram purificados com o DNA Clean-up e Concentrador-5 (Zymo Research, Orange, CA), ressuspensas em 3 x SSC e impresso em lâminas de poli-L-lisina a 0,1 mg /ml, juntamente com a Human Cot-1 DNA ( Invitrogen, Carlsbad, CA), que é enriquecida para sequências repetitivas, e ADN de esperma de arenque (Promega, Madison, WI), que foi usado como controlo não específico. O procedimento de impressão tem sido descrito e essencialmente seguido o manual do arrayer DeRisi com pinos de impressão microcontact silício (Parallel Technologies Síntese, Inc. em Santa Clara, CA) [57], [58]. As matrizes foram pós-tratados com o método à base de anidrido succinico de bloqueio antes de hibridação como anteriormente descrito [57]. Os protocolos relacionados com a impressão de matriz e hibridação neste trabalho geralmente pode ser encontrado em microarrays.org (https://derisilab.ucsf.edu/microarray/protocols.html).

Primer-Aproximação Multiplex PCR (PAMP ) e matriz de hibridação

Um esquema PAMP simplificado é mostrado na Figura 2. Uma série de primers (Tabela 2) em direção a

INK4A

exons 1-2 ao longo do

CDKN2A

lócus foram sintetizados por Integrated DNA Technologies (Coralville, IA). Grupos de iniciadores directos e inversos (250 nM cada, no final da reacção) foram usadas para gerar produtos de amplificação a partir de 0,1 ug de modelos de ADN genómico em um total de 10 ul de solução de mistura com 10 ul de Taq 2 × Mistura Principal (New England Biolabs, Ipswich, MA). A reacção foi montado a 4 ° C numa estação de trabalho de PCR e transferida para um termociclador com o bloco de pré-aquecido a 94 ° C. As condições dos ciclos foram um passo de desnaturação de 3 minutos a 94 ° C seguido de 35 ciclos a 92 ° C durante 30 seg, 55 ° C durante 30 seg e 68 ° C durante 2,5 minutos com um passo de extensão final a 68 ° C durante 5 minutos. Um ul de produto não purificado foi subsequentemente utilizados como moldes para uma outra ronda de amplificação de etiquetar os produtos de amplificação com o mesmo protocolo de PCR, excepto que o dTTP foi substituído por uma mistura 04:01 de aminoallyl dUTP (Ambion, Austin, TX) e dTTP para rotulagem sonda . Os amplicons marcados foram purificados com o DNA Clean-up e Concentrador-5 colunas, eluído em 9 mL de bicarbonato de sódio (pH 9,0) e juntamente com 1 ml de DMSO dissolvidos ésteres Cy3 ou Cy5 NHS (GE Healthcare, Piscataway, NJ) para 30 para 60 minutos. O Cy3 e Cy5 marcado amplicões foram purificados com o DNA Clean-up e concentradores, de 5 colunas e eluídas com 10 ul de Tris-HCl a 10 (pH 8,0). Emparelhado com Cy3 e Cy5 marcado amplicões foram combinados com 3,6 mL de 20 × SSC, 0,5 ul de tampão Hepes (pH 7,0) e, finalmente, 0,5 ul de SDS a 10%. A solução mista foi aquecida durante 2 minutos a 95 ° C, arrefecida até à temperatura ambiente e hibridado com as matrizes de ladrilhos minigenomic a 63 ° C durante a noite, essencialmente como descrito anteriormente [57], [58]. As matrizes hibridizadas foram lavadas e digitalizada com scanner de GenePix 4000B (Dispositivo Molecular, Sunnyvale, CA) e analisados ​​pelo software GenePix Pro 6.0.

Tiling análise de dados de matriz

O Cot-1 DNA humano e ADN de esperma de arenque foram concebidos para serem controlos positivos e negativos, respectivamente, e manchou várias vezes sobre a matriz (ver Figura 3). Para normalizar as variações do dia-a-dia e de amostra-a-amostra, a intensidade média de todos os recursos que representam DNA de esperma de arenque (

I

50% -hs

) foram usadas para dividir a intensidade (

I

G

) de cada recurso representando sondas genômicas. Cada (

I

G

): (

I

50% -hs

) ratio, o sinal sonda genômica normalizada, foi plotada no eixo Y contra a sonda correspondente da localização genômica no eixo X para facilitar a interpretação dos dados (ver Figura 4).

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clonagem ponto de interrupção

para confirmar

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mapeamento ponto de interrupção, PAMP abordagem, os fragmentos genómicos flanqueando os pontos de quebra foram clonados por PCR tradicional abordagens guiada pelos resultados de PAMP. Dois exemplos são apresentados neste trabalho

linha de células de Detroit 562

:. A abordagem aninhada foi usado para clonar a

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ponto de interrupção em Detroit 562 células de carcinoma epitelial humanos. Os iniciadores foram concebidos com pistas a partir da experiência PAMP (ver Figuras 3 e 4). iniciadores externos (AGGTTTGGTTAAGAGTCGTTC e AAGATCTATATGGTGGCCTTTAG) foram usadas para 35 ciclos de PCR (92 ° C, 30 segundos; 55 ° C, 30 segundos; 68 ° C, 2 minutos).