Abstract

Evidências recentes sugerem que estaminais do cancro da próstata /células progenitoras (CSC) são responsáveis ​​pela iniciação cancro, bem como a progressão da doença . Infelizmente, as terapias convencionais só são eficazes em alvejar as células cancerosas mais diferenciados e poupar o CSCs. Aqui, nós relatamos que a PSP, um componente ativo extraído da cauda Turquia cogumelo (também conhecido como

Coriolus versicolor

), é eficaz na segmentação CSCs próstata. Nós descobrimos que o tratamento do cancro da próstata linha de células PC-3 com a PSP levou à infra-regulação de marcadores CSC (CD133 e CD44) em um tempo e modo dependente da dose. Enquanto isso, o tratamento PSP não só suprimiram a capacidade de células PC-3 para formar prostaspheres sob condições de cultura não aderentes, mas também inibiu a tumorigenicidade

In vivo

, provando ainda mais que a PSP pode suprimir próstata propriedades CSC. Para investigar se o efeito anti-CSC de PSP pode levar à quimioprevenção do cancro da próstata, os ratinhos transgénicos (TgMAP) que desenvolvem espontaneamente tumores na próstata foram alimentados por via oral com a PSP durante 20 semanas. Considerando que 100% dos ratinhos que se alimentaram com água apenas desenvolveram tumores da próstata no final da experiência, os tumores não podia ser encontrada em qualquer um dos ratos alimentados com a PSP, sugerindo que o tratamento PSP pode inibir completamente a formação de tumor da próstata. Os nossos resultados não só demonstrou o efeito anti-CSC intrigante da PSP, mas revelou também, pela primeira vez, a propriedade quimiopreventiva surpreendente de consumo PSP oral contra o cancro da próstata

citação:. Luk SU, Lee W-TK , Liu J., Lee DT-W, Chiu YT, Ma S, et al. (2011) quimiopreventivo Efeito da PSP através da segmentação do câncer de próstata Stem Cell-Like População. PLoS ONE 6 (5): e19804. doi: 10.1371 /journal.pone.0019804

editor: Kelvin Yuen Kwong Chan, Tsan Yuk Hospital, Autoridade Hospital, China

Recebido: 23 de dezembro de 2010; Aceito: 16 de abril de 2011; Publicado em: 16 de maio de 2011

Direitos de autor: © 2011 Lucas et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Vice-Chanceler bolsa de Investigação. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata (PCA) é o tumor maligno do sexo masculino mais comum nos países ocidentais e representa um fardo de doenças mais importantes do mundo. Quando diagnosticado em um estágio avançado em que a cirurgia já não é viável é, o único tratamento de primeira linha disponível é terapia de ablação hormonal. Infelizmente, a maioria dos pacientes com CaP, eventualmente recaída e desenvolver hormona refractário CaP (HRPC), um terminal de fase fatal e considerado como incurável [1].

quimioprevenção é uma estratégia ideal para combater o cancro da próstata, e um número de agentes quimioterápicos ou suplementos alimentares naturais estão sendo testados atualmente por seu potencial de inibir o desenvolvimento de câncer de próstata. Por exemplo, finasterida, um inibidor específico da 5-alfa redutase, foi mostrado para reduzir a incidência de cancro da próstata em 25% num ensaio clínico [2]. Da mesma forma, dutasterida, um análogo de finasterida, foi também relatada para inibir significativamente o desenvolvimento do cancro da próstata [3]. Apesar dos resultados promissores, os efeitos colaterais associados com o tratamento com finasteride continua a ser a principal preocupação para que possa ser amplamente utilizado para a quimioprevenção de próstata. Portanto, compostos bioactivos, tais como alimentos de epigalocatequina-3-galato ou resveratrol [4], [5], [6] representa uma alternativa atraente para a quimioprevenção do cancro da próstata, principalmente devido à sua toxicidade relativamente baixa. Infelizmente, a maioria dos estudos anteriores produziram resultados inconclusivos quanto ao seu potencial quimiopreventivo.

recente identificação de células-tronco do câncer de próstata (CSCs) [7] tem proporcionado uma nova visão sobre a carcinogênese de próstata. A capacidade destas células estaminais cancro de auto-renovação e diferenciação em células cancerosas em massa sugerido que eles podem ser a origem do cancro da próstata [7]. Além disso, a natureza altamente resistente destas CSCs para diferentes quimioterapias sugeriu que CSCs também podem contribuir para o insucesso do tratamento e de recidiva da doença [8]. Curiosamente, um número de compostos alimentares bioactivas têm sido recentemente demonstrado ter efeito anti-CSC. Por exemplo, demonstramos recentemente que a gama-tocotrienol extraída a partir de óleo de palma inibe prostasphere capacidade de formação e a tumorigenicidade de células de cancro da próstata [9], sugerindo que a gama-tocotrienol é eficaz na supressão da próstata propriedades CSC. Além disso, um triterpeno extraído de frutas foi também encontrada para inibir a capacidade de auto-renovação das CSCs fígado e sensibilizar o tumor do fígado para o tratamento com cisplatina [10]. Estes resultados destacam o potencial dos compostos alimentares bioativos como CSC agente de alvo quer para a prevenção ou para o tratamento de câncer de próstata.

Aqui, nós demonstramos que a polysaccharopeptide (PSP) extraído da cauda Turquia (conhecido como

Coriolus versicolor

ou Yun-zhi) tem como alvo CSCs próstata in vitro e suprime a formação do tumor in vivo. O tratamento do cancro da próstata linha de células PC-3 com a PSP levou à infra-regulação de marcadores CSC (CD133 e CD44) em um tempo e modo dependente da dose. Enquanto isso, a formação de prostasphere, uma importante propriedade das CSCs próstata, foi completamente suprimida em células PC-3, na presença de PSP. Além disso, a PSP de pré-tratamento suprimiu significativamente a iniciação do tumor de células de PC-3 em ratinhos imunocomprometidos, sugerindo que PSP inibe a tumorigenicidade das células PC-3. Mais importante ainda, a alimentação oral de ratinhos transgénicos (TgMAP) que desenvolvem espontaneamente tumor da próstata com PSP foi encontrado para inibir completamente a formação de tumor da próstata. Nossos achados mostram que a PSP pode ser um agente quimiopreventivo potente contra o câncer de próstata, possivelmente através de segmentação da próstata população CSC.

Resultados

Efeitos da PSP na expressão do marcador CSC

PSP tem mostrado anteriormente por possuir propriedades anti-câncer [11], [12], [13], embora os mecanismos subjacentes ainda não estão claros. Para testar se o efeito anti-cancro de PSP é através da segmentação das propriedades CSC, primeiro investigado se o tratamento PSP afecta a expressão dos marcadores da próstata CSC na linha de células PC-3, que tem sido relatado para conter CSCs. Células PC-3 foram tratados com 250 e 500 ng /ml de PSP para 48 ou 72 horas, e a expressão de marcadores, tais como CSC CD133 ou de CD44 foi analisada por Western blotting. Como mostrado na Figura 1B, a expressão de proteínas de CD133 foi significativamente regulada para baixo após o tratamento de PSP num momento e de modo dependente da dose. Também foi observada a regulação negativa de CD44 após o tratamento PSP, embora o efeito foi menos evidente. No entanto, o exame do nível de ARNm de tanto CD133 e CD44 revelou que a infra-regulação de ambas as proteínas de PSP não é devido à inibição da transcrição de genes (dados não mostrados). No entanto, estes dados sugerem que a PSP pode ser eficaz na segmentação dos CSCs próstata putativos.

A) Western blot de próstata CSC marcadores CD44 e CD133 no PC-3 células após o tratamento PSP. Note-se que a PSP significativamente sub-regula tanto marcadores de células em uma dose e modo dependente do tempo haste. B) Viabilidade de células PC-3 após o tratamento com 5, 25, 125, 250 e 500 ug /ml de PSP para 48 ou 72 horas foi medida com o ensaio MTT. Os resultados são apresentados como a média ± S.D. C) Análise de citometria de fluxo de células PC-3 após o tratamento com 250 ug /ml de PSP, durante 72 h. Note-se que não se observou qualquer diferença significativa na distribuição de ciclo celular. D) Resultados Western Blotting para marcadores de apoptose (painel esquerdo) e da haste proteínas de manutenção de células (painel da direita) em células PC-3 após o tratamento PSP. Note-se que não há mudanças em Bax e Bcl-2 ou a clivagem de PARP foram detectadas.

Para testar se a regulação negativa da expressão do marcador por CSC PSP é devido a uma diminuição da viabilidade celular, PC- 3 células tratadas com PSP em diferentes doses (0, 5, 25, 125, 250 e 500 ug /ml) durante 24, 48 ou 72 h, foram examinados por ensaio MTT. Curiosamente, 48 h de tratamento PSP não têm quaisquer efeitos observáveis ​​sobre a viabilidade celular, mesmo que os mesmos tratamentos foi encontrada para suprimir significativamente a expressão de marcadores CSC (Figura 1B 1C). Enquanto isso, o tratamento PSP também não conseguiu induzir a paragem do ciclo celular ou a apoptose, tal como evidenciado pela falta da população sub-G1 no resultado da análise de citometria de fluxo (Figura 1D). Este foi ainda confirmada por análise de proteínas associadas a apoptose (isto é, Bax, Bcl-2 e de PARP clivada) (Figura 1E). No entanto, a via /β-catenina Akt, que é responsável para o enriquecimento das CSCs no cancro da mama, foi drasticamente inibida pelo tratamento com PSP. Tal como mostrado na Figura 1D, a activação de Akt por fosforilação de Ser 473 foi inibida por PSP com ambas as doses, que foi acompanhada pelo desaparecimento completo de expressão β-catenina (Figura 1E).

PSP inibe a formação de prostasphere próstata células de cancro, sob condições de cultura não aderentes

a capacidade de formar prostaspheres em cultura não aderente é uma das características das CSCs próstata [14], [15], [16]. Para confirmar que o tratamento PSP pode inibir próstata propriedades CSC, prostasphere formação de PC-3 foi estudada na presença ou ausência de PSP. Como mostrado na Figura 2A, a cultura de ambas as células PC-3 e DU145, durante 14 dias, sob condições não-aderente resultados formação de prostaspheres, confirmando ainda mais a presença de uma população de haste-como dentro de ambas as linhas celulares. Surpreendentemente, a adição de PSP para o meio inibiu drasticamente prostasphere formação em ambas as linhas celulares. Em particular, não há prostaspheres foi encontrada em qualquer uma das linhas de células na presença de 500 mg /ml de PSP, sugerindo que o tratamento PSP eliminado significativamente os CSCs próstata. Para além disso, que provou PSP é eficaz na inibição da formação prostasphere, prostaspheres primárias com CSC população enriquecida foram dissociadas e re-semeadas em condição de cultura não-aderente para permitir a formação de prostaspheres secundárias. Consistente com o resultado do ensaio de formação de esferóides primária, tratamentos PSP suprimir significativamente o número de prostaspheres encontrados em cada linha celular, embora a dosagem mais elevada de PSP (500 mg /ml) foi incapaz de eliminar completamente todos os prostaspheres secundárias. No entanto, estes resultados sugerem que a PSP é eficaz na supressão das propriedades CSC de células cancerosas da próstata.

A) ensaio de formação de esferóides foram realizados com células DU145 PC-3 e. Duzentos de células foram semeadas em poliHEMA placas pré-revestidas e tratadas com 500 ug /mL de PSP ou veículo durante 14 dias. O número de prostaspheres formados foi contado, e o resultado foi apresentado como a média ± S.D. Note-se que o tratamento γ-T3 eficientemente suprime a capacidade de formação de esferóides de células PC-3. Imagem dos prostaspheres foi capturado sob o microscópio. Note-se que não há prostaspheres pode ser encontrado em células tratadas com 500 ug /mL de PSP. (B) PSP inibiu a formação de prostaspheres secundárias. prostaspheres primários foram dissociadas e re-semeadas em placa poliHEMA pré-revestidos. PSP foi adicionado 24 horas após o plaqueamento. Note-se que a formação de prostasphere foi inibida em mais de 70% e 90% na presença de 250 ug /mL e 500 ug /mL de PSP respectivamente. *

P Art 0,001, **

P

. 0,0001,

t

teste

PSP reduz significativamente a tumorigenicidade de próstata células cancerosas

in vivo

Desde CSC é responsável pela iniciação do câncer, é possível que o tratamento PSP pode inibir a capacidade formação de tumor de células PC-3 in vivo. Para testar esta hipótese, foram primeiro tratados células PC-3 que expressam de forma estável a proteína da luciferase (PC-3-Luc) com PSP, durante 72 h antes de injectada ortotopicamente-los em murganhos SCID. Tal como examinado por imagem de bioluminescência, todos os ratinhos que foram injectados com células PC-3-luc tratados de veículo pré-formado tumores duas semanas após a implantação (Figura 3A). Curiosamente, três dos oito ratos que foram injectados com células PC-3-luc PSP pré-tratados não desenvolveram tumores, mesmo na semana quatro pós-implantação (Figura 3A B). A falta de tumores no grupo de PSP-pré-tratado foi ainda confirmada por análise das glândulas prostáticas do rato no final da experiência (Figura 3C). Tomados em conjunto, os nossos resultados sugerem que a PSP era eficaz em reduzir o potencial tumorigénico de células de cancro da próstata, o que é uma característica essencial das CSCs.

A) bioluminescentes imagens de ratinhos SCID injectados ortotopicamente com células PC-3-Luc por duas semanas. ratinhos SCID na fileira superior foram injectados com células PC-3-luc tratados com o veículo, enquanto que os ratinhos na fila inferior foram injectados com células PC-3-Luc-tratados PSP. B) Tabela resume as percentagens de ratinhos desenvolveram tumores detectáveis ​​na semana 2. Cerca de 40% dos ratinhos no grupo pré-tratado PSP não formam tumores detectáveis, enquanto que a formação do tumor foi de 100% encontrado no grupo de controlo (p = 0,07). C) Selecionado

ex vivo

imagens da próstata de ambos os grupos. Note-se que na PSP-ratinhos tratados com sinal de luciferase negativo, nenhum tumor visível foram encontrados no tecido da próstata.

A administração oral de PSP não consegue inibir prostáticas neoplasia intra-epitelial desenvolvimento (PIN) em camundongos TgMAP

o efeito de PSP no próstata CSCs suporta a hipótese de que ele pode ter um efeito quimiopreventivo contra o cancro da próstata. Para testar esta hipótese, foram utilizados um modelo de ratinho transgénico que se desenvolve espontaneamente, adenocarcinoma da próstata (TgMAP) [17], [18]. Os ratos TgMAP desenvolver PIN entre 16-20 semanas de idade e progresso para adenocarcinoma de próstata após a semana 24 (Figura 4A). Porque PIN é considerado como a lesão pré-maligna e o fator de risco mais importante de câncer de próstata [19], primeiro testado se a administração PSP interferir no desenvolvimento do PIN em camundongos TgMAP. Cinco ratinhos TgMAP (14 semanas de idade, pelo menos 2 semanas antes do desenvolvimento de PIN) foram alimentados com 200 mg /kg de PSP durante 4 semanas. Quatro ratinhos da mesma idade foram alimentados com água apenas para o mesmo período de tempo. Todos os ratinhos foram sacrificados em 20 semanas de idade tecidos e prostáticas foram recolhidas e seccionados para análise histológica. Como mostrado na Figura 4B C, não foram observadas diferenças entre o controlo e os ratos tratados com TgMAP PSP respeito à anatomia bruta e a histologia da próstata. Na ampliação baixa de potência, as secções de tecido de ambos os grupos retido estruturas glandulares, e ao elevado poder, PIN foi detectável tanto no controlo e murganhos tratados com PSP. Estes resultados sugerem que 4 semanas de consumo PSP foi incapaz de parar o desenvolvimento de PIN.

A) Prazo do PIN e desenvolvimento CaP em camundongos TgMAP eo cronograma do tratamento PSP. Catorze ratinhos velhos TgMAP-semana foram tratados com 200 mg /kg de PSP alimentação por sonda oral durante 4 semanas e sacrificaram-se no momento em que se desenvolveu PIN (20 semanas de idade). A tabela resume os resultados do exame histológico da próstata a partir do com veículo e ratos tratados com TgMAP PSP. C) fotos representativas de Hematoxilina Eosina dos tecidos prostáticos dos ratinhos TgMAP. Note-se que ambos os ratos TgMAP Control e PSP-tratados desenvolveram neoplasia intraepitelial prostática (PIN), como indicado pelas setas.

Prolongar o consumo de PSP inibe o desenvolvimento de câncer de próstata em ratos TgMAP

a incapacidade de inibir a formação de PIN por tratamento PSP pode devido a dose insuficiente ou a duração do tratamento. Nós portanto testado se uma dose mais elevada e mais longo período de consumo de PSP pode afectar a formação de tumor da próstata usando o mesmo modelo. Cinco ratinhos TgMAP (8-semanas de idade) foram alimentados com 300 mg /kg de PSP para um total de 20 semanas (Figura 5A). Quatro ratinhos com a mesma idade foram novamente alimentadas com água apenas para o mesmo período de tempo. Todos os ratinhos foram sacrificados às 28 semanas de idade, quando os tumores de próstata foram formados, com os tecidos prostáticos recolhidos e seccionados para análise histológica. Como mostrado na Figura 5B, os tumores foram encontrados em diferentes secções da glândula da próstata a partir de todos os ratos que foram alimentados com apenas água. Surpreendentemente, o exame de todos da secção da próstata revelaram que nenhum dos ratinhos que foram alimentados com a PSP nu quaisquer tumores da próstata (Figura 5C), sugerindo que o tratamento PSP formação de tumor da próstata completamente inibida nos ratinhos TgMAP. Enquanto isso, ao passo que três dos ratinhos PSP-alimentados foram encontrados a ter PIN, os outros dois ratinhos foram encontrados a ter próstatas completamente normais (Figura 5D). Além disso, consistente com a baixa toxicidade da PSP, o consumo a longo prazo parece ter nenhum efeito secundário sobre os ratos, tal como avaliado pelas alterações do peso corporal e sinais físicos (dados não apresentados) (Figura 5E). Estes resultados sugerem fortemente que a ingestão oral de PSP pode ser um agente quimiopreventivo segura e eficaz contra o câncer de próstata.

A) esboço do cronograma para o tratamento PSP. TgMAP ratos velhos de oito semanas foram tratados com 300 mg /kg de PSP alimentação por sonda oral, durante 20 semanas e sacrificaram-se na idade de 28 semanas. B C) fotos representativas de Hematoxilina Eosina dos tecidos da próstata a partir do veículo e ratos tratados com TgMAP PSP. Note-se que os tumores foram encontrados em todos os ratinhos que foram tratados apenas com veículo, mas estavam ausentes em todos os ratinhos tratados com PSP. D) A tabela resume os resultados do exame histológico dos tecidos da próstata a partir do veículo e ratos tratados com TgMAP PSP. * P 0,05 em comparação ao tratamento controle pelo teste exato de Fisher. E) O peso médio do corpo dos ratos durante o tratamento PSP.

Discussão

PSP foi previamente demonstrado para induzir apoptose e inibir o crescimento de uma ampla gama de células cancerosas, que inclui mama [20], [21], [22], fígado [23] e câncer de próstata [24], embora os mecanismos subjacentes seus efeitos anti-câncer continuam a ser mal compreendido. Aqui, demonstramos pela primeira vez que a PSP tem efeitos anti-CSC, como evidenciado pela regulação negativa de marcadores CSC e a supressão da formação de tumor e prostasphere.

próstata CSCs foram inicialmente identificados por Collins et ai. em 2005 usando CD44 + /alpha2beta1hi /CD133 + como os marcadores de superfície celular [25]. Utilizando abordagens semelhantes, CSCs também foram identificados em linhas de células de cancro da próstata tais como LNCaP [26], DU145 [26], [27] e PC-3 [28], [29]. Estes CSCs próstata não só expressam elevado nível de CD133 e CD44, mas também são altamente tumorigénicas quando comparadas com a população não-CSC. O facto de PSP pode suprimir significativamente a expressão de CD44 e CD133 ambos, bem como a tumorigenicidade de células PC-3, indicam claramente a eficácia da PSP no direccionamento CSCs próstata. Como demonstrado por Hsieh et ai [24], PSP é eficaz na indução de apoptose e inibição da proliferação celular em células LNCaP. No entanto, o seu efeito foi menos proeminente tanto em linhas de células independentes de androgénio, tais como cancro da próstata PC-3. Este é de facto consistente com a nossa descoberta, que mostrou que a PSP pode suprimir propriedades CSC sem induzir qualquer paragem do ciclo celular ou apoptose detectável. No entanto, a descoberta de que ambos fosforilação de Akt e expressão β-catenina também foram regulados negativamente por PSP (Figura 1E) sugere que a PSP pode actuar através da inactivação da via /Akt /β-catenina Pten para inibir a renovação CSC. Esta via de manutenção de células estaminais recentemente identificado foi mostrado desempenhar um papel chave na regulação da próstata e populações de células estaminais mamárias [16], [30]. activação aberrante da via /β-catenina Akt através do knockdown de Pten foi encontrado para enriquecer a população de células estaminais da mama, levando à indução de lesões hiperplásicas no rato [30]. Da mesma forma, knockdown de Pten em células de cancro da próstata também foi encontrada para melhorar a capacidade prostasphere formação e a tumorigenicidade das células [16]. Portanto, a perda de “stemness” de CSCs próstata após o tratamento de PSP pode ser devido à regulação negativa da via Pten /AKT /β-catenina.

Uma das propriedades principais de células estaminais é a sua capacidade para formar esferas em condições de não-aderentes, sem soro [31]. De facto, ensaios de formação de esferóides têm recentemente sido usada para identificar e para enriquecer CSCs putativos [16], [32], [33], [34]. Consistente com os estudos anteriores, ambas as linhas de células de cancro da próstata PC-3 e DU145 foram capazes de formar prostaspheres em cultura não aderentes [16], o que sugere a presença de CSCs dentro destas linhas celulares. Estes prostaspheres primárias, que são resistentes a drogas quimioterapêuticas [9], são altamente sensíveis ao tratamento PSP (Figura 2A). Além disso, os prostaspheres secundárias foram significativamente inibida de um modo dependente da dose (Figura 2B), apoiando PSP que é eficaz na eliminação da próstata CSCs

in vitro

.

próstata CSCs se acredita ser origem de tumor da próstata, que têm a capacidade de auto-renovação e diferenciação em massa do tumor [35]. O facto de que o pré-tratamento de PSP pode inibir significativamente a tumorigenicidade de células PC-3 (Figura 3), não só realça o efeito de anti-PSP CSC, mas também sugere que a PSP pode ter efeitos quimiopreventivos contra o cancro da próstata. Testamos essa hipótese usando um modelo desenvolvido recentemente rato transgénico de câncer de próstata (TgMAP) [17], [18]. O desenvolvimento gradual do tumor da próstata (de baixo PIN grau de tumor bruto) na TgMAP rato altamente imita a patogênese do câncer de próstata humana, embora possa não reflectem totalmente a natureza complexa da carcinogênese de próstata. No entanto, ele permitiu-nos desenvolver uma dosagem de tratamento e prazo ideal PSP. Considerando que quatro semanas de PSP consumo oral de 200 mg /kg não conseguiu produzir quaisquer diferenças no desenvolvimento de PIN, a inibição completa da formação de tumor da próstata foi alcançada após 20 semanas de PSP bucal alimentação com 300 mg /kg. Entretanto, a supressão da formação de PIN pela PSP ainda sugeriu que o efeito quimiopreventivo de PSP pode ser devido à supressão da iniciação do tumor na fase inicial. A toxicidade extremamente baixa eo efeito altamente potente anti-CSC de mandados PSP posterior avaliação do seu efeito quimiopreventivo em ensaios clínicos humanos.

Em resumo, temos demonstrado, pela primeira vez, que o tratamento PSP não só inibe Propriedades CSC, mas também suprime eficazmente a formação de tumores de próstata. Nossos resultados sugerem que PSP pode ser um agente eficaz para quimioprevenção do câncer de próstata.

Materiais e Métodos

Polysaccharopeptide (PSP)

PSP extraído de Yun-zhi foi gentilmente cedido pela pergunto erva Health Products, Ltd. O pó PSP foi dissolvido em água Milli Q autoclavada a uma concentração de 30 mg /ml por mistura num rotor a 4 ° C durante a noite. A solução PSP foi armazenado a 4 ° C. Para o estudo de cultura de células, da PSP foi esterilizado com filtração de 0,2 um antes da utilização. No estudo animal, PSP foi alimentado directamente para ratinhos.

linhas de células e condições de cultura

linhas celulares de cancro da próstata PC-3 e DU145 (ATCC, Rockville, MD) foram mantidas em meio RPMI 1640 médio (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado com 1% (w /v) de penicilina-estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA) e 5% de soro fetal de bovino (Invitrogen, Carlsbad, CA). Todas as linhas celulares foram mantidas a 37 ° C em 5% de CO

2 ambiente. Luciferase-expressando linha de células PC-3 foi gerado em nosso estudo anterior.

TgMAP modelo de tumor de próstata

TgMAP C57 /BL6 camundongos na semana 8 e 14 foram administrados com PSP em 200 mg /kg durante 4 semanas (n = 5) ou 300 mg /kg durante 20 semanas (n = 5), respectivamente, que alimentam por sonda oral (5 dias por semana). grupo de controle foram alimentados com água apenas para o mesmo período de tempo. Os ratinhos foram sacrificados (com a idade de 20 semanas para 200 mg grupo de tratamento /kg e 28 semanas para os 300 mg kg /grupo de tratamento) e de próstata tecidos foram recolhidos, fixados em formalina a 10% e embebidos em parafina. Toda a próstata foi cortada em secções de 4 | iM e uma em cada cinco secções consecutivas foi corado com H E. histologia foi realizada pelo Dr. K. W. Chan (patologista, HKU). diferença estatística foi determinada pelo teste exato de Fisher e foi considerado significativo se p 0,05. ética animal foi aprovado pela Comissão do uso de animais vivos para Ensino e Pesquisa (CULATR) com a aprovação não. de 1694-1608. Todos os procedimentos de manuseio de animais foram realizados de acordo com as orientações da Comissão sobre o Uso de Animais Vivos em Ensino e Pesquisa (CULATR), The University of Hong Kong.

Spheroid ensaio de formação de

A ensaio de formação de esferóide foi modificado a partir de um protocolo previamente relatada [36]. Resumidamente, as células de CaP (200 células por linha) foram semeadas em 12 cavidades poliHEMA (Sigma) -Revestido placas. As células foram cultivadas em meio DMEM /F12 (Invitrogen, Carlsbad, CA) durante 14 dias suplementadas com 4 ug /ml de insulina (Sigma), B27 (Invitrogen), 20 ng /ml de EGF (Sigma) e 20 ng /mL de FGF básico (Invitrogen) com PSP em cada 250 ug /mL e 500 ug /mL. Por passagem seriada de esferas primárias, as primeiras esferas foram tratadas com o PSP para as doses acima durante 72 h e subsequentemente recolhido, dissociadas com tripsina, e ressuspensas em meio de DMEM /F12 com os suplementos acima. Cada experiência foi repetida em triplicado, e cada ponto de dados representa a média e o desvio-padrão. diferença estatística foi determinada por estudante do

t

-teste e foi considerado significativo se p . 0,05

A viabilidade celular ensaio

A viabilidade celular após tratamento PSP foi medido por um 3 – (4,5-dimetil tiazol-2-il) brometo de tetrazólio (MTT) -2,5-difenil como descrito anteriormente [37]. Resumidamente, as células foram semeadas em placas de 96 poços e tratadas com diferentes concentrações de PSP durante o tempo indicado. No final do tratamento, o MTT (Sigma, St. Louis, MO) foi adicionado a cada poço e os poços foram incubados durante 4 horas à temperatura ambiente. DMSO foi então adicionado a cada poço para dissolver os cristais de formazano. A placa foi incubada durante mais 5 min à temperatura ambiente, e a densidade óptica (OD) foi medida a um comprimento de onda de 570 nm num leitor de microplacas de exploração múltipla Labsystem (Merck Eurolab, Dietikon, Suíça). Todos os poços individuais foram analisadas em triplicado. A percentagem de viabilidade celular foi apresentada como a razão OD entre as células tratadas e não tratadas com as concentrações indicadas.

Blotting

procedimentos experimentais detalhados ocidentais foram descritos anteriormente [37]. Resumidamente, as células foram lisadas com tampão RIPA (Tris-HCl 50 mM pH 8,0, NaCl 150 mM, ácido desoxicólico 0,5%, 1% de NP-40, 0,1% de SDS) com inibidores de protease (1 mg /ml de aprotinina, 1 mg /ml leupeptina, PMSF 1 mM) e as concentrações de proteína foram determinadas usando um D

C Kit de ensaio de proteína (Bio-Rad, Hercules, CA). As proteínas foram resolvidas em SDS-gel de poliacrilamida por electroforese e depois transferido para uma membrana Hybond-P PVDF (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). As membranas foram bloqueadas por leite em pó 10% não gordo no leite seco a 3% sem gordura TBS-T ou em TBS e incubadas com anticorpos primários à temperatura ambiente contra Akt (Ser 473), Bcl-2, a sinalização de PARP (celular, Technology Inc, Beverly, MA), CD133 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA), CD44, β-catenina e β-actina (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) durante 1 h à temperatura ambiente. Após a lavagem com TBS-T, a membrana foi incubada com anticorpos secundários IgG anti-ratinho, quer ou anti-coelho, e os sinais foram visualizados utilizando o sistema de ECL mais transferência de Western (Amersham, Piscataway, NJ).

ciclo celular análise

As células foram fixadas com 1 mL de gelo frio de 70% de etanol a 4 ° C. Após a fixação, os sedimentos celulares foram recolhidos por centrifugação, ressuspensas em 500 ul de PBS, e depois incubado a 4 ° C de um dia antes da realização de citometria de fluxo. No dia seguinte, as células foram coradas com iodeto de propídio (50 ug /mL) e RNase (1 ug /ml) durante 30 min. análise do ciclo celular foi efectuada num citómetro de fluxo EPICS analisador de perfil e analisados ​​utilizando o software ModFit LT2.0 (Coulter, Miami, FL).

implante ortotópico de células PC-3-luc

o modelo ortotópico foi estabelecida com os procedimentos descritos anteriormente [38]. Resumidamente, foram anestesiados com oito semanas de idade CB-17 SCID e colocada sob um microscópio de dissecação. Uma incisão na linha média do abdómen foi feita, expor a próstata dorsal, na base da bexiga. Quantidades iguais de células PC3-Luc viáveis ​​(2,5 × 10

4) com ou sem tratamento prévio PSP foram injectadas as próstatas dorsais dos ratinhos. Os órgãos foram substituídos, e do abdómen foi fechado. O desenvolvimento do tumor foi monitorizado medindo o sinal bioluminescente a cada duas semanas, durante seis semanas após a implantação do tumor. Os ratinhos foram sacrificados no fim da experiência os tecidos da próstata e foram recolhidas para exame físico. diferença estatística foi determinada por um bicaudal

t

-teste e foi considerado significativo se p 0,05. Todos os procedimentos de manipulação cirúrgica e animais foram realizados de acordo com as orientações da Comissão sobre o Uso de Animais Vivos em Ensino e Pesquisa (CULATR), The University of Hong Kong.