Abstract

avaliação terapêutica pré-clínica atualmente conta com a resposta de crescimento das linhas de células humanas estabelecidas xenoenxerto em ratinhos imunocomprometidos, uma estratégia que geralmente não é preditiva de resultados clínicos. Imunocompetentes camundongo geneticamente modificado (GEM) modelos de aloenxerto tumor -derived oferecer alternativas pré-clínicos altamente tratáveis ​​e facilitar a análise dos agentes imunomoduladores clinicamente promissores. representável repórteres são essenciais para rastrear de forma precisa o crescimento do tumor e da resposta, em particular para metástases. Infelizmente, os repórteres, tais como luciferase e GFP são antígenos estranhos em camundongos imunocompetentes, potencialmente prejudicar o crescimento do tumor e respostas terapêuticas de confusão. Aqui nós avaliamos o valor das gemas tolerantes-repórter como receptores de aloenxertos, visando expressão mínima de um repórter de fusão luciferase-GFP para a glândula pituitária anterior (apelidado de “Glowing Head” ou GH mouse). O repórter de luciferase-GFP expressa em células tumorais induzidas respostas imunes adversas no rato de tipo selvagem, mas não em GH de rato, como hospedeiros de transplantação. A antigenicidade de indicadores ópticos, resultou numa diminuição, tanto no crescimento e potencial metastático do tumor em murganhos de tipo selvagem marcado em comparação com os ratinhos de GH. Além disso, a expressão repórter também pode alterar a resposta do tumor à quimioterapia ou terapia-alvo de uma forma dependente do contexto. Assim, os ratos GH e abordagens experimentais controlados aqui fornecer validação conceito e uma estratégia para a avaliação pré-clínica eficaz, reprodutível de crescimento e de resposta cinética para tumores rastreáveis ​​

Citation:. Day CP, Carter J, Ohler ZW, Bonomi C, El Meskini R, Martin P, et al. (2014) “Glowing Head” Mice: Uma ferramenta genética Activar pré-clínica Imagem-Based avaliação confiável de câncer em imunocompetentes aloenxertos. PLoS ONE 9 (11): e109956. doi: 10.1371 /journal.pone.0109956

editor: Devanand Sarkar, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos da América

Recebido: 29 Abril, 2014; Aceito: 09 de setembro de 2014; Publicação: 04 de novembro de 2014

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Data Availability:. Os autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este projecto foi financiado no todo ou em parte, com fundos federais do National Cancer Institute, National Institutes of Health, nos termos do Contrato nº HHSN261200800001E . Este trabalho foi financiado em parte pelo Programa Therapeutics Desenvolvimento da Divisão de Câncer Tratamento e Diagnóstico e Intramural Research Program do Centro de Pesquisa do Câncer, NCI, NIH. Leidos Biomedical Research Inc. forneceu apoio sob a forma de salários para os autores John Carter, Zoe Weaver-Ohler, Carrie Bonomi, Rajaa El Meskini, Philip Martin, Cari Graff-cereja, e Lionel Feigenbaum, mas não tinha nenhum papel adicional na desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Os papéis específicos destes autores são articuladas na seção “autor contribuições ‘

Conflito de interesses:. Os co-autores John Carter, Zoe Weaver-Ohler, Carrie Bonomi, Rajaa El Meskini, Philip Martin, Cari Graff-cereja e Lionel Feigenbaum são empregados por Leidos Biomedical Research Inc. Leidos Biomedical Research Inc., é dedicado a um único contrato para operar o Laboratório Frederick Nacional para Pesquisa do Câncer (FNLCR), um federal financiado Investigação e Desenvolvimento Center. Ele não está envolvido em nenhum emprego, consultoria, patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados etc. relacionados a este estudo. Isto não altera a adesão dos autores para PLOS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

A droga média desenvolvido por grandes empresas farmacêuticas foi estimado para custar entre 4 e 11 bilhões de dólares [1], custando ao paciente de câncer de aproximadamente US $ 100.000 por ano. Estes custos elevados são impulsionados em parte pela incapacidade no início do gasoduto de desenvolvimento para identificar com segurança as drogas que serão eficazes, ea taxa de aprovação geral para um composto oncológico é atualmente cerca de 5% [2]. Grande parte dessa falha pode ser atribuída à inadequação dos modelos pré-clínicos usados ​​na avaliação terapêutica. linhas Historicamente, os estudos em animais pré-clínicos têm utilizado décadas de idade estabelecidos humanos celulares, transplantados como xenoenxertos subcutaneamente em ratinhos imunocomprometidos [3]. Infelizmente, estes modelos tiveram valor eficácia preditivo limitado para o desenvolvimento de drogas, mas foram consideradas críticas para melhorar a produtividade farmacêutica e assistência ao paciente [4].

A proficiência de estudos pré-clínicos de câncer está ligada à adequação da próprio modelo animal. Primordial é a presença de um sistema imune totalmente funcional, que está envolvida em praticamente todas as etapas do desenvolvimento da doença, e da resposta ao tratamento criticamente determina [5]. As células tumorais interagir mutuamente e dinamicamente com células do microambiente imunológico e outros durante todo o curso da progressão da doença metastática ou também na sequência de intervenção terapêutica [6]. Essa interação é adequadamente modelada tanto em autóctones modelos de cancro camundongo geneticamente modificado (GEM) e por transplante ortotópico de enxertos GEM-derivados (GDAs) em ratos de host totalmente imunocompetentes [7], mas não de forma eficaz em modelos atuais xenotransplante de cancro humano. Finalmente, a avaliação terapêutica e biomarcador deve idealmente confiar em modelos pré-clínicos de cancro recapitulando

que ocorre naturalmente

metástases, a fase de cancro mais mortal.

modelos pré-clínicos tratável exigem a capacidade de monitorar com precisão a progressão da doença e resposta terapêutica , facilitando a adoção de parâmetros clínicos relevantes [8]. acompanhamento da doença é essencial para metástases e tumores outra forma indetectável. imageamento óptico de células que expressam proteínas de geração de luz atualmente domina tecnologias de monitoramento devido à sua capacidade de medir eventos em tempo real, custo-eficácia e tempo de eficiência [9]. No entanto, as proteínas marcadoras mais rastreáveis, incluindo a luciferase de pirilampo populares (ffLuc) e medusa reforçada proteína verde fluorescente (EGFP), são xenobióticos a mamíferos. Sua expressão naturalmente induz várias respostas imunes em animais imunocompetentes, resultando em atividade incompatível [10], [11], a rejeição de enxertos [12] e supressão da atividade metastático [13], confundindo a validade das conclusões pré-clínicos. Assim, a utilização eficaz dos repórteres xenobióticos é restrito a quer estudos de curto prazo, ou modelos animais totalmente imunocomprometidos, limitando as opções pré-clínicos [9], [13].

Para superar esses problemas, temos desenvolvido um GEM modelo que é imunologicamente tolerante para ambos ffLuc eGFP e para servir como um hospedeiro para o transplante de tumores singeneicos rotulados. Utilização da hormona de crescimento de rato promotor (rGH), a expressão de uma proteína de fusão ffLuc-EGFP foi alvejado para a pituitária anterior, um local privilegiado não-imunológica distante de órgãos geralmente monitorizadas em estudos pré-clínicos, de modo a criar o “Cabeça de incandescência” (GH) rato [14]. Nós demonstramos que nas respostas imunes ratos de tipo selvagem induzidas por repórteres xenobióticos afectar substancialmente a progressão e respostas terapêuticas de tumores representável transplantado. É importante ressaltar que o uso de ratos pré-tolerantes GH minimiza ou elimina estas aberrações, resultando em modelos pré-clínicos mais confiável, tratáveis.

Materiais e Métodos

Lentivirus vetores

O lentiviral vector que expressa a proteína da luciferase do pirilampo-fluorescente verde melhorada proteína de fusão (Ferh-ffLuc-eGFP) foi descrita previamente [10]. Foi aqui modificado para remover eGFP e inserir um sítio de ligação ao ribossoma interno (IRES) e histona-H2B marcado eGFP (H2B-eGFP) para gerar Ferh-ffLuc-IRES-H2B-eGFP, que alveja a expressão de ffLuc e eGFP ao citoplasma e núcleo, respectivamente. Informações detalhadas sobre a sequência de vector será fornecido mediante solicitação ao Dr. Dominic Esposito (e-mail: [email protected])., Leidos Biomedical Research, Frederick, MD, EUA

Animais

para reduzir a absorção de bioluminescência e variação experimental, albino 6 a camundongos fêmeas puras de 8 semanas de idade em um C57BL /6 (C57BL /6

c-brd /c-brd /Cr) ou FVB /N fundo foram utilizadas como hospedeiros para estudos de transplantação. camundongos F1 a partir da criação de C57BL /6 com 129 (B6; 129) ratos foram usados ​​como hospedeiros isogênicos no estudo da ARN

Q61K /p19

ARF-nulo melanoma, que foi derivado de uma base genética mista [ ,,,0],15], [16]. Todos os animais utilizados neste projeto de pesquisa foram tratados e utilizados de forma humana de acordo com as seguintes políticas: a política Serviço de Saúde Pública EUA sobre a Atenção Humanizada e Uso de Animais (1996); o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (1996); e os Princípios do governo EUA para Utilização e Cuidados dos Animais Vertebrados Usados ​​em Testes, Pesquisa e Formação (1985). Todas as experiências de rato foram realizados em estrita conformidade com estudo animal Protocolos aprovado pelo Comité de animal Cuidado e Uso (ACUC), NCI, no Laboratório Nacional de Frederick para Pesquisa do Câncer, que é credenciado pela AAALACi e segue a Política de Serviço de Saúde Pública sobre o cuidado e Uso de Animais de laboratório. Os seguintes protocolos foram aprovados pela ACUC para a realização deste estudo:. ASP # 08-084, 11-044 e 11-058

Os ratos no estudo foram submetidos à eutanásia por asfixia CO2 seguindo orientações ACUC NCI-aprovados : (1) Transferir os ratos para uma câmara de CO2 direita antes da eutanásia. (2) Ligue o CO2 a 2 litros por minuto para um padrão de tamanho da câmara. (3) Dentro de aproximadamente dois a três minutos, ratos adultos deve ser imóvel e indiferente; quando este é evidente, aumentar a taxa de fluxo de alta ou de aproximadamente 10 litros /min. (4) Quando a respiração cessa para todos os animais vistos através da gaiola, definir o temporizador para 2 minutos. Ao fim de dois minutos, os ratinhos podem ser removidos a partir da gaiola cheia de CO2. Certifique-se de morte por ter certeza que não há movimentos de qualquer tipo por mais 60 segundos fora da gaiola cheia de CO2, usando o timer.

Geração do “Glowing Head” rato

O rGH -hGH construção [17] (uma oferta do Dr. Rhonda Kineman, Universidade de Illinois Chicago-, Chicago, IL) foi modificado por inserção de um gene de fusão ffLuc-eGFP para gerar o vector de glândula pituitária anterior de direccionamento, o qual foi utilizado para gerar ratinhos transgénicos em ambos os camundongos C57BL /6 e FVB /N origens genéticas por microinjeção de blastocisto. Pequenas colónias de ratos transgénicos homozigotos foram mantidos para fins de reprodução, ea sua descendência heterozigótica usado para todos os estudos pré-clínicos. Todo o trabalho transgênica e criação de animais foi realizada por meio do Programa Ciência Laboratory Animal, Frederick National Laboratory.

tumores murino, linhas celulares de cancro, e sua rotulagem

O Lewis Lung Carcinoma (LLC) tecido foi mantida apenas

in vivo

desde a sua derivação a partir do tumor de pulmão original camundongos C57BL /6 [8]. A espontaneamente metástase série HGF-tg /CDK4

R24C melanoma transplante de pele foi gerado a partir de um melanoma primário induzida em HGF-tg /CDK4

R24C camundongos C57BL /6 por aplicação epicut�ea do carcinógeno DMBA [18]. HGF-tg /CDKN2A

– /- melanoma foi obtido a partir de tumores induzidos em HGF-tg /CDKN2A

– /- murganhos FVB por irradiação UV [19]. Estes tumores foram mantidas apenas em ratinhos singénicos. Para o transplante, os tecidos tumorais recolhidas foram divididos em 3 mm x 3 mm pedaços e cada um foi inserido um corte de 5 mm na pele de um rato. MVT-1 células de cancro da mama de murideo foram derivados de tumores mamários do MMTV-c-Myc /MMTV-VEGF ratinho bi-transgénicos numa FVB /N fundo consanguínea [20]. Foram estabelecidos como uma linha de células e mantidas por meio da cultura in vitro. Para o transplante, 1,0 × 10

6 células foram preparadas a partir da cultura e injectadas subcutaneamente em cada ratinho. Mutant ARN

Q61K /p19

células de melanoma ARF-nulos foram geradas como descrito [15], [16]. Na primeira passagem, 1,0 × 106 células de cultura in vitro, foram inoculadas em ratinhos C57BL /F1 6×129 para formar tumores. Nas passagens seguintes, os fragmentos divididos de tumor colhidas foram utilizados para transplantação, como descrito acima.

Para identificar o

in vivo

tumores mantidos, suspensões de células preparadas a partir de

In vivo

tumores -expanded foram infectadas

ex vivo

com lentivírus pelo

ex vivo

spinoculation [10], [21]. LLC tecido foi infectado com codificação lentivírus ffLuc-eGFP ou ffLuc-IRES-H2B-eGFP e, em seguida, submetido a

In vivo

ciclismo obter tumores uniformemente marcadas, como descrito anteriormente [8]. As linhas celulares foram marcadas com ffLuc-eGFP lentivírus

in vitro

, eo eGFP

populações + foram isoladas usando o classificador de células activadas por fluorescência (FACS).

Estudos pré-clínicos e análise patológica

Para os estudos pré-clínicos, um tumor marcado criogenicamente preservado foi revivido e ampliado por transplante subcutânea em ratos. Estes tumores foram ressecados após atingir 500 mm

3 e expandido através de passagem para o número necessário de ratos para os estudos reais descritos no texto. O tamanho do tumor foi medido e calculado manualmente por V (mm

3) = 0,5 x L x W

2, em que L é o comprimento e W é a largura em mm. Para a modelagem pré-clínica de tumores primários, os ratos foram divididos aleatoriamente em grupos de acordo com o estudo de design quando os seus tumores atingiram 125 mm

3. O grupo controle recebeu solução de veículo, eo grupo experimental recebeu tratamentos de agentes quimioterapêuticos. A dose e horário em cada experimento foram especificadas nos resultados. Quando os tumores cresceram até 2000 mm

3, os ratos tinham atingido os seus pontos de extremidade e foram sacrificados para estudo posterior.

Para os modelos pré-clínicos de metástase espontânea, tumores primários foram removidos cirurgicamente, ao atingir 500 mm

3, e os ratos foram divididos aleatoriamente em grupos de acordo com o desenho do estudo. Metástases e recidiva foram monitorados periodicamente pela imagem utilizando o sistema Xenogen IVIS [8] para medir fluxo BL (fotões /sec grau /radial). O grupo controle recebeu solução de veículo, eo grupo experimental recebeu tratamentos de agentes quimioterapêuticos. A dose e horário em cada experimento foram especificadas nos resultados. Quando os ratos mostraram sinais de morbidade, definida pelo protocolo do estudo animal (por exemplo falta de soprosidade, dificuldade em mover), eles chegaram ao seu ponto final e foram sacrificados para estudo posterior.

Os medicamentos utilizados neste estudo foram obtidos a partir de a Síntese Química Branch, DTP, NCI (Bethesda, MD). O paclitaxel foi dissolvido em 10 vezes a concentração desejada em etanol a 100%, diluídos com um volume igual de Cremaphor EL e depois diluída para a concentração de 1 x com solução salina antes da injecção intravenosa em ratinhos. A gemcitabina foi dissolvido em água e injectado por via intraperitoneal em ratinhos. Crizotinibe foi ressuspenso em 0,5% de metilcelulose a 0,9% em solução salina, e administrado uma vez por dia por sonda oral (PO) ao longo de um período de 3 semanas a 10 ml /kg. Os ratinhos portadores de tumores subcutâneos foram distribuídos aleatoriamente em 3 grupos com base na medição do tumor (200-500 mm

3), e tratados com veículo sozinho, crizotinibe a 50 mg /kg, ou Crizotinibe a 100 mg /kg.

tecidos colhidos foram fixados em formol a 10% e embebidos em parafina. cortes seriados adjacentes foram coradas com hematoxilina e eosina (H E) para análise histológica, ou usado para imuno-histoquímica GFP (ab6556, Abcam, Cambridge, MA, EUA). Histopatologia foi realizada pelo Dr. Miriam Anver (Patologia e Histotechnology Laboratory, Leidos Biomedical Research, Frederick, MD). Para a análise quantitativa, as lâminas foram digitalizadas usando o sistema XT ScanScope e as imagens foram analisadas por software de análise de patologia Spectrum Plus (Aperio Technologies, Vista, CA).

hormonal e análise marcador imunológico

Sera foram preparado a partir de sangue total recolhido de acordo com protocolos convencionais e armazenado a -80 ° C. Para analisar o anticorpo anti-GFP no soro, as placas de ELISA (Nunc MaxiSorp, Cat # 439454, Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA) foram revestidos com 31,25 ng de GFP recombinante (MB-0752, Vector Laboratory, Burlingame, CA, EUA) em cada poço durante a noite a 4 ° C. No dia seguinte, os soros e controlar anticorpo anti-GFP monoclonal (11814460001, Roche Applied Science, Indianapolis, IN, EUA) foram sujeitos a diluição em série com solução de bloqueio (leite 3% em solução salina tamponada com fosfato [PBS]) para alcançar o intervalo 1:25-1:2000 para o primeiro e 6.25-200 ng /ml para o último. 50 ul de anticorpo de soro ou de controlo diluídos foram adicionados aos poços revestidos, seguido por incubação durante uma hora à temperatura ambiente. Após lavagem com PBS contendo 0,05% de Tween 20 (PBST). peróxido de cavalo avermelhado (HRP) -conjugated anticorpo de cabra anti-rato (115-035-062, Jackson ImmunoResearch Laboratories) a 1:1000 diluição em solução foi então adicionada a cada poço, seguido da adição do substrato da peroxidase de bloqueio (TMB 2- componente Microwell peroxidase Substrate Kit, 50-76-00, KPL, Gaithersburg, MD, EUA) para o desenvolvimento de cor de acordo com as instruções do fabricante. A absorção A450 das placas foi medida utilizando um leitor de microplacas (Vmax Kinetic absorvância ELISA Leitor de Microplacas, 97059-546, VWR Corp., Radnor, PA, EUA). Rato níveis de hormônio de crescimento em soros foram analisados ​​utilizando o hormônio do crescimento (GH) kit ELISA (M0934, Biotang Inc., CA, EUA), de acordo com as instruções do fabricante, conforme a seguir. Os soros foram diluídos 2 vezes com meio RPMI1640, e soluções-padrão foram preparadas para a gama de concentração de 0,3125-100 ng /ml. Os padrões e amostras foram adicionados a placa de ELISA fornecido, que foi incubada a 37 ° C durante 40 min e lavada com tampão de lavagem. Cada poço foi em seguida adicionada com 50 ul de água e 50 ul de anticorpo anti-GH biotinilado, e incubado a 37 ° C durante 20 min. Após a lavagem, 100 ul de HRP-estreptavidina conjugada foi adicionado a cada poço e incubou-se a 37 ° C durante 10 min. Após outra lavagem, 100 uL de solução de substrato de HRP foi adicionado a cada poço, incubou-se a 37 ° C durante 15 min, seguido pela adição de 100 ul de solução de paragem. A absorção A450 das placas foi medida utilizando o leitor de microplacas VMax.

Para analisar marcadores de superfície celular, foram preparadas suspensões unicelulares a partir de baços de ratinho colhidos e incubados com 5 ul /ml de anticorpo do receptor Fcy (14- 0161-85, eBiosciences, San Diego, CA, EUA) para o bloqueio por 20 min. Após uma lavagem com solução de coloração (PBS contendo 1% de albumina de soro bovino [BSA]), que foram incubadas com 0,3 uL /​​mL de rato anti-CD4 (550728, BD-Pharmingen, San Jose, CA, EUA) ou de CD8a ( 550281, BD-Pharmingen anticorpo, ou anticorpo de controlo de isotipo (559073, BD-Pharmingen), a 4 ° C durante 1 h, seguido por lavagem com solução de coloração por três vezes. As células foram então incubadas com 4 ul /ml de Alexa 488- anticorpo secundário anti-rato de cabra conjugado (A11006, Invitrogen, Grand Island, NY, EUA) a 4 ° C durante 20 min. Após lavagem com solução de coloração por três vezes, as células foram submetidas a análise por FACS (FACSCalibur, BD Biosciences, San Jose, CA, EUA) ou celular Analisador equipado com um módulo de filtração óptica para a detecção FITC para quantificar a expressão de marcadores de células (Cellometer visão, Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA, EUA). os dados gerados a partir de FACS e Cellometer visão foram analisados ​​e quantificado com software FlowJo (TreeStar, Inc. Ashland, OR, EUA) e FCS Express (de Novo software, Los Angeles, CA, EUA), respectivamente.

a análise estatística

As diferenças de quantidade distribuição (por exemplo, o tamanho do tumor, a intensidade de bioluminescência, CD8 /CD4) entre os grupos de estudo foram analisados ​​utilizando o teste paramétrico t não pareado. Para estudos pré-clínicos, o ponto final foi a sobrevivência global, definida como o tempo até a morbidade do rato de acordo com o protocolo de estudo em animais. Camundongos vivos ao final do estudo foram censurados na mesma data. O método de Kaplan-Meier e Mantel-Cox logrank-teste foram realizados para comparar as taxas de sobrevivência dos grupos de rato. A significância estatística foi estabelecida no

P

-valor 0,05. O tempo médio de sobrevivência foi calculada como o tempo de sobrevivência menor para os quais a função de sobrevivência atingiram 50%. Os cálculos foram feitos com GraphPad Prism 6 (La Jolla, CA).

Resultados

atividade Repórter de tumores murinos ffLuc-eGFP-rotulados é inconsistente em ratinhos singeneicos imunocompetentes

o transplantadas subcutaneamente Lewis Lung Carcinoma (LLC) é um modelo bem caracterizado metastática que foi recentemente explorado em vários estudos pré-clínicos de alto perfil [22] – [24]. Recentemente recuperado arquivados LLC não tecido adaptado para cultura de células, e mostraram que após o transplante e ressecção de metástases ocorreu com muito curta latência em 90% de ratinhos singeneicos C57BL WT /6 hospedeiras [8]. Aqui nós rotulados LLC com um lentivírus ffLuc-eGFP-codificado

ex vivo

[10]. Como os resultados de transdução viral na população celular heterogénea [25], que sujeite este tumor marcado para

In vivo

bicicleta para torná-las uniformemente marcado [8], [26]. Resumidamente, os ratinhos portadores de tumores transplantados são monitorizados para a metástase, e nódulos metastáticos vai ser colhido para transplante subcutâneo para iniciar próximo ciclo. Uma vez que cada nódulo foi derivada a partir de uma única célula, o tumor derivado do que é presumivelmente clonais. Por conseguinte, a homogeneidade será reforçada através de cada ciclo. Como mostrado na Fig. 1A, após o transplante por via subcutânea e ressecção do LLC marcados em cinco ratos, metástases decorrentes foram facilmente detectados pelo

in vivo

bioluminescência imagem (BL). Nesta passagem, embora os tumores cresceram em todos os hosts, foram detectadas metástases em apenas um (# 160 na Fig. 1A, painel inferior). Colhemos pulmões daquele rato e examinou-o com

ex vivo

de imagem (Fig. 1B, painel superior). A intensidade reflectida BL desigualmente distribuída da heterogeneidade das células transduzidas no tumor primário (Fig. 1B, painel superior). Nós recolhidos a partir de ratinhos hospedeiros três metástases pulmonares bem marcados individuais, que se presume ser clonal, dividindo-os em cinco fragmentos para transplante em cinco ratinhos C57BL /6. nódulos pulmonares marcados do rato que foram recolhidas e transplantadas para mais cinco ratinhos C57BL /6; No entanto, estes tumores cresceram muito lentamente, em seguida, e /ou não exibiram qualquer actividade repórter detectável (Fig. 1B). Estes resultados demonstram que a actividade repórter nas células marcadas não poderia ser consistentemente mantido ao longo passagens em ratinhos imunocompetentes singénicos, mesmo depois de selecção clonal.

, de murino Lewis Lung Carcinoma (LLC), as células foram infectadas com um ffLuc-eGFP-expressando lentivírus

ex vivo

e transplantados subcutaneamente em cinco albino singênica /6 (c-Brd) camundongos C57BL (# 160-164). atividade Reporter foi monitorada por imagem BL do crescimento subcutânea tumor (corpo) e metástase pulmonar (no peito). No dia 15 após a inoculação, um sinal BL metastático foi encontrada em um dos ratos (# 160 no painel inferior). B, O pulmão foi colhida a partir de # 160, e um único nódulo metastático brilhante selecionado usando

ex vivo

imaging (painel superior) foi transplantadas em camundongos cinco c-Brd na segunda passagem. resultados de imagem mostraram que a atividade de repórter não poderia ser mantido consistentemente nos tumores palpáveis ​​resultantes (painel inferior).

Para determinar se a consistência repórter era dependente do tipo de tumor, estendemos nossa análise ao melanoma mouse. Um ARN

, p19

linha ARF deficiente melanocítico de células [15], [16] foi rotulado usando o lentivírus ffLuc-eGFP e transplantadas por via subcutânea em ratos imunocompetentes singénicos transformou-Q61K. Após a ressecção um nódulo pulmonar alta-BL foi seleccionado para o transplante subcutâneo em dois ratinhos (Fig. S1A, painéis esquerdos). Ambos os tumores exibiram uma redução significativa na actividade de BL normalizada durante o crescimento subcutâneo (Fig. S1A, painéis direitos). Nós corroborou estes resultados em dois outros modelos. células de melanoma colhidas diretamente de um HGF-transgênico /FVB CDKN2A-knockout /N rato foram transduzidas com o gene ffLuc-eGFP

ex vivo

, e transplantadas subcutaneamente em ratinhos singeneicos FVB /N. Enquanto todos os tumores cresceram, BL intensidade foi reduzida ou aumentada mais lentamente (Fig. S1B), e intensidade de BL /proporção de tamanho, que serve como o indicador de retenção de rotulagem, foi reduzida em três dos cinco tumores. Noutro modelo, ffLuc-eGFP-rato expressando células de cancro da mama Mvt-1 transplantados ortotopicamente nas almofadas de gordura mamaria de FVB singeneicos /N ratinhos também demonstrou a fraca retenção de sinalização BL (ver abaixo). Conclui-se que a expressão ffLuc-eGFP em aloenxertos em wildtype imunocompetentes (WT) ratos é inconsistente mantida entre ratos e /ou passagens, independentemente do tipo de tumor, fundo genético ou local de transplante.

Geração de um modelo GEM imunologicamente tolerante a GFP e repórteres de luciferase

os nossos resultados sugerem que a imunogenicidade dos produtos do gene repórter xenobióticos é em grande parte responsável pela sua inconsistência no contexto de um sistema imunitário inteiramente funcional. Para contornar este problema, geramos camundongos C57BL /6 e modelos GEM baseados em N FVB /reconhecendo proteínas ffLuc e eGFP como auto. Para a sua alta especificidade, sequências de genes RGH [17] (Fig. 2A) foram utilizadas para alvejar a expressão de um gene de fusão ffLuc-EGFP para a glândula pituitária anterior do rato, evitando assim interferir sinalização dos locais mais comuns das metástases.

a, Estrutura do vector de expressão para a produção de incandescência Cabeça (GH) ratinhos transgénicos. A expressão de um gene de fusão luciferase-eGFP vaga-lume (ffLuc-eGFP) foi direcionada para a glândula pituitária do rato anterior, utilizando o promotor da hormona de crescimento de rato (rGH) e sequências do gene da hormona de crescimento humano, que incluem um site polyadenylylation (hGHpA)

20. B, padrão de expressão óptica de transgene em ratinhos GH como visualizado por imagem BL. actividade repórter foi detectado na glândula pituitária anterior de ambos os sexos e os testículos de ratos do sexo masculino. C, os níveis séricos de hormona de crescimento dos ratos e do tipo selvagem GH pareados por idade (WT) ratos c-Brd foi avaliada por ELISA (média ± SE). O sangue foi retirado ao mesmo tempo do dia. Não houve diferenças significativas nos níveis circulantes de hormona de crescimento entre os ratos GH e WT foram encontrados. tumores LLC D, ffLuc-eGFP-marcadas foram transplantadas subcutaneamente em WT, a GH, e os ratos NOD-SCID. O sangue foi retirado para preparar soros quando os tumores atingiram 500 mm

3, e os níveis séricos de anticorpo anti-GFP foram analisados ​​por ELISA. Os níveis de anticorpo anti-GFP em ratinhos WT são significativamente mais elevados do que aqueles em GH e ratinhos NOD-SCID (p 0,005), mas não foi encontrada diferença entre aqueles em GH e ratinhos NOD-SCID (p = 0,19). O soro de ratos saudáveis, sem o transplante do tumor serviram como controles para definir o ponto zero.

A glândula pituitária anterior não é um site imuno-privilegiado e é, portanto, parte da circulação sistêmica [27]. As proteínas ffLuc e eGFP codificada em transgenes expressos na glândula pituitária anterior durante o desenvolvimento embrionário, por conseguinte, participar na selecção de células T e B e são reconhecidos como auto-antigénios, o que resulta na sua tolerização. Para reduzir a adsorção de luz pelo pigmento do transgene ffLuc-eGFP foi criado para o albino C57BL /6F (c-Brd) de fundo. linhas fundadoras foram escolhidos de cada cepa que demonstrou herança transgene mendeliana e fecundidade normal. Em nosso estudo anterior, identificou-se o limite de detecção do sinal de BL de em imagem do rato vivo foi de 1,5 × 10

5 fótons /seg /rad [8]. Para evitar possíveis efeitos de confusão associados com alta expressão do transgene, essas linhas fundadoras exibindo baixa, mas consistente sinal BL acima da leitura de fundo (cerca de 2-6 × 10

5 fótons /seg /rad) foram selecionados (Fig. S2A). Consistente com a segmentação relatado para o promotor de rGH [17], do sinal BL foi evidente na cabeça e testículos de linhas transgénicas (Fig. 2B); modesta sinal também poderia ser detectada nas glândulas da tiróide, mas apenas usando

ex vivo

de imagem (não mostrado). Os níveis de BL no organismo de ratos GH estão próximos aos de ratinhos WT, indicando a alta especificidade do transgene (Fig. S2B). Baseado no site da atividade repórter e promotor rGH usado para alvejar estas gemas foram apelidados de “Cabeça de incandescência” (GH) camundongos.

O possível impacto da expressão do transgene na função pituitária foi avaliada comparando os níveis de hormona de crescimento circulando em GH e WT ratinhos C57BL /6. Descobrimos que os níveis de hormona de crescimento do soro não foram significativamente diferentes entre transgênicos e WT (Fig. 2C), independentemente do sexo, indicando que a expressão do transgene ffLuc-eGFP não afeta abertamente função pituitária anterior em ratos GH.

Para avaliar as consequências imunológicas de expressão repórter, as células de tumores ffLuc-eGFP-rotulados LLC foram transplantadas subcutaneamente em GH e WT ratinhos C57BL /6, bem como MHC-inigualável, imunocomprometidos não obeso diabético imunodeficiência combinada /grave (NOD /SCID) (BALB /c de fundo). Quando os tumores atingiram 500 mm

3 foi retirado sangue e o soro testado quanto à presença de anticorpo anti-GFP. Enquanto que os ratinhos WT portadores de tumores possuíam níveis significativos de circulando anticorpo anti-GFP (Fig. 2D e Fig. S2C), foi encontrada nenhuma diferença significativa entre GH e ratinhos NOD-SCID, que é conhecido incompetente para produzir anticorpos (Fig apresentando tumores . S2C). Estes dados mostram que, enquanto imunogénico em ratinhos WT, ffLuc-eGFP é tolerada e reconhecida como própria GH em ratinhos.

crescimento e metástases de células tumorais que expressam repórteres representável xenobióticos são alteradas em WT e NOD /SCID que comparado GH ratos

Para testar a função de ratos GH, nós implantados tumores ffLuc-EGFP marcado por via subcutânea em camundongos WT e GH sing�icos. Embora o tamanho do tumor aumentou de forma semelhante em ambos os tipos de ratinhos hospedeiros, BL aumentos em tumores foram significativamente retardado em ratinhos WT, em comparação com ratinhos de GH (Fig. S3A). Este resultado sugeriu que o uso de ratos GH como receptores de aloenxertos poderia ajudar a corrigir as inconsistências observadas nos sinais BL de tumores marcados transplantadas em camundongos imunocompetentes. Para validar este ponto, nós testamos GH rato em um estudo maior escala envolvendo tanto do tumor primário e metástases. Mvt-1 células metastáticas do cancro da mama [20], [28] foram transduzidas com ffLuc-eGFP lentivírus e transplantados ortotopicamente em almofadas de gordura mamária de GH ou ratinhos WT FVB singênica /N beneficiários. células Mvt-1 marcada como exibiram uma melhoria significativa na sinalização BL ao longo do tempo quando transplantadas em ratinhos GH vs WT, que não conseguiu reter sinalização (Fig. 3A e painéis superior da Fig. S4A). Desde repórteres representável são essenciais para a monitorização metástase, responsáveis ​​pela grande maioria das mortes de doentes do cancro, tumores primários Mvt-1 foram ressecados e os ratinhos hospedeiras seguido ao longo do tempo.