Abstract

LC3s (MAPA 1-LC3A, B e C) são proteínas estruturais de membranas autophagosomal, amplamente utilizados como biomarcadores de autofagia. Se estas três proteínas LC3 tem um papel biológico semelhante em autofagia permanece obscura. Nós examinar em paralelo os padrões de expressão subcelulares das três proteínas LC3 em um painel de linhas celulares de cancro humano, bem como em fibroblastos MRC5 e HUVEC normais, utilizando microscopia confocal e análise de transferência de Western de fracções de células. No citoplasma, houve uma co-localização mínima entre LC3A, B e C de coloração, o que sugere que os autofagossomas relevantes são formadas por uma única fora das três proteínas LC3. LC3A mostraram uma localização perinuclear e nuclear, ao passo que LC3B foi igualmente distribuídos por todo o citoplasma e localizadas nas regiões nucleolar. LC3C estava localizada no citoplasma e fortemente no núcleo (excluindo nucléolos), onde se extensivamente co-localizada com o LC3A e o beclin-1 autofagia iniciar proteína. Beclin 1 é conhecida por conter um sinal de tráfico nuclear. Bloqueio função de exportação nuclear por Leptomycin B resultou na acumulação nuclear de todos LC3 e proteínas beclin-1, enquanto Ivermectina que bloqueia importação nuclear mostrou uma redução de acumulação, mas não em todas as linhas celulares. Uma vez que as proteínas endógenas LC3 são utilizados como marcadores de grandes autofagia em estudos clínicos e linhas de células, é essencial para verificar a especificidade dos anticorpos utilizados, como a cinética destas moléculas não são idênticas e podem ter papéis biológicos distintos. Os padrões de expressão subcelulares distintas de LC3s fornecer uma base para futuros estudos

Citation:. Koukourakis MI, Kalamida D, Giatromanolaki A, Zois CE, Sivridis E, Pouliliou S, et al. (2015) Autophagosome Proteínas LC3A, LC3B e LC3C Tenha distintos Kinetics distribuição celular e expressão em linhas celulares de cancro. PLoS ONE 10 (9): e0137675. doi: 10.1371 /journal.pone.0137675

editor: Srinivasa M. Srinivasula, IISER-TVM, Índia |

Recebido: 04 de julho de 2015; Aceito: 20 de agosto de 2015; Publicação: 17 de setembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Koukourakis et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. o estudo foi financiado pelo «FORMAÇÃO E APRENDIZAGEM aO LONGO – ARISTEIA» projecto, código não 520, ESPA de 2007-2013, GGET número correspondente à decisão 12605 /2012/09/26 (URL: https://www.espa.gr/el/pages/proclamationsfs.aspx?item=1736). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a autofagia é uma das principais via intracelular para a degradação e reciclagem de proteínas de longa duração e organelas inteiras [1,2]. LC3s (MAPA 1-LC3s) são proteínas estruturais de membranas autophagosomal. A família de genes LC3 humano tem três membros, LC3A, LC3B e LC3C, enquanto duas variantes da proteína LC3A foram identificados [3,4]. A família de genes LC3 humano tem três membros do LC3A, LC3B e LC3C enquanto em um trabalho recente tem sido relatada cinco membros, LC3A (variante-1, variante-2), LC3B, LC3B2 e LC3C [4]. A forma LC3-II é um dos principais componentes da membrana autophagosome (LC3A-II e LC3B-II, também LC3C-II, mas não estudada aqui) que reside no site de interior e exterior da membrana. A LC3-II é derivado de uma proteína proLC3 ~ 30 kDa após clivagem por autofagina Atg4 para produzir a forma activa citosólica LC3-I. Isto, por sua vez, é activado por Atg7, e, em seguida, transferido para Atg3, uma segunda enzima E2 semelhante, tornando-se uma forma ligada à membrana, LC3-II [5]. Após a formação do autophagosome, a LC3-II, localizada no sítio exterior é libertada para o citosol e o LC3-II situado no interior do local é degradado por hidrolases [6]. Nesta última forma, LC3-II localiza nas membranas autophagosomal e autolysosomal esféricas, formando um marcador adequado da actividade autophagic [6,7]

.

Se estas três proteínas LC3 tem um papel biológico semelhante em autofagia ou outra vias permanece obscura. Na literatura, a maioria dos estudos focam uma expressão geral LC3, sem relatar sobre a especificidade dos anticorpos utilizados, com base no pressuposto de que arbitrária formas A e B são equivalentes. No estudo actual, examinar, após extensivamente validar a especificidade do anticorpo, a expressão em paralelo de três LC3A, proteínas B e C em linhas celulares de cancro humano, que mostra padrões distintos de localização sub-celular, sugerindo um papel biológico distinto destas proteínas irmã .

resultados

Identificação de anticorpos específicos LC3A e B

a especificidade dos anticorpos testados contra as proteínas humanas recombinantes disponíveis comerciais LC3A LC3B e é mostrada na Fig 1A. Os anticorpos anti-LC3A (ap1805a e ab62720) são específicos para a proteína LC3A e os anticorpos anti-LC3B (5F10 e NB100-2220) são específicos para a proteína LC3B. A L8918, L7543 e NB600-1384 pode ligar-se quer à LC3A ou LC3B, mas com sensibilidade diferente, enquanto o ab52628 falhou para detectar qualquer uma das duas isoformas sob as mesmas condições.

(A) Especificidade de várias anticorpos anti-LC3 testado contra proteínas LC3A e LC3B recombinantes. (B) O processamento LC3A e LC3B após 24h de bafilomicina (100 nM) de tratamento em glioma e de células de cancro da mama linhas, usando o ab62720 específica LC3A e do LC3B 5F10 anticorpos específicos (C) immunofluorecence duas vezes na linha celular A549 usando o ab62720 reconhecendo exclusivamente a proteína LC3A e o anticorpo 5F10 que reage exclusivamente com LC3B. Observou uma expressão claramente distinta de LC3A em vacúolos verdes com localização perinuclear /nuclear e de vacúolos vermelhos LC3B que têm uma forma difusa, por todo o citoplasma, localização. Não há autofagossomas compostas por ambas as proteínas LC3A LC3B e (C1, C2), enquanto LC3A e mostra LAMP2a extensa colocalização (C3, C4). A identidade distinta de LC3A e LC3B autofagossomas também foi confirmada em condições ácidas (C5) e após a exposição à bafilomicina (C6). (D) immunofluorecence dupla em linha de células A549 usando o ab62720 reconhecendo exclusivamente a proteína LC3A eo NB600-1384 que reage com ambas as proteínas LC3A e LC3B. Observou que a maioria da LC3A perinuclear /nuclear (verde) vacúolos mostrar imunofluorescência dupla (amarelo), resultado da reactividade dupla LC3A /LC3B que produz o anticorpo NB600-1384. (E) LC3A e LC3B siRNAs bloquear especificamente a expressão das proteínas e LC3A LC3B, respectivamente, na linha de células A549 (E1,2,3). Em E4 a reatividade de LC3A (ab62720 Ab) e do LC3B (5F10 anticorpo) é mostrado, na sequência de silenciamento do LC3A ou dos genes LC3B, na linha de células A549.

Estamos focados em tanto LC3A e proteínas LC3B para analisar a resposta autophagic bafilomicina em linhas de células que utilizam os dois anticorpos que reconhecem selectivamente estas isoformas. As duas isoformas mostraram linha de base diferente e expressão perfil de resposta (Fig 1B) Sob tensão bafilomicina houve acumulação do LC3A-II e LC3B-II em todas as linhas celulares, sugerindo que ambas as proteínas podem ser utilizadas para avaliar fluxo autophagic (Fig 1B) . As linhas celulares T98G e BT474 têm maior fluxo autophagic (como avaliado tanto por LC3A ou imunotransferência LC3B) em comparação com o U87MG e MDA-MB-231, respectivamente (Figura 1B).

LC3A e LC3B expressando autofagossomas

a microscopia confocal com imunofluorescência dupla LC3A /B, utilizando anticorpos específicos de tipo LC3, revelou que LC3A e LC3B autofagossomas são distintos e que não existem autofagossomas que expressam ambas as proteínas (Fig 1C1 e 1C2). Esta descoberta era universal em todas as linhas de células examinadas. análise de co-localização revelou um percentual 1%, enquanto LC3A /LAMP2A co-localização nas células de controle foi superior a 20% (Fig 1C3 e 1C4)

A identidade distinta de LC3A contra autofagossomas LC3B também foi confirmada após a intensificação da autofagia. sob condições ácidas (Fig 1C5) e depois o bloqueio do fluxo autofagia após exposição a bafilomicina (Fig 1C6). Em contraste, os anticorpos não específicos mostrou uma expressão de largura da sobreposição, em resultado de reconhecimento de dupla LC3A e LC3B pelo anticorpo (Fig 1D1 e 1D2).

Usando siRNA para LC3A e LC3B, estes especificamente bloqueada a acumulação de LC3A ou de autofagossomas LC3B, respectivamente (Fig 1E1, 1E2 e 1E3). O silenciamento de LC3A ou de LC3B confirmada a perda da identificação das respectivas proteínas em transferências de Western (Fig 1E4).

citoplasmática LC3A e padrões de localização LC3B

A distribuição de LC3A e LC3B no citoplasma foi bastante distintos. LC3A foi acumulado principalmente na zona perinuclear, enquanto LC3B foi distribuído uniformemente por todo o citoplasma. Este fenómeno foi evidente em todas as linhas celulares examinadas e, conforme mostrado por análise de intensidade de expressão citoplasmática, LC3A perinuclear atingiu até 90% (intervalo de 60-90%) do teor total de proteína citoplasmática (Fig 2A1-2A7). Ocasionalmente, pequenos + autofagossomas LC3A incluído no LC3B + autofagossomas eram evidentes no citoplasma (Fig 2A1 e 2A2).

(A) confocal de imunofluorescência dupla para LC3A (verde) e LC3B (vermelho) em várias linhas celulares. Observou a acumulação LC3A na zona perinuclear, enquanto LC3B é distribuída por todo o citoplasma (A1-7). agregados LC3, sugestivos de pequenas autofagossomas LC3A + incluído no LC3B + autofagossomas, são ocasionalmente presente (caixas em A1,2). Western blots confirmar a presença de LC3A nuclear nos núcleos, principalmente com a forma LC3A-II (A8). (B) Os nucléolos são corados com o MIB1 /verde (B1), o LC3B /vermelho (B2), mas não o anticorpo LC3A /violeta (B3); ap1805a LC3A específico e do LC3B foram usadas 5F10 anticorpos específicos. Isso é confirmado em imunocoloração duplo para LC3A /MIB1 (B4), LC3B /MIB1 (B5) e LC3A /LC3B (B6). Observou que LC3B mancha as áreas de nucléolo internos, enquanto MIB1 o periférico. (C) actinomicina D danos nucléolos e interrompe o LC3B nucleaolar e MIB1 localização (C1). condições ácidas (pH = 6,5; C2) ou hipertermia (40 ° C; C3) não anula a distribuição de LC3B no nucléolos nem de LC3A nos núcleos. Lamin também é usado como um controlo para confirmar a presença de núcleos apenas na fracção nuclear.

LC3A nuclear e localização LC3B padrões

LC3A estava claramente localizada nos núcleos de todos os cancros linhas celulares examinadas, incluindo as HUVEC s e da linha de fibroblastos humanos MRC5 (Fig 2A1-2A7). análise de Western blot após fracionamento triplo (nuclear-pellet-sobrenadante) mostraram claramente a presença das proteínas LC3A nos núcleos, mais evidente como forma LC3A-II, que era mais proeminente nas células de glioblastoma (Fig 2A8).

LC3B foi mal expressa nos núcleos mas expressou fortemente nas regiões de nucléolo, uma área que foi negativo para LC3A. forte coloração nucleolar é evidente em 60-95% das células, dependendo da linha celular. Por exemplo, a linha celular de cancro do pulmão A549 exibe este padrão de coloração em 60% das células em cultura, enquanto este é tão elevada como 95% na linha de células H1299 do cancro do pulmão. Fig 2B1-2B6 mostra um padrão típico de expressão em 4 cores microscopia confocal. manchas ki67 nucléolos e colocaliza com LC3B, mas não LC3A. O tratamento de células com actinomicina D (Fig 2C1) que danifica nucléolos resultou em ausência de LC3B e Ki67 localização nos núcleos. Em contraste, a exposição de células a condições ácidas (pH = 6,5) ou hipertermia (40 ° C) durante 24 h não anula a distribuição de LC3B no nucléolos ou de LC3A nos núcleos (Figura 2C2 e 2C3). A análise Western blot na fracção nuclear confirmou a presença da proteína LC3B (Figura 3).

(A, B, C) 24h de incubação com Leptomycin B a 10 ng /ml, resulta em acumulação nuclear de LC3A, LC3C e beclin-1 no pulmão A549, H1299 e U87 glioblastom, linhas de células T98. (D) a incubação de 24 horas com Ivermectina em 100 ug /ml, diminuiu a expressão nuclear de LC3A /beclin-1 em A549 e linhas de células H1299 e aumentou a acumulação perinuclear da LC3A na linha celular H1299. (E) As transferências de Western de a fracção de células confirmam acumulação nuclear de LC3s e beclin-1 em linhas celulares de glioblastoma e pulmonares após incubação com Leptomycin B. A redução de proteínas após incubação com Ivermectina não foi consistente em todas as linhas celulares.

a expressão de LC3C

LC3C foi claramente expressa no citoplasma e mais intensamente no núcleo das células (Fig 4A). A análise Western blot mostrou uma presença clara de LC3C na fracção nuclear (Fig 4E). Não houve localização evidente nas áreas de nucléolo e imunofluorescência dupla com LC3B há falta de clareza da collocalizaton no nucléolo e no citoplasma (Fig 4B). Em imunofluorescência dupla, LC3C foi extensivamente co-localizada com o LC3A na área nuclear (Fig 4C e 4D), enquanto que a sua co-localização foi mínima no citoplasma. A expressão proeminente de LC3C nos núcleos também foi confirmada em análise Western blot (Figura 4E). Estas descobertas foram confirmadas em todas as linhas celulares examinadas. A tabela 1 resume os padrões de expressão distintos para LC3A, LC3B e LC3C.

(A) Citoplasmáticos e coloração nuclear de LC3C (vermelho) na linha de células U87. (B) LC3C duplo (vermelho) e LC3B (verde) em células de U87 imunomarcação mostram falta de co-localização entre as duas proteínas, tanto no citoplasma e as regiões nucleolar /nucleares. (C, D) LC3C duplo (vermelho) e LC3A (verde) imunomarcação que mostra a co-localização entre as duas proteínas, principalmente na área nuclear (U87 e de células T98 linhas). (E) de transferência de Western para LC3C no nuclear (N), da pelota (P) e solúvel (S) fracção de células U87 e T98. “M” é o marcador e Lamin é usado como um controlo para confirmar a presença de núcleos apenas na fracção nuclear.

LC3 nucleo-citosólica tráfico

Células eram incubadas durante 24 h com Leptomycin B, um inibidor específico e potente do CRM1 /exportina uma via de exportação nuclear. A 10 ng /ml para a incubação de 24 horas, a acumulação de LC3A nos núcleos foi aumentada, sugerindo um bloqueio da cinética LC3A extrusão do núcleo (Figura 3A). De interesse, LC3A acumulação nuclear mostrou uma co-localização intensa com a proteína autofagia sinalização beclin-1, e cinética semelhantes sob Leptomycin B exposição (Fig 3B). cinética e padrões de colocalização similares com beclin-1 foi confirmado para a proteína LC3C (Fig 3C).

Ivermectina, por outro lado, é um inibidor potente da importina

α

/

β

(Imp

α

/

β

1) a importação nuclear de transporte dependente. As células foram incubadas durante 24 h com Ivermectina em várias concentrações. Após uma incubação de 24 h a 100 ug /ml, a acumulação de LC3s e de beclin-1 nos núcleos foi diminuída, enquanto que a coloração citoplasmática foi aumentada (Figura 3D e 3E). Os resultados, no entanto, variados entre linhas celulares, como a expressão diminuição não foi confirmada para todas as proteínas em todas as linhas celulares.

Discussão

Em humanos, a família de genes LC3 tem cinco membros, o LC3Av1 ( variante 1; NM_032514), LC3Av2 (variante 2; NM_81509), LC3B (NM_022818), LC3B2 (NM_001085481) eo LC3C (NM_001004343). O geneloc para LC3A é 20.q11.22 passo que para o MAP1LC3B é 16q24.2 e MAP1LC3C é 1q43. Ambos LC3A e LC3B são diferencialmente expressos em tecidos normais [3,4,7,8]. Além disso, acredita-se que o LC3C (a terceira isoforma da família LC3) para ser fracamente ou não expresso na maioria dos tecidos normais [3,4,7]. No entanto, apenas o LC3A (variante 1), LC3B e LC3C tem sido show para ter modificação pós tradução e gerar a forma-II [4]. Além disso, voltando à literatura [3,7,8] do site de tradução para a MAP1LC3B única não é conservada. Por exemplo, ele et ai. 2003 [3] relatou que o site essencial para a nítida modificação pós-tradução de MAP1LC3B é Lys-122 ao invés do conservada Gli-120, que relatou para a MAP1LC3A e MAP1LC3C. Por outro lado Tanida et ai. 2005 [8] relataram que o terminal carboxilo da MAP1LC3B é clivado para expor Gly (120) por reacções adicionais ubiquitinação semelhantes. Nestas duas publicações costuras que o MAP1LC3B produzir o LC3B-II, enquanto o site modificações pós-translacionais não é conservada.

Na literatura o marcador autofágica endógena mais bem estudado é LC3B. Salienta-se, contudo, que a maioria dos estudos realizados utilizar anticorpos anti-LC3 que se presume ser anti-LC3B e não anti-LC3A, sem ter validado sua especificidade [9,10,11]. Existe uma elevada identidade entre o LC3A e LC3B isoforma, indicando que os epitopos utilizados para desenvolver anticorpos específicos são cruciais. De acordo com nossos resultados alguns anticorpos não são específicos, reconhecendo ambas as isoformas com uma sensibilidade variável, enquanto outros são capazes de detectar as isoformas específicas de LC3A e LC3B. Em qualquer caso, especificando o tipo de LC3 estudada seria desnecessário se de fato as diferentes proteínas LC3 tinha o mesmo padrão de expressão e biologia em tecidos normais e cancerosas. No entanto, este não é o caso, como mostrado no estudo atual.

Em um estudo anterior da nossa [12], examinando o fluxo autofágica em tecidos de camundongos, após várias pressões, o trabalho immunoblotting mostraram que a proteína LC3A segue padrões discretos de alterações LC3A-I e II-LC3A no fígado, pulmão, rim e tecidos do coração de ratos. Este sublinhou que LC3A é também de salientar inducible e tem padrões específicos de expressão de sua forma ligada solúvel e autophagosome. Aqui, em microscopia confocal utilizando validado anticorpos anti-LC3 específicas que confirmaram que LC3A e LC3B autofagossomas são distintas, não composto por ambas as proteínas e têm distribuição subcelular distinta. A expressão perinuclear LC3A prevalente contrasta com a distribuição bastante homogénea de LC3B por todo o citoplasma, sugerindo um papel biológico distinto entre os dois tipos autophagosome. De interesse, num artigo de Bai et al. 2012 [4]. LC3A e LC3B frequentemente co-localizada no mesmo ponto lacrimal em condições de fome (67%) enquanto que em condições basais a co-localização foi de 13% em células Saos-2. Nós também observou, em microscopia confocal, uma co-localização esporádica de LC3A e LC3B, dando a impressão de um grande LC3B + autophagosome digerindo um LC3A + um.

A biologia citoplasmática de LC3 mediada autofagia é bem estudado. O papel de LC3s nos núcleos permanece obscura. Karim et al detectado pela primeira vez sob a forma de proteína LC3-II nos núcleos de hepatócitos de rato [13], que está de acordo com a nossa experiência inédita com hepatócitos BALB /c do mouse. Drake et al relataram que, apesar de partilhar LC3A e B não há sinal de localização nuclear conhecida, um sinal de exportação nuclear podem existir, localizado nos resíduos 63 a 73 de LC3 humana [14]. proteína EGFP-LC3 estava claramente localizada nos núcleos de células COS-7. No estudo corrente, utilizando uma ampla gama de linhas de células de cancro, bem como fibroblastos humanos normais e células endoteliais, que confirmaram a presença nuclear de todas as três proteínas LC3. Houve, no entanto, uma localização diferencial impressionante da proteína LC3B que preferencialmente localizada nas regiões nucleolar, enquanto que as formas A e C foram localizadas na área nuclear extra-nucleolar. O papel desta expressão nucleolar LC3B permanece um mistério, assim como o papel da LC3A e LC3C no resto do núcleo. He et al proposto que LC3 nuclear pode estar envolvida no controlo da proliferação das células na leucemia promielocítica [15].

Nós investigamos se vias conhecidas transporte nuclear estão envolvidos no tráfico nucleo-citosólica de LC3s. A via da proteína nuclear de importação e exportação mediada por complexos de poros nucleares (NPC) foi estudada, utilizando o agente Leptomycin B, um antibiótico antifúngico, que especificamente e inibe fortemente a CRM1 /exportina 1 via de exportação nuclear ligando diretamente a proteína CRM1 [16 , 17]. Após a incubação de 24 horas das linhas celulares de glioblastoma e pulmonares, uma acumulação substancial de LC3A, LC3C e de proteínas beclin-1 era evidente por microscopia confocal, que também foi confirmado em análises de Western Blot. Isto contrasta com a descoberta por Drake et al [14], onde um curto de incubação de 3 h as células COS-7 e HeLa com Leptomycin não resultou em acumulação nuclear de EGFP-LC3. Beclin-1 contém um sinal de exportação nuclear ricas em leucina e destruição da função CRM1 resulta em acumulação nuclear de beclin-1 [18]. De interesse, beclin-1 co-localiza nos núcleos com LC3A e LC3C, enquanto nenhum co-localização proeminente foi observado no citoplasma. Se beclin-1 se ligar a LC3 é necessária para a entrada nuclear de uma exigências complexas uma investigação mais aprofundada.

Ivermectina, por outro lado, é um inibidor potente da importina

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β

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β

1) importação de transporte dependente nuclear, com nenhum efeito sobre proteínas que contêm sinal de localização nuclear (NLSs) reconhecido por vias alternativas de importação nucleares [19] a incubação de linhas celulares de cancro com ivermectina resultou numa diminuição da expressão de LC3s e beclin-1 nos núcleos, em consequência, contudo, que variou entre linhas de células e proteínas examinadas.

Desde proteínas LC3 endógenos são importantes marcadores de autofagia, é essencial para verificar a especificidade dos anticorpos utilizados ao realizar experimentos para LC3A ou de transformação LC3B em resposta a diferentes tipos de estresse. Estas moléculas não são idênticas e podem ter papéis biológicos distintos, não bem esclarecidas ainda. A localização nucleolar LC3B eo LC3A nuclear, LC3C e beclin-1 a acumulação encontrada no presente estudo fornecem uma base para novos estudos sobre o papel biológico distinto destas proteínas pode ter em tecidos normais e cancerosas.

Materiais e Métodos

culturas de linhas celulares

pulmonar linhas de células de cancro A549 (adenocarcinoma do pulmão humano, CLS GmbH, Alemanha), e H1299 (carcinoma humano do pulmão de não-pequenas células, ATCC), linhas de células de glioblastoma U87MG ( glioblastoma-astrocitoma humano, CLS GmbH, Alemanha) e T98G (glioblastoma multiforme humano, ATCC), linhas celulares de cancro da mama (HER2 + BT474, SUA negativo MDA-MB-231, DA3; ATCC), bem como MRC5 embrionário fibroblastos linhas celulares ( CLS celular Line Service, Alemanha) foram cultivadas utilizando DMEM meio basal (31885-023, Gibco). células HUVEC (CLS celular serviço de linha, Alemanha) cultivadas em meio específico (EBM ™ -2 Meio Basal com EGM ™ -2 SingleQuots ™ de fatores de crescimento; Lonza) também foram estudadas. O meio de cultura basal foi suplementado com FBS a 10% (FB-1000/500, Biosera), 100 unidades /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina (15140-122, Gibco) e 2 mM de L-glutamina (25030, Gibco). As células foram mantidas em condições padrão, 37 ° C, 5% de CO2 em atmosfera humidificada e foram utilizados ao atingir 70-90% de confluência.

Chemicals

As culturas de células foram tratadas separadamente, como especificado por o tempo de incubação de 24 horas com Leptomycin B (L2913, Sigma-Aldrich) a uma concentração final de 20 ng /ml e ivermectina (I8898, Sigma-Aldrich) a uma concentração final de 100 ug /ml.

Identificação LC3A, anticorpos específicos B e C

para testar a especificidade de anticorpos comercialmente disponíveis em relação à sua especificidade para LC3A ou LC3B os anticorpos seguintes foram usados ​​contra as proteínas recombinantes LC3A (H00084557-P01, Abnova) comercial disponível humana e LC3B ( H00081631-P01, Abnova):

a policlonal de coelho para LC3A (1: 30.000, ab62720, Abcam, um PSDRPFKQRRSFADR péptido sintético conjugado a KLH por um resíduo de cisteína ligante, o que corresponde aos aminoácidos 2-15 de MAP1LC3A Humana)

a policlonal de coelho para LC3A (1: 2500, 1805a, Abgent, um material sintético entre 97 ~ 120 aminoácidos do local de clivagem C-terminal do uso humano clivado-LC3A como um epitopo)

a monoclonal de coelho para LC3A (1: 1000, ab52628, Abcam)

a policlonal de coelho para LC3B (1: 5.000, NB600-1384, Novus, um péptido sintético feito para a região N-terminal da LC3 humano, isoforma de proteína B),

a policlonal de coelho para LC3B (1: 5.000, L7543 Sigma-Aldrich, um péptido sintético correspondente aos aminoácidos 2-15 de LC3B humano, conjugado com KLH)

o anticorpo policlonal de coelho para LC3B (1: 5000, NB100-2220, Novus, um péptido sintético feito de uma porção N-terminal da sequência da proteína humana LC3B entre os resíduos 1-100)

a policlonal de coelho para a LC3 ( 1: 5,000, L8918, Sigma-Aldrich, um péptido sintético correspondente aos aminoácidos 36-49 da isoforma humana LC3A um, conjugado com KLH através do resíduo de cisteína C-terminal)

o anticorpo monoclonal de ratinho contra a. LC3B. (1: 5000, 5F10, Nanotools, um péptido sintético feito de uma porção N-terminal da proteína humana LC3B)

em relação à anibody anti-LC3C, utilizou-se o coelho policlonal (18726-1-AP, Proteintech Europa) de anticorpo. A especificidade do anticorpo anti-LC3C utilizado foi previamente relatada (https://www.ptglab.com/Products/Search.aspx?key=LC3C).

A exposição à bafilomicina

LC3A e LC3B foram analisados ​​em linhas de células sob exposição ao agente autofagia perturbar bafilomicina Um [8]. Bafilomicina A é um inibidor específico do tipo vacuolar H (+) – ATPase (V-ATPase) em células, inibe a acidificação das organelas que contêm esta enzima (tal como lisossomas e dos endossomas) e, por outro lado, inibe a fusão de autophagososomes com o lisossomas [8]. A avaliação foi realizada 24 horas após a incubação de células com 100 nM de bafilomicina.

de SDS-PAGE e Immunoblotting

células foram lavadas duas vezes com PBS e lisadas num tampão de lise à base de sacarose (sacarose 0,25 M , 25 mM de Tris-HCl, pH 7,4) contendo inibidores de protease (complete Mini cocktail inibidor da protease, Roche Diagnostics GmbH) e inibidores de fosfatase (cocktail de inibidores de fosfatase, Cell Signaling Technology). Uma centrifugação diferencial dos lisados ​​de célula inteira conduziu a nuclear, o sobrenadante (citoplasmática de proteínas solúveis em água) e as fracções de ressuspensão (proteínas de membrana). quantificação de proteínas foi realizada de acordo com o Kit de Ensaio de proteína BCA Pierce ™ (# 23225, Thermo Scientific).

As amostras de proteínas foram separadas em geles de SDS descontínuos usando 10% de gel de separação para beclin-1 enquanto que para LC3A, e LC3B foi utilizado LC3C gel de separação 12,5%. Além disso, utilizou-se 5% de gel de empilhamento. Quarenta nanogramas de amostras analisadas em gel. A imunotransferência foi realizada utilizando membranas de PVDF-PSQ (Millipore Corp.). Em seguida, as membranas foram bloqueadas com leite em pó a 5% sem gordura em NaCl 150 mM, Tris 10 mM, pH 7,5 (TBS) e 0,1% (v /v) de Tween-20 à temperatura ambiente durante 2 horas seguido pela hibridação durante a noite a 4 ° C com os anticorpos primários. As membranas foram então hibridadas durante 2 h à temperatura ambiente com o anticorpo secundário, de cabra policlonal de IgG de coelho-HRP (1: 3000, Biorad, 1706515, EUA) ou anticorpo policlonal de cabra para IgG de ratinho-HRP (1: 3000, Biorad, 1706516, EUA). Bandas foram desenvolvidos usando Chemidoc MP Imaging System (Biorad, EUA)

Os anticorpos primários utilizados foram:. I) policlonal de coelho para LC3A (1: 1.000, ab62720, Abcam, um PSDRPFKQRRSFADR péptido sintético conjugado com KLH por um cisteína resíduo ligante, o que corresponde aos aminoácidos 2-15 de MAP1LC3A humano), ii), anticorpo monoclonal de ratinho para LC3B (1: 1,000; LC3B 5F10 Nanotools), iii) anticorpos policlonais de coelho para MAP1LC3C (1: 1.000, ProteinTechLab) e iv) anticorpo policlonal de coelho para beclin-1 (1: 2,000, A303-673A, Bethyl Laboratories, Inc., EUA)

Cada uma dessas manchas foi então despido, secou-se durante a noite, re-hibridou-se com anticorpo monoclonal de ratinho para Actina beta. (1: 5000, NB600-501, Novus Biologicals)

siRNA

siRNAs LC3A foram agrupados como (5′-GCGAGUUGGUCAAGAUCAUTT-3 ‘), (5’GCUUCCUCUAUAUGGUCUATT-3′ ), (5’-CCUGCUGUGUGGUUCAUCUTT- 3 ‘), (5′-GCUGUAAGGAGGUACAGCATT-3′), e LC3B siRNA foram reunidas respectivamente como (5’-GCCCUCUACUGAUUGUUAATT-3 ‘), (5′-CUCCCUAAGAGGAU CUUUATT-3′), (5’-GCCUGUGUUGUUACGGAAATT- 3 ‘). Estes foram costume sintetizado a partir de Shanghai GenePharma Co., Ltd (China). Estes foram utilizados a 20-50 nM para transfectar células utilizando HiPerfect (QIAGEN) durante 24 h, enquanto que a eficiência de silenciamento de ARNsi foi confirmada tanto por microscopia confocal e western blot após 24 h.

imunofluorescência confocal e análise de imagem

para a coloração de imunof luorescência, as células foram cultivadas em lamelas de vidro n ° s 1.5, fixadas em paraformaldeído a 3,7% /PBS a pH 7,4, durante 20 min a 37 ° C e depois permeabilizadas em PBS /0,1% v /v de Triton X- 100 pH 7,4 durante 5 minutos à temperatura ambiente. Além disso, as células foram bloqueadas em PBS /5% w /v de BSA, pH 7,4 durante 20 minutos e coradas com vários anticorpos primários: anticorpo anti-Ki67 (MIB1) monoclonal de rato (1: 150; DAKO), anti-LC3A policlonal de coelho (1 : 500; Abcam), anti-LC3C policlonal de coelho (1: 200; Proteintech Europa), anti-LC3B monoclonal de ratinho (1: 200; Nanotools) e beclin-1 anti-soro policlonal de coelho (1: 100, ab62557, Abcam) para . 1 h à temperatura ambiente

As células foram lavadas em PBS pH 7,4, incubadas com FC 488 e 564 apropriado anticorpos secundários, à TA e o ADN foi contra-coradas com Hoechst 33342 (1 ug /mL; Sigma-Aldrich). Após lavagens finais lamelas foram montadas em meio de montagem Mowiol caseiro. Imagiologia foi realizada em uma revolução Andor personalizado Spinning disco do sistema confocal construído em torno de um suporte (IX81; Olympus) com uma lente de 60x e uma câmera digital (Andor IXON + 885) (Facility CIBIT, MBG-duth). A aquisição de imagens foi realizada em Andor software IQ 2. secções ópticas foram registadas a cada 0,3 uM. Todas as imagens de microscopia confocal apresentados neste trabalho são projeções 2D máximos de intensidade das imagens z-stack, e análise de imagem para os conjuntos de dados obtidos foi realizada utilizando 1.47v ImageJ (National Institute of Health, EUA). Co-localização de imagens de análise e cálculo do coeficiente de Pearson para as imagens analisadas foram realizadas utilizando uma combinação de co-localização Finder e as Coloc 2 plugins em ImageJ.

Ética

O estudo foi aprovado pela Universidade Demócrito do Comitê de Ética em Pesquisa Thrace.

Reconhecimentos

o estudo foi financiado pelo «FORMAÇÃO E APRENDIZAGEM aO LONGO dA VIDA-ARISTEIA» projecto, código não 520, ESPA de 2007-2013, GGET número correspondente à decisão 12605 /2012/09/26