Nationwide
Abstract
Purpose
Os rápidos avanços na compreensão do câncer biologia têm transformado o desenvolvimento de drogas, assim, levando à aprovação de terapias-alvo e para o desenvolvimento de testes moleculares para selecionar pacientes que respondem aos tratamentos.
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estatuto surgiu como um preditor negativo de benefício clínico de anticorpos anti-EGFR em cancro colorectal, e os anticorpos anti-EGFR uso foi limitado a
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tumores de tipo selvagem. A fim de garantir um amplo acesso aos perfis moleculares do tumor, o Instituto Nacional do Câncer francês (Inca) criou uma rede nacional de 28 centros de genética molecular regionais. Ao mesmo tempo, a avaliação externa de qualidade em todo o país para
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testes (MOKAECM) foi concedida para analisar reprodutibilidade e custos.
Métodos
96 DNAs de linha de celular e 24 amostras de DNA de parafina tecidos tumorais embebidos foram enviados para 40 laboratórios franceses. Um total de 5448
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resultados foram coletadas e analisadas e um estudo-custando micro foi realizada em locais para 5 métodos comuns por uma equipe independente de economistas da saúde.
Resultados
Este trabalho forneceu uma imagem de linha de base do rigor e fiabilidade das
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análise em condições de teste de rotina em nível nacional. Inter-laboratório valores de Kappa foram 0,8 para
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resultados, apesar das diferenças de métodos de detecção e o uso de tecnologias in-house. Especificidade foi excelente com apenas um falso positivo em 1128 dados FFPE e sensibilidade foi maior para as técnicas orientadas, em comparação com os métodos baseados Sanger de sequenciação que eram dependentes de expertise local. o custo dos reagentes estimado por paciente variou de € 5,5 a € 19,0.
Conclusão
O Inca estabeleceu-se uma rede de laboratórios públicos dedicados a testes de oncologia molecular. Nossos resultados mostraram acordos quase perfeitos em
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testes em nível nacional, apesar de diferentes métodos de ensaio que garantam um acesso igual de baixo custo para tratamento personalizado do câncer colorretal
Citation:. Blons H, Rouleau E, N Charrier, Chatellier L, Côté JF, Páginas JC, et ai. (2013) Desempenho e eficiência de custos de
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Teste de Mutação para câncer colorretal metastático no diagnóstico de rotina: o estudo MOKAECM, uma experiência Nationwide. PLoS ONE 8 (7): e68945. doi: 10.1371 /journal.pone.0068945
editor: Anthony Federação das Índias Ocidentais Lo, da Universidade Chinesa de Hong Kong, Hong Kong
Recebido: 04 de março de 2013; Aceito: 04 de junho de 2013; Publicação: 25 de julho de 2013
Direitos de autor: © 2013 Blons et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. O MOKAECM estudar: Avaliação de la détection des Mutations de l’oncogene KRAS pour le traitement par les Anticorps anti-EGFR des pacientes porteurs d’un câncer colorretal Métastatique foi apoiado pelo número de projeto Francês Instituto Nacional do câncer (Inca) STIC2008 /IC0803 /NI08001. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Conflito de interesses:. Hélène Blons, Etienne Rouleau, Nathanaël Charrier, Gilles Chatellier, Jean-François Côté, Jean-Christophe Pages, Florença de Fraipont, Jean-Christophe Boyer, Jean Philippe Merlio, Alain Morel, Marie-Claude Gorisse, Patricia de Cremoux, Karen Leroy, L’Houcine Ouafik, Jean-Louis Merlin, Delphine Le Corre, Pascaline Aucouturier, Frédérique Nowak, Thierry Frébourg, Jean-François Emile e Isabelle Durand-Zaleski declararam que não têm interesses conflitantes. Gérard Milano: Declarada ser um: consultor ou papel consultivo para “Roche, Merck Serono, a GSK” (financiamento direto ao Hélène Blons) Jean-Christophe Sabourin: Declarada ser um consultor ou papel consultivo para “Merck Serono” (financiamento direto ao Hélène Blons ) Pierre Laurent-Puig: Declarada ser um consultor ou papel consultivo para “Merck Serono; Amgen; Saúde genômica; Sanofi; Myriad Genetics “(financiamento direto ao Hélène Blons). Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.
Introdução
Novas abordagens terapêuticas, tais como terapias alvo-EGFR anti e identificação simultânea de biomarcadores moleculares para identificar subgrupos de tumores potencialmente responsivos tinha criado uma necessidade de caracterização molecular de rotina de câncer. No cancro colorectal, a demonstração de que pacientes com
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tumores mutantes não beneficiar de anticorpos monoclonais anti-EGFR foi estabelecida independentemente da tecnologia utilizada para identificar
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tumores mutantes [1]. Este resultado foi rapidamente seguido por uma directiva da Agência Europeia de Medicamentos (EMEA), que restringiu o uso de cetuximab (Erbitux®) e panitumumab (Vectibix®) para pacientes com
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do tipo selvagem câncer colorretal metastático [2 ]
com mais de 940.000 novos casos de câncer colorretal em todo o mundo a cada ano, o uso de anti-EGFR terapias-alvo são confrontados com questões principais, um econômico um:. quem paga o teste ou as drogas e um médico : que executa o ensaio? O sistema de seguro de saúde pública francês decidiu fornecer terapia-alvo para o cancro colorectal em consonância com a recomendação da EMEA. Em paralelo, o governo francês e do Instituto Nacional do Câncer (Inca) criaram uma rede nacional de 28 centros de genética molecular regionais para implementar o teste molecular de rotina para câncer colorretal. Mais do que um laboratório pode estar relacionado com um centro regional.
Cada laboratório desenvolveu
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ensaios de acordo com os seus próprios conhecimentos e os instrumentos disponíveis localmente. O número de testes aumentou de 1.100 em 2007 para 10.012 em 2008 e 17.246 em 2009. A partir de então, o número de testes era estável e cobriu a incidência esperada de pacientes com câncer colorretal metastático em França. A fundação de € 2,5M foi dedicada à
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testes. Esta organização parecia rentável considerando o ganho global sobre droga custos. Era necessário provar que
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resultados dos testes foram reprodutíveis entre laboratórios moleculares. Cada laboratório usando um ou mais método de genotipagem foi avaliada por um programa de controle de qualidade externo, o programa multicêntrico:
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detecção Oncogene Mutação no tratamento de câncer metastático Colorectal por EGFR anticorpos (MOKAECM). O projeto MOKAECM foi configurado como um controlo de qualidade externo e laboratórios estavam livres para escolher e desenvolver seu próprio método para
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testes.
Anterior estudos comparativos avaliada uma tecnologia [3]
, [4], [5]. Outros compararam diferentes técnicas com uma tecnologia testada por site. Em ambos os casos não pode ser avaliada a robustez de uma tecnologia utilizada com diferentes níveis de competência [6] [7]. A avaliação nacional de
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testes de mutação que liga as práticas reais associados com a estimativa de custos nunca foi feito até agora.
O primeiro objectivo do projecto MOKAECM foi avaliar em nível nacional o desempenho de
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testes para fins clínico (sensibilidade e reprodutibilidade). O segundo foi o de estimar e comparar os custos associados a cada tecnologia. Como este estudo abrange um território nacional, incluindo todos os laboratórios moleculares INCa marcados, podemos inferir o desempenho nacional para
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testes do estudo MOKAECM.
Materiais e Métodos
desenho do estudo
Este estudo foi desenhado para avaliar
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genotipagem em 40 laboratórios franceses relacionados a um dos 28 centros de genética molecular, utilizando a linha celular e tumor embebido em parafina fixado em formalina (FFPE) amostras. SNDA foram centralmente preparado para controlar a homogeneidade e cegamente enviado a todos os participantes para
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testes utilizando tecnologias de prática de rotina. Os resultados foram carregadas e armazenadas em um banco de dados específico e analisados por um estatístico (GC) da Unidade de Pesquisa Clínica do hospital HEGP
Linhas Celulares
Células ATCC linhas (H1573: p.G12A; H358. : p.G12C; A427: p.G12D; LS123: p.G12S; SW620: p.G12V; Lovo: p.G13D; SW46: tipo selvagem) foram especialmente comprado para o estudo e
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G12R, foi obtido por infecção retroviral de 292FT células com um vector que contém o
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c.34G . substituição C (JCP)
Amostras colorectal Cancer tecidos
Vinte e quatro tumores foram caracterizados e seleccionados a partir de pacientes submetidos à ressecção cirúrgica de câncer colorretal no Paré Hospital Ambroise, (Boulogne-Billancourt, França). A Comissão de Ética da Ile de France II aprovou o estudo e os pacientes foram informados e consentimento escrito foi obtido de acordo com a lei francesa. O estudo foi realizado em França. O diagnóstico de adenocarcinoma colo-rectal foi avaliada por um patologista (JFE) que seleccionado dos blocos FFPE para análise molecular subsequente. extracção de ADN foi feita no Hospital Ambroise Paré utilizando o kit de ADN Qiamp Mini (Qiagen). Os tumores foram caracterizados por
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por três laboratórios diferentes, utilizando três diferentes tecnologias. Esses laboratórios foram selecionados com base em sua experiência com o teste KRAS e na validação interna do método utilizado. amostras selecionadas não mostrou discrepância.
Avaliação da celularidade
A avaliação da celularidade foi realizada em hematoxilina, eosina e Safran (HES) desliza em ambas as extremidades do bloco FFPE utilizadas para extração de DNA. As lâminas foram digitalizadas em um exame Mirax, (Zeiss, Göttingen, Alemanha). Para validar o conteúdo da célula tumoral, as imagens digitalizadas foram revistas por sete patologistas independentes de diferentes centros. Quando discrepâncias foram observadas, as lâminas foram revistos e consenso foi encontrado
Metodologia utilizada
Different in-house foram desenvolvidos métodos:. Sanger seqüenciamento direto (n = 15 laboratórios), os sistemas de sonda discriminação alélicas [ ,,,0],8], [9] (n = 13), snap Shot [10] (n = 7), pirossequenciao [11] (n-5), seguido por sequenciação GRH [12] (n = 5). Um laboratório usado o TheraScreen®: kit comercial K-RAS Mutation Kit. Cinco laboratórios testados mais de um método.
Trinta laboratórios trouxe seu protocolo inteiro para
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detecção de mutações, não houve homogeneidade prática, exceto para os laboratórios que usam
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sondas TaqMan ® (ver Informação S1). Os procedimentos detalhados com posições primers estão disponíveis mediante pedido.
abordagem estatística e Análise de Dados
taxa de erro foi definido como a soma de falsos positivos e falsos negativos, testes não-contributivas e errado chamada mutação. Para ajustar aos critérios utilizados pela EQA Europeia, todos os erros foram em primeiro lugar considerada igualmente significativa, embora a implicação para os pacientes podem ser diferentes. Todas as amostras foram seleccionadas para terem nenhum padrão de amplificação e cada participante apresentou um resultado que foi considerado como sendo o relatório final enviado para o oncologista. Em uma segunda etapa, considerados erros clinicamente relevantes como sendo falsos resultados positivos e negativos, considerando que em caso de falha de uma nova amostra seria solicitado embora isso irá resultar em mais um atraso para o paciente.
A taxa de sucesso foi definida como a soma dos verdadeiros positivos e verdadeiros negativos.
Foram avaliados tanto reprodutibilidade (inter e intra-laboratorial) e precisão do diagnóstico (sensibilidade e especificidade) das diferentes técnicas para
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genotipagem. Para cada linha de células mutante, havia quatro diluições diferentes (5%, 20%, 50%, 100%), com três réplicas por diluição. Todos os dados foram tidos em conta.
Para os seis técnicas, utilizadas por pelo menos dois laboratórios, entre laboratórios reprodutibilidade foi avaliada utilizando uma generalização das estatísticas Cohen Kappa para a medição de acordo entre várias taxas [13] . De facto, cada uma das 96 amostras foi avaliada por
m Network – com
m
variando de 2 a 15 de acordo com o technique- em uma das oito categorias mutuamente exclusivos. Como houve falhas (incapacidade para a técnica para dar um status de mutação), o cálculo tendo em conta os dados em falta. intervalos de confiança para o verdadeiro coeficiente Kappa generalizada foram calculados utilizando o método de reamostragem de bootstrap, para levar a correlação intra-cluster em conta [14].
Para avaliar a reprodutibilidade intra-laboratório para um determinado
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técnica de genotipagem, que calculado um índice Kappa para cada laboratório, como descrito acima, com base nas alíquotas em triplicado. Em seguida, resumimos os resultados por fornecer coeficientes médios de Kappa, com a gama de coeficientes Kappa em todo laboratórios.
precisão diagnóstico para a detecção de cada mutação específica (padrão ouro categórica) foi avaliada para cada técnica e cada laboratório. Os materiais utilizados nas duas fases pode ser considerada como materiais padrão de ouro (linhas de células tumorais, os ADN validado). Foi possível avaliar a sensibilidade e especificidade para cada laboratório com material linha de células e amostras de DNA FFPE. Para cada técnica, a sensibilidade e especificidade na detecção de mutação (padrão de ouro binário) foram calculadas através da combinação de dados de todos os laboratórios. Um estimador razão para a variância de dados binários em cluster que leva correlações intra-clusters em conta foi utilizada para o cálculo IC 95% [15]. Todas as análises foram realizadas utilizando o software SAS versão 9.1
Economical Avaliação
Cinco tecnologias foram comparados:. “A sequenciação directa”, “Instantâneo”, “pirossequencia�o”, “fusão alta resolução” (HRM ), “TaqMan®”. Os custos foram estimados a partir do ponto de vista do laboratório por estudos microcosting e tempo de movimento. Nós estimamos custos fixos e variáveis associados a cada uma das cinco tecnologias: trabalho, consumíveis (isto é, reagentes e outros consumíveis) e equipamentos e despesas gerais excluídos. O preço de compra foi usado para suprimentos e equipamentos com uma amortização linear de 5 anos e o trabalho foi avaliado usando massa salarial [16].
Custo Análise de Sensibilidade
A análise de sensibilidade foi conduzida para obter uma gama do custo movendo diferentes parâmetros. Os parâmetros foram sobre os preços (5% e ± 10%) e número laboratório de atos (Informações S1).
Resultados
Análise dos Resultados de linha celular
Noventa e seis As amostras de ADN de linha celular foram enviados para 40 laboratórios franceses, cinco laboratórios utilizados dois métodos de rastreio diferentes que conduzem a 4320 relatou resultados. Desde 6 laboratórios não poderia tecnicamente detectar a mutação p.G12R (Informações S1), as amostras p.G12R não foram tidos em conta e 3780 resultados foram finalmente analisado. Os resultados foram comparados com os genótipos esperados. A taxa de erro global foi de 10,6% (399/3780), devido principalmente a resultados falsos negativos (89%, 357/399). Entre estes, 307 testes correspondeu a uma percentagem de células tumorais de 5%, enquanto 50 amostras envolvidas com rácios de células tumorais mais elevados. Os 42 erros restantes foram insuficiência analítica (n = 25; 6%), falso positivo (n = 2; 0,5%) e mutação errada (n = 15; 4%). Sequenciamento gerado todos os resultados falsos positivos e demonstraram uma taxa de falso positivo de 0,4% (2/540). chamados de mutação erradas foram observados para o seqüenciamento (0,8%, 11/1260) e instantâneo (0,7%, 4/588).
Para técnicas realizadas por mais de 2 laboratórios, a sensibilidade variou de 76% a 96% e especificidade de 95% a 100% (Tabela 1). No que diz respeito 5 amostras de tumores%, a menor sensibilidade foi encontrado para sequenciamento e HRM com uma taxa de detecção global de cerca de 40% em comparação com 89,7% encontrado para pyrosequencing. Observou-se uma taxa de falha técnica de 1,6% para sondas Taqman devido a uma não-interpretação por 3 laboratórios dos triplicados correspondentes a p.G12V (SW480 100%) amostras homozigotos. Intra-laboratório e reprodutibilidade inter-laboratórios estavam em acordos quase perfeita ( 0,8 para todos os métodos). E não dependia tipo de mutação (Tabela 2)
Análise de Tumor Resultados da Amostra
No que diz respeito tecidos FFPE, 1128 dados foram gerados e analisados a partir de 24 amostras individuais de tumor (n = 47 métodos, 40 laboratórios diferentes). A taxa de erro global foi de 1,8% (20/1128) com 1 falsas, 7 negativos falsos positivos, 9 falhas analíticas e 3 chamados mutação erradas. amostras de tumores individuais chamadas corretas variou entre 100% e 76,6%, na verdade todos os laboratórios genotipados corretamente 16/24 amostras e uma amostra (a
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amostra p.G12A) gerou erros em 11 laboratórios. As amostras 6 do tipo selvagem foram genótipo corretamente exceto em um caso foram um falso positivo foi relatado pelo método baseado discriminação alélica qPCR com um bloqueador PNA. Trinta e dois de 47 conjuntos de resultados (Laboratório /método) geraram 0 error (68%), 13 fizeram 1 (28%), 2 fez 2 e um feito 3 (Tabela 3). Os três erros foram 3 falhas analíticas utilizando um ensaio pyrosequencing. Este laboratório também usado sequenciação directa com um resultado falso negativo. Se alterações clinicamente relevantes (falso positivo e negativo) e se melhores resultados são considerados quando mais do que um método foi testado, 82,5% dos laboratórios feito nenhum erro e a taxa de sucesso variou de 100 a 91,6. Os erros remanescentes foram 6 falso negativo e um falso positivo em 7 laboratórios. (Tabela S1).
Os custos por item
Microcosting foi avaliada em local (n = 10 laboratórios) por uma equipe independente de economistas da saúde. Os custos são dadas por item por teste e total por teste (Tabela 4). custos trabalhistas primeiros variou de € 3,7 (TaqMan) para € 11,4 (INSTANTÂNEO) por teste devido a diferentes durações de manipulação por amostra de 7,2 (TaqMan) para 22,1 minutos (Foto). Pequenas diferenças entre os laboratórios que utilizam a tecnologia idênticos foram observados devido à pequena variação nos protocolos e equipamentos diferentes que influenciam a eficiência e custos trabalhistas. Além disso, o número de amostras executados por lote também induz a variação dos custos do trabalho. Em segundo lugar, os custos dos equipamentos por teste variou de € 1,0 a € 9,7, dependendo laboratórios e tecnologias. A sequenciação directa foi a tecnologia mais caro, com mais de € 7 por teste. Pyrosequencing, HRM e TaqMan foram os menos tecnologias caras com menos de € 2 por teste. Sequencer, pirossequenciador e qPCR termociclador gerado 84% dos custos de equipamento. Máquina de custos por teste variou de acordo com a duração de pistas, os preços de compra e número máximo de amostras por lote.
Em terceiro lugar, consumíveis prêmios por teste variou de € 5,6 a € 19,0. Número de repetições, tipo de reagentes utilizados, processos técnicos e negociações de preços explicou a maior parte das diferenças observadas em laboratórios que utilizam a mesma tecnologia. Estas diferenças foram particularmente importante para a técnica de instantâneo. Um snapshot experimentos de laboratório replicado e reagentes mais caros usados, levando a três vezes mais elevados custos de consumíveis em comparação com o segundo laboratório estudado.
Os custos totais
O total de custos por teste variou de € 10,6 para € 34,8 ( tabela 4). Além disso custo total para HRM precisa levar em consideração os custos de sequenciação. Cerca de dois terços das amostras foram detectados como tipo selvagem genes KRAS por HRM e não exigir sequenciamento. Observou-se um aumento dos custos de pós sequenciamento “HRM” de € 7 a € 13 em comparação com os custos de sequenciação directa apesar tecnologias semelhantes. Assim, o custo total mundial por teste HRM variou de € 27,0 para € 28,0.
Custo Análise de Sensibilidade
A análise de sensibilidade confirmou que TaqMan foi menos caro do que outras tecnologias (Figura 1). Os custos estimados para TaqMan foram ideal dentro do caso base. Dentro dos piores condições (cinco amostras por lote e 10% os preços de marcação) preços TaqMan por teste variou de € 15,7 para € 20,1. custos pyrosequencing por teste foram inferiores a 20,1 €, se pelo menos 15 amostras por lote foram executados.
Bleu diamantes custos caso base raras.
Discussão
O uso de anticorpos monoclonais anti-EGFR é restrito para o de 60 a 70% KRAS tipo selvagem tumores colorrectais metastáticos, tornando a identificação de mutações KRAS apropriado um ponto fundamental para a prática clínica [17], [18]. Além disso a limitação do uso de inibidores de EGFR para pacientes com KRAS tipo selvagem pode ser uma solução potencial para a redução de custos [19]. Para garantir a acessibilidade testes, os incas concedeu 28 centros de genética molecular regionais até 2,5 M € [20]. O objectivo da rede nacional de controle de qualidade chamado MOKAECM, apoiado pelo Inca, foi avaliar os diferentes métodos in-house desenvolvidos por laboratórios moleculares para o teste KRAS em condições de rotina. Aqui, linhas semelhantes celulares (4296) e FFPE amostras de tumores SNDA (1152) foram enviados para os diferentes participantes e 5448 resultados KRAS genotipagem foram submetidos e analisados. No que se refere a linhas de células de teste, a taxa de erro foi de 10,6%, o ponto de corte de detecção variou de 5 a 20% e 86% de falsos negativos foram relacionados com a diluição de 5%. 1152 resultados das amostras FFPE foram analisados neste estudo, 68% dos conjuntos de teste (Método /laboratórios) identificou corretamente o estado mutacional do KRAS em todas as amostras FFPE. Este resultado é comparável com o resultado reportado no sistema europeu KRAS EAQ (70%) [21]. Recentemente, por análise de mutação KRAS no câncer colorretal, limites arbitrários para correta
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identificação mutação foi fixado em 97% [22]. Considerando-se melhores resultados para os laboratórios de ensaio mais do que um método, a taxa média de sucesso para amostras FFPE foi de 98,5 e variaram entre 100 e 91,6% (Informações S1). Estas pontuações são, em conformidade com os resultados de um estudo decorreu em 10 laboratórios em Holanda [23]. Além disso, não foi possível atingir uma pontuação global de teste caso de, pelo menos, 80% foi definida insatisfatória quando o teste de um maior número de casos no ‘acto Clinical Laboratory Improvement’ de 1988. Tendo em conta os resultados dos dois testes define 96% de laboratórios franceses teve um resultado satisfatório mais de 80% que mostra claramente a qualidade do teste KRAS em França, apesar do grande painel de métodos. Além disso, entre as 1152 em tumores testados, foram reportados apenas 20 erros. Este nível de erro é satisfatório.
Do ponto de vista nacional, em 1152 testes de tumor neste estudo, 20 erros (0,017 IC95% [,01-,027]) foram relatados com 11 deles relacionados a uma única amostra . Portanto, a taxa de erro corrigido foi de 0,7% IC95% [0,03% -0,13%] por teste e para cada tumor. Uma extrapolação sugere que em França, para fora dos tumores analisados 18.000 cada ano, 54 a 234 tumores poderia ser misgenotyped.
erros genotipagem pode resultar de diferentes problemas, como o tipo de fixador, o processo de preservação, a avaliação de o conteúdo de células tumorais e, finalmente, os desempenhos do método utilizado para o ensaio. Aqui, a extração de DNA foi centralizado e conteúdo da célula tumoral foi validado por 7 patologistas independentes, portanto, só
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métodos de genotipagem foram comparados. Todas as amostras seleccionadas teve uma primeira validação do seu estatuto KRAS realizada por três laboratórios de referência usando três diferentes métodos. Muitas técnicas diferentes, incluindo kits disponíveis comercialmente, foram desenvolvidos e testados, mas a ausência de um método de referência reconhecido faz a avaliação de novas tecnologias uma tarefa difícil.
testes linha celular pode não reflectir práticas de rotina, mas foi utilizado como um teste de validação em condições ideais para comparar a sensibilidade e especificidade entre as diferentes tecnologias. Para amostras com teor de linha de células de tumor mais de 20%, que pode ser considerado clinicamente relevante, os resultados analíticos mostraram acordos quase perfeitos. Para amostras com menos de 20%, os resultados foram mais heterogêneas, especialmente para sequenciação directa. Em nossa experiência, HRM prescreening não resgatar amostras com baixo teor de tumor. A menor sensibilidade dos métodos de sequenciamento em relação aos outros não foi uma surpresa [24], [25], [26], mas os nossos resultados também apontam que o desempenho pode depender de otimização método e nível de especialização. Na verdade 7 laboratórios utilizando sequenciamento ou HRM-seqüenciamento teve uma baixa pontuação de erro ( 10%) na série linha de células, incluindo amostras de linha celular 5% e nenhum erro na série tumor. Sensibilidade parece estar relacionada com um casal – metodologia /laboratório-experiência – e não estritamente a um método, portanto, validação e corte de detecção deve ser apreciado em cada laboratório. Quando os métodos baixa sensibilidade são usados para genotipagem, corte macrodissection deve ser adequadamente escolhido e recomendações pré-analítica claras deve ser dada aos patologistas antes da extração de DNA. Independentemente do método de detecção, tipo de mutação pode ter um impacto sobre a sensibilidade. A taxa de erros é de cerca de 3% com o p.G12V a mais de 20% com p.G12S e p.G12A. quantificação alélicas dos DNAs linha 7 celular utilizando pyrosequencing não deu qualquer explicação relevante para a sensibilidade reduzida observada para algumas mutações, e as consequências termodinâmicos no comportamento DNA de fusão pode, em parte, explicar esta observação. Na série FFPE a taxa de erro foi 20/1128 (1,7%) versus 399/3780 (10,6%) em linhas celulares, para os quais os erros eram principalmente devido a 5% de células de tumor falsos negativos. A taxa de erro foi de 2,6% para linhas de células em condições de conteúdo tumor semelhantes (falso negativo devido a amostras de 5% excluídos), sugerindo que a fixação do tecido não era um obstáculo ao
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testes. No entanto, a fixação pode ser ligeiramente impacto sobre os níveis de falha: 0,8% (9/1128) em amostras de FFPE contra 0,6% na linha de células DNAs (25/3780). A utilização de métodos baseados na amplificação de produtos de amplificação pequenos pode ser uma possibilidade para diminuir o nível de resultados não contributivas [27]. Neste estudo, os métodos baseados na discriminação alélica baseado em pequena amplificação fragmentos e PCR em tempo real demonstrou nenhuma falha contra até 4% para os métodos de sequenciação directa. Finalmente, na série FFPE, 14% dos erros foram encontradas em uma única amostra para o qual o conteúdo da célula de tumor foi de 50% depois de HES exame mas a quantificação dos alelos mutados por pyrosequencing sugeriu que as células mutantes só poderia representam 20% de todos. Isto poderia explicar em parte as discrepâncias observadas para esta amostra, mas também sugere que as variações genéticas não são igualmente detectado. Uma amostra positiva falsa FFPE foi identificado por amplificação específica do alelo com um bloqueador PNA. Não foi validado por outro laboratório, utilizando tecnologia semelhante e, portanto, foi considerado um falso positivo. Além disso, o valor clínico da sub-clone mutado continua a ser demonstrado [28], [29], [30], [31], [32].
As estimativas de custo Limitações
Esta metodologia de avaliação do custo era único entregue uma vez que a mesma equipe independente avaliou toda a tecnologia diretamente nos laboratórios. Cinco tecnologias foram estudadas por microcosting em dez laboratórios que representam um terço de todas as “plataformas” franceses, que realizou 25% de todo
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testes mutações para doentes com câncer colorretal metastático em França em 2009. Embora, o nível de evidência poderia ser abaixo do ideal, uma vez que foi baseada em 2 observações por tecnologia, a discriminação alélica usando sondas TaqMan foi cerca de duas ou três vezes menos caro do que qualquer outra tecnologia estudada. variação de custos dentro de uma tecnologia ou entre as tecnologias pode ser devido a diferentes procedimentos. Na verdade métodos não eram estritamente idêntica, mesmo em laboratórios usando uma tecnologia similar, e foram relatados vários graus de otimização. Um exemplo foi o de gestão de procedimento de teste – o número de controlos positivos e negativos, o número de repetições, e o número de passos adicionais para o procedimento, tais como a migração em gel de produtos de PCR. Esses custos extras foram valorizados. equipamentos de custo referente a uma hipótese de saturação foi estabelecido à taxa de oito horas de trabalho por dia, durante cinco anos. Isso não poderia ser a verdadeira situação para alguns laboratórios e os custos estimados subestimados verdadeiros custos para os laboratórios. Além disso, de acordo com a hipótese de saturação do equipamento, assume-se que a expectativa de vida das máquinas foi semelhante para qualquer tipo de máquina, não havia informação disponível sobre a expectativa de vida real de máquinas. Ao todo microcosting dados sugeriu que “in-house” custos tecnologias foram muito menores do que os kits comerciais, excluindo os custos de equipamento e trabalhistas.
Conclusão
A população francesa era 65,027 milhões de habitantes em 2011. Vinte e oito centros de genética molecular regionais, abrangendo todos os territórios e coordenando 46 laboratórios estão agora envolvidos na análise de 16.000
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testes para câncer colorretal metastático cada ano. Toda a rede é gerenciada nacionalmente pelo Inca. Este programa de controle de qualidade foi a primeira experiência nacional com 120 amostras similares que estão sendo analisados por 40 laboratórios diferentes. Nossos resultados demonstram que, quando os resultados clinicamente relevantes são considerados 82,5% dos laboratórios identificou corretamente o
estado mutacional do KRAS
em todas as amostras FFPE. Este trabalho também sugere que, embora todos os métodos são adequados para
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testes com um custo médio de € 35 por teste excluindo as etapas pré-analíticas, existem diferenças em termos de sensibilidade e robustez. A escolha do método é provável que dependem do equipamento e conhecimentos técnicos disponíveis localmente. Este programa de qualidade forneceu uma imagem de linha de base de
KRAS
testes na França. Ele mostrou que é possível a um custo reduzido para definir um programa de âmbito nacional, identificou erros em procedimentos de teste para alguns laboratórios sublinhando a importância de otimização, processos de validação e controle de qualidade em casa usando um grande painel de mutações.
Informações de Apoio
Informação S1.
Detalhes do material e métodos
doi:. 10.1371 /journal.pone.0068945.s001
(DOC)
Tabela S1.
Mostra as informações detalhadas genótipos para amostras FFPE pelo laboratório (N = 40). A melhor
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resultados foram mantidos em laboratório, utilizando mais de uma tecnologia
DOI:. 10.1371 /journal.pone.0068945.s002
(XLSX)
Reconhecimentos
Agradecemos Francês National Cancer Institute e do STIC 2008, Audrey Didelot, Claire Mulot, Karine Pallier pelo seu apoio financeiro e técnico. Agradecemos aos patologistas que examinaram as 24 HES lâminas para avaliação percentual de células tumorais Frédéric Bibeau (Centro Val d’Aurelle, Montpellier), Pascale Cervera (Hôpital St-Antoine, Paris), Françoise Piard (CHU de Dijon), Jean-Christophe Sabourin (CHU de Rouen), Jannick Selves (Hôpital Purpan, Toulouse) e Frédérique Penault-Llorca (Centre Jean Perrin, Clermont-Ferrand)
os membros do grupo colaborativo MOKAECM são:. Marie-Pierre Gaub; Isabelle Soubeyran; Hugues Begueret; Frédérique Penault-Llorca; Agnès Hardouin; Françoise Piard; Jean Mosser; Cédric Le Marechal; Chantal Delvincourt; Christine Clavel; Christophe Ferrand; Olivier Schischmanoff; Nathalie Theou-Anton; Antoinette Lemoine-Corbel; Lascols Olivier; Hugues De A;