Abstract

cancros humanos sobre-expressão

mdm2

, através de um T à variação G em um polimorfismo de nucleotídeo único na posição 309 (

mdm2

SNP309), tem funcionalmente p53 inativado que não é efetivamente degradada. Eles também têm alta expressão da transcrição de splicing alternativo,

mdm2-C

. Splicing alternativo

MDM2

transcrições são expressas em muitas formas de cancro humano e quando eles estão exogenamente expressa eles transformam células humanas. No entanto, nenhum estudo até à data detectou isoformas da proteína MDM2 endógenos. Estudos com expressão exógena de variantes de processamento têm sido realizados com o

mdm2-A

e

mdm2-B

, mas o

mdm2-C

isoforma se manteve praticamente inexplorado. Nós abordado a influência celular de exogenamente expressou MDM2-C, e perguntou se endógena de proteína MDM2-C estava presente em cânceres humanos. Para detectar a proteína MDM2-C endógena, criamos um anticorpo MDM2-C humano para a emenda junção epitopo de exons quatro e dez (MDM2 C410) e validado o anticorpo com

in vitro

traduzido MDM2 de comprimento total em comparação com MDM2 -C. Curiosamente, descobrimos que a MDM2-C co-migra com MDM2-FL em aproximadamente 98 kDa. Usando o anticorpo C410 validada, que detectada uma elevada expressão endógena de MDM2-C em linhas celulares de cancro humano e tecidos de cancro humano. No receptor de estrogênio positivo (ER +)

mdm2

G /G SNP309 linha de células de cancro da mama, T47D, observou-se um aumento da proteína MDM2-C endógeno com o tratamento com estrogênio. MDM2-C localizada para o núcleo e o citoplasma. Foi examinada a actividade biológica de MDM2-C por exogenamente que expressam a proteína e observou-se que a MDM2-C não alvo para a degradação de p53 eficazmente ou reduzir a actividade transcricional de p53. expressão exógena de MDM2-C em

p53

células cancerosas humanas -null aumento da formação de colónias, indicando propriedades tumorigénicas independente de p53. Os nossos dados indicam um papel para MDM2-C, que não requer a inibição de p53 para aumentar a proliferação de células cancerosas e sobrevivência

citação:. Okoro DR, Arva N, Gao C, Polotskaia A, Puente C, H Rosso , et ai. (2013) endógeno humano MDM2-C é altamente expresso em cancros humanos e funciona como um activador Crescimento p53-Independent. PLoS ONE 8 (10): e77643. doi: 10.1371 /journal.pone.0077643

editor: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos da América

Recebido: 21 de novembro de 2012; Aceito: 12 de setembro de 2013; Publicação: 11 de outubro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Okoro et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da National Science Foundation (MCB- 0.744.316), uma bolsa da Fundação de Pesquisa de cancro da mama, e uma bolsa da Clínica Translational Science Center (CTSC) TR000457 do Centro Nacional para a Promoção da Ciência Tranlsational dos Institutos Nacionais da Saúde para J. Bargonetti. Também foi tornado possível em parte por uma concessão de infra-estrutura para Hunter College, número de concessão MD007599 do Instituto Nacional sobre Minority Saúde e Saúde Disparidades, um componente do National Institutes of Health (NIH). O seu conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente a posição oficial do NIMHD ou NIH. FAZ. foi parcialmente financiado por um ímã Award CUNY e M.R. foi apoiado pelo Programa MBRS-subir para Hunter College 3R25-GM060665. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a actividade oncogénica de MDM2 está associada com sobre-expressão da proteína MDM2 em cancros humanos [1-3]. Enquanto algumas isoformas MDM2 pode formar uma associação físico direto com p53 outros não [3,4]. MDM2 regula a proteína p53 através mediada por proteossómica degradação [5-10] e repressão da transcrição [5,11-14]. Esta actividade oncogénica mediada por p53 de MDM2 é melhor referido como funções canónicas MDM2. No entanto, a MDM2 também é conhecido por possuir funções independentes da p53 [15-19], que são melhor referidos como funções de MDM2 não canónicas.

A sobre-expressão de MDM2 devido a um polimorfismo de nucleotídeo único de timina para guanina (T para G) na posição 309 do

MDM2

gene (

mdm2

SNP309) está associada a aumento da incidência e agressividade [20-23] câncer. Este

MDM2

mudança SNP309 nucleotídeo aumenta a afinidade de ligação para o factor de transcrição constitutiva, Sp1 [21]. Células homozigotos para o G /L

mdm2

SNP309 têm reforçado

níveis mdm2

de transcrição e proteínas de alta MDM2. MDM2 sobre-expressão em cânceres é muitas vezes acompanhada com a expressão ao longo de splicing alternativo

mdm2

transcrições [3,24-28]. Mais de 40 humana, alternativamente e aberrante emendados

MDM2

transcrições foram relatados, no entanto nem todos são o osso resultado fide de eventos de splicing alternativo [29]. Não obstante, o

MDM2

variantes de processamento representam potencial de diversidade que concorda com as conclusões da Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) consórcio do projecto. CODIFICAR destaca elementos anteriormente não reconhecidas candidatos reguladoras, e mensagens codificadas, no genoma humano [30]. A diversidade de

MDM2

spliced ​​mensagens codificadas a partir de dois promotores independentes tem a capacidade de aumentar o proteoma cancro humano [31]. Portanto, não é surpreendente que

mdm2

células SNP309 demonstram o aumento da diversidade em suas splicing alternativo

mdm2

transcritos com expressão substancial do

mdm2-C

transcrição [32].

Apesar de mais de 40

mdm2

transcritos de splicing alternativo foram identificados [29], apenas cinco, (

mdm2-A

através de

mdm2-E

) têm sido mostrados para expressar a proteína

in vitro

[3]. A expressão destes cinco

MDM2

transcritos faz com que as células NIH3T3 para formar focos associado ao tumor [3]. No entanto, apenas duas isoformas da proteína MDM2,-A e B, têm sido extensivamente estudados para as suas funções biológicas. A expressão exógena de MDM2-A [33,34], ou MDM2-B em ratos [35], aumenta a formação de tumores em um

p53

-null, ou o fundo comprometida-p53 causando um espectro de tumor alterada. No entanto, a função biológica do MDM2-C permanece indeterminada.

Nós perguntamos se as células cancerosas que expressam elevados níveis de

mdm2-C

mRNA expressa a proteína MDM2-C endógeno. Trabalhamos com a hipótese de que altas

mdm2-C

níveis de transcrição codificados do alelo G

mdm2

SNP309 em cancros humanos resultaria em altos níveis de proteína MDM2-C endógeno e conferiria funções oncogênicos. As células com sobre-expressão de MDM2 através da L /L

MDM2

SNP309 tem a proteína p53 estável, que é co-localizado com o p53 na cromatina [14]. Assim, a hipótese de que MDM2 sobre-expressão através da G /G SNP309 pode produzir uma isoforma da proteína MDM2-C que não iria degradar p53. Portanto, partimos para determinar a função celular de exogenamente expressou MDM2-C. Pedimos também que se as células cancerosas que expressam altos níveis de proteína MDM2-C endógena

mdm2-C

mRNA, também expressou.

expressão endógena de proteína MDM2-C nunca foi detectado devido à ausência de anticorpos que detectam especificamente as isoformas de MDM2 feitos a partir dos mRNAs de splicing alternativo. O

C-MDM2

transcrição não contém os exões 5 a 9, que codifica uma parte do domínio de ligação a p53. Nós criamos um anticorpo específico projetado para detectar os aminoácidos codificados flanqueando MDM2-C exons 4 e 10, que nós chamados C410. Usando este anticorpo MDM2 observamos altos níveis basais de proteína MDM2-C endógeno em vários MDM2 sobre-expressar linhas celulares de cancro e tecidos. Observamos também que, na presença ou ausência de p53, exogenamente expressou MDM2-C promove o aumento da formação de colónias. Tomados em conjunto, os nossos resultados indicam que endógena MDM2-C é expresso em cancros e que as funções de MDM2-C de forma independente de p53 para promover a tumorigénese.

Resultados

MDM2 sobre-expressando células têm altos níveis de transcrições mdm2-C

Muitas linhas de células humanas de câncer sobre-expressar a proteína MDM2 e têm sido utilizados para estudos de MDM2 anteriores [14,21,32,36,37]. Usamos estas linhas celulares para examinar a relação entre a

mdm2-C

transcrições para full-length

mdm2

transcrições. As linhas celulares examinadas incluem dois expressores elevados MDM2: células SJSA-1 com o tipo selvagem

p53

e sobre-expressão de MDM2 devido ao

amplificação mdm2

gene (e

mdm2

alelos SNP309 T /T) e as células Manca com o tipo selvagem

p53

e sobre-expressão de MDM2 do

mdm2

alelos SNP309 G /L. Eles também incluem duas expressores baixas MDM2: a linha de células K562 que é

p53

-null e tem um

MDM2

alelos SNP309 T /G e as células ML-1 com o tipo selvagem e p53

mdm2

alelos SNP309 T /T.

transcrição de

C-MDM2

foi avaliada por transcrição inversa quantitativa da reacção em cadeia da polimerase (qRT-PCR), e análise da mancha Northern (ver Figura 1 e Figura S1). A quantificação do total

MDM2

transcrições, por análise de Northern blot, mostrou o mais alto nível de

mdm2

transcritos em células SJSA-1, que contêm 25 cópias do

mdm2

gene [37]. Um alto nível de

mdm2

transcrição também foi observado em células manca. Para quantificar especificamente transcritos contendo exons 6 e 7, foram realizadas qRT-PCR com uma sonda quantitativa à junção exão 6-7 (Figura 1B ver sonda em barras pretas verdes e Figura 1C). Para quantificar especificamente

C-MDM2

transcritos, foi utilizado um iniciador directo de PCR concebidos para reconhecer o exão 4, e o exão 10, junção (chamado 04:10) e um iniciador inverso ao exão 12 (Figura 1B, ver iniciadores em vermelho, e barras cinzentas Figura 1C). Em células Manca, detectamos a expressão de baixo nível do

mdm2

transcrição contendo exons 6 e 7, a partir de agora referido como um

mdm2

transcrição de corpo inteiro (Figura 1C). É importante ressaltar que as células Manca teve expressão de alto nível do

mdm2-C

transcrição resultando em um índice mais baixo de todo o comprimento de

mdm2-C

transcrição (Figura 1C, MANCA comparar preto ao cinza Barra). Isso foi em contraste com o

mdm2

transcrição em células SJSA-1, que produziram níveis semelhantes de

mdm2-C Comprar e

MDM2

transcrições de corpo inteiro (Figura 1C, SJSA -1 comparar preto para barras cinzentas). Os baixos níveis de

MDM2

transcritos foram produzidos em células K562 e, por conseguinte, estas células foram utilizadas como linha de células normalizador. células ML-1 mostrou

mdm2

níveis de transcrição semelhantes a K562. Isto indicou que a sobre-expressão da proteína MDM2 em células SJSA-1 e células Manca correlacionadas com níveis elevados da

mdm2-C

transcrição. Além disso, as células Manca teve a maior proporção de

mdm2-C

a transcrição de corpo inteiro. Este resultado pode ser devido ao

mdm2

SNP309 G /G genótipo que dirige a transcrição a partir do promotor P2 inducible

.

A. A determinação quantitativa usando o Image J após a análise de transferência de Northern de ARN a partir de amostras não tratadas MANCA, SJSA-1, ML-1 e de células K562. Um

mdm2

sonda de DNA ao exão 12 foi gerada por PCR e radiomarcado com α

32P dCTP. níveis de transcrição foram comparados com K562 para a expressão basal e normalizadas para os níveis de ARN para

GAPDH

. Uma média de quatro experiências independentes é mostrado. As barras de erro indicam o erro padrão.

B. Esquemática de

MDM2

mensagens detectadas utilizando uma sonda Taqman para exons 6 e 7 (6-7 sonda) ou iniciador directo para 04:10 e primer para 12 reversa (4: 10-12 primário) para o

mdm2-C

.

C. qRT-PCR com 4:10 para a frente e exão 12 inversa vs. sonda Taqman ao exão 6 e 7 do

mdm2

foram realizados para detectar

mdm2-C Comprar e

mdm2

(com exons 6 e 7) transcrições. O

mdm2-C

transcrições foram detectados via Syber verde e

mdm2

(com exons 6 e 7) as transcrições foram detectados através da tecnologia Taqman. níveis de transcrição foram comparados com K562 para a expressão basal e normalizadas para os níveis de ARN para

GAPDH

. Uma média de três experimentos independentes é mostrado. As barras de erro indicam o erro padrão.

D. qRT-PCR do ARN utilizando a tecnologia Taqman de genes alvo p53,

p21

e

puma

após o tratamento com danos no DNA 8um etoposido durante 3 horas. Os dados de cada linha de células é apresentado como normalizados para a sua própria amostra de controlo não tratada para a activação de dobragem e normalizadas para os níveis de ARN

GAPDH. Uma média de três experimentos independentes é mostrado. As barras de erro indicam o erro padrão.

A fim de ver se o

mdm2

full-length para

mdm2 C-

relação transcrição influenciado a resposta p53, comparamos a ativação de dois genes alvo p53,

p21

e

puma

. Nós tratada K562, ML-1, SJSA-1 e manca células com etoposídeo para iniciar uma resposta danos no DNA, e monitorados

p21

e

puma

activação por qRT-PCR (Figura 1D). Como esperado, o

p21

e

puma

genes não foram ativados em

p53

-null K562 células. Nas células SJSA-1 e manca, que têm o tipo selvagem p53 e MDM2 alta, o

p21

e

puma

genes demonstraram activação do gene comprometida em comparação com a activação detectada em células ML-1 , com células Manca menos que demonstra a actividade de p53 (Figura 1D).

Mdm2

splicing alternativo produtos, tais como

mdm2-B

aumentar após danos no DNA [38-40]. Para determinar se o

C-MDM2

transcrição foi induzida por p53, as células tratadas com etopósido foram analisados ​​por qRT-PCR para

C-MDM2

. As células ML-1 responderam ao tratamento etoposídeo com um aumento robusto em

mdm2-C

níveis de transcrição (Figura S2, barra vermelha). Comprometida a activação mediada por p53 de

C-MDM2

foi observada nas células SJSA-1 e manca semelhantes a activação comprometidos observada para

puma

(Figura S2 e Figura 1D). Estes dados mostram que a actividade de transcrição de p53 foi comprometida na sobre-expressão de MDM2 células e os seus níveis basais de alta

C-MDM2

(especialmente em células manca) foi p53-independente.

Validação de MDM2-C anticorpo específico

Para determinar se o alto nível de

mdm2-C

transcrições em MDM2 sobre-expressando células foi traduzido em proteína, que gerou um MDM2-C anticorpo policlonal específico. Nós imunizados coelhos com uma sequência peptídica contendo a sequência de aminoácidos do exão humano 4-10 junção de processamento (Figura 2A). O peptídeo foi altamente imunogênica e o anticorpo foi validado para a especificidade utilizando

in vitro

proteínas MDM2 traduzido em extrato de germe de trigo. Ambos MDM2-C, e MDM2-FL, pode ser traduzido

In vitro

em proteína [3,41]. A adição de

35S metionina no sistema permitiu-nos detectar rapidamente as proteínas MDM2 especificamente rotulados utilizando auto-radiografia (Figura 2B). A

35S metionina rotulada MDM2-C e proteínas MDM2-FL migraram em SDS-PAGE em tamanhos pré-determinados (descrito como maior do que os tamanhos previstos de 36 kDa e 55 kDa, respectivamente) [41,42]. A mobilidade mais lenta de MDM2 em SDS-PAGE foi anteriormente atribuído ao domínio grande da proteína ácida [42].

A. Esquemático de MDM2 de comprimento total (FL-MDM2) e MDM2-C. bioquímicas domínios funcionais das proteínas acumulados são mostrados como códigos de cores. A sequência peptídica utilizada como um imunogénio contendo a junção de processamento de MDM2-C humano é mostrada. resíduos de glicina (G) e cisteína (C) foram adicionados ao terminal N do péptido para facilitar a conjugação a uma proteína imunorreactiva, hemocianina de lapa Fissurella (KLH).

B.

35S metionina foi usado como uma fonte de radioactividade para rotular

em

proteínas traduzidas in vitro

.

Em

vitro

traduções de pcDNA3-mdm2-FL e pcDNA3-P2mdm2-C usando o TNT acoplado sistema extrato de germe de trigo. Resultando proteína MDM2-FL e MDM2-C foram sujeitos a electroforese a10% SDS-PAGE em uma relação de 5: 1: 1. O gel foi transferido para uma membrana de nitrocelulose e exposto a película durante a detecção de produto de proteína significativa MDM2-C. O germe de trigo sem lisado de ADN foi utilizada como um controlo negativo.

C. Imunoprecipitação de

35S metionina radioactivo marcado com

em

vitro

traduzido MDM2-FL e proteínas MDM2-C usando MDM2 C410 e anticorpos séricos policlonais pré-imunes. rácios de proteína, como mostrado em B foram usadas no ensaio de puxar para baixo. As amostras foram sujeitas a electroforese num gel de SDS-PAGE a 10% transferidos para uma membrana de nitrocelulose e expostos a película para a detecção de proteínas. Este é representativa de três experiências independentes.

D.

Em

vitro

traduzido proteína feita em ligado de reticulócitos de coelho (RRL pistas 1 e 2) foram comparados com proteína traduzida no extrato de germe de trigo (WGE pistas 3 e 4). Estas proteínas foram detectadas quer com anticorpo 4B11 (painel superior) ou 2A9 (painel inferior). HRP-conjugado anti-rato e anti-coelho foram usados ​​como anticorpos secundários.

Para validar ainda mais a especificidade do anticorpo MDM2-C, foi realizado um experimento imunoprecipitação do extracto de gérmen de trigo

in vitro

traduzido

35S radiomarcados produtos de proteína MDM2-C e MDM2-FL. O anticorpo policlonal MDM2 C410 puxado para baixo MDM2-C (Figura 2C, comparar pistas 3 e 8), mas não MDM2-FL (Figura 2C, comparar as pistas 4 e 9). Além disso, a MDM2 e MDM2-C-FL

In vitro

proteínas traduzidas foram imunoprecipitadas utilizando o anticorpo policlonal C410 MDM2 e analisados ​​por Western blot com anticorpo monoclonal MDM2 mistura. Apenas a proteína MDM2-C foi detectado (Figura S3, compare as faixas 2 e 3).

A fim de abordar mais a fundo a migração diferencial da MDM2-C e MDM2-FL, comparou-se a imuno-reactividade de

in vitro

proteínas traduzidas feitas tanto ligado de reticulócitos de coelho (RRL) e sistemas de extracto de gérmen de trigo (WGE). Quando as proteínas são traduzidas

in vitro

, eles são modificados após a tradução pelos fatores representados no sistema extrato celular. Como previsto, o anticorpo monoclonal do terminal C 4B11 detectado isoformas MDM2-FL MDM2-C e enquanto o anticorpo 2A9, tendo como alvo a região central, detectada apenas a MDM2-FL (Figura 2D, compara painéis de topo e de fundo para as pistas 1 e 3 contra pistas 2 e 4). Curiosamente, a MDM2-C produzido no sistema RRL mamífero resultou em elevada expressão de três espécies diferencialmente migração em electroforese de SDS-PAGE com uma forma de co-migrando com MDM2-FL em aproximadamente 98 kDa (Figura 2D, comparar pista 1 para a pista 2 ). Foram examinados os potenciais mais modificações pós-translacionais de MDM2-C em células humanas (e a migração de MDM2-C a cerca de 98 kDa), utilizando um

In vitro

sistema de tradução HeLa a partir de Pierce (Figura 3A e 3B ). É importante, neste sistema, é também detectada uma forma de MDM2-C a cerca de 98 kDa. Os nossos dados indicam claramente que algumas das isoformas da proteína MDM2-C produzido neste sistema de co-migra com MDM2 humanos-FL. Assim, fornecendo a evidência de que a detecção de MDM2 por anticorpos que podem interagir com o comprimento total e as isoformas de variantes de splicing resultará em, pelo menos, alguns polipéptidos co-migrando em um western blot. Curiosamente, usando o sistema de HeLa, que, pela primeira vez, detectada alguma proteína MDM2-C com o peso molecular previsto de 36 kDa (Figura 3B pista 1).

Immunoprecipitation usando MDM2 C410 e anticorpos do soro policlonal pré-imunes com HeLa

em

vitro

traduzido MDM2-C extratos utilizando soros imunes pré, MDM2 C410 e N-20 policlonal anticorpos. As amostras foram sujeitas a electroforese num gel de SDS-PAGE a 10%, em duplicado. A. Uma metade foi corado com azul coomassie para a detecção de proteínas. B. Amostras de meio de gel foram transferidas para membrana de nitrocelulose e MDM2 foi detectada com o anticorpo monoclonal 4B11. HRP-conjugado anti-rato foi utilizada como anticorpo secundário. As setas mostram a proteína MDM2-C.

MDM2-C proteína é expressa endogenamente

Enquanto splicing alternativo

Mensagens de MDM2

foram detectados em cancros, não há documentação sobre polipeptídeos endogenamente produzidos a partir de tais mensagens . Comparou-se a natureza co-migração de MDM2-C e MDM2-FL usando a imunorreactividade variável de extractos de células de cancro humano, sondados com anticorpo policlonal de MDM2 C410 (para a detecção de MDM2-C) para os mesmos extractos sondados com o rato pan-reactivo MDM2 anticorpo monoclonal 4B11 (para a detecção de MDM2 e MDM2-C-FL). Elevados níveis de expressão de MDM2 foram observadas em extractos MANCA e SJSA-1 de células com o anticorpo 4B11 (Figura 4A, pistas 9 e 10). células Manca produziu a maior expressão de MDM2-C, quando detectado com C410 (Figura 4A, pista 1). O anticorpo policlonal de MDM2 C410 mal detectado MDM2-C em células ML-1 (Figura 4A, pista 3). No entanto, é reconhecido proteína MDM2-C nos extractos celulares a partir de células K562, que são células de genótipo G /T, bem como em células de SJSA-1 que possuem um gene de amplificação (Figura 4A, pistas 2 e 4). A expressão de MDM2-C em células ML-1 e células Manca correlacionado com a transcrição basal de

MDM2 de comprimento total e

C-MDM2

(comparar com a figura 1C a Figura 4A). Por razões que permanecem obscuras, uma correlação específica entre os

MDM2

transcrições e isoformas da proteína MDM2 não era aparente para células SJSA-1 e células K562. Isto pode ter sido devido à proporção de proteína MDM2-FL com a variante de splicing, e subsequente degradação mediada E3 ubiquitina-ligase de proteínas MDM2 que reduziram a estabilidade da proteína.

. A análise Western blot de extractos de células completas a partir de: MANCA, SJSA-1, ML-1 e células K562. Os níveis de proteína MDM2-C foram analisados ​​através de anticorpos do soro policlonal MDM2 C410 (C410, pistas 1-4) e MDM2 total foram detectados com o anticorpo monoclonal 4B11 (pistas 9-12 e longa exposição para pista 12). Actina foi utilizado como um controlo de carga. soro policlonal pré imune foi usado como controlo negativo. anti-ratinho conjugado com HRP e anti-coelho foram utilizados como anticorpos secundários. Este é representativa de três experiências independentes.

Bi. As células foram lisadas Manca quer como extratos de células inteiras (WCE) ou em citosólica compartments- celular (CYTO) e cromatina (CHR). As proteínas foram detectadas como em A. níveis de proteína MDM2-C foram analisados ​​por meio de anticorpos de MDM2 C410 soro policlonal C410, (pistas 1-3) e MDM2 total foram detectados com o anticorpo monoclonal 4B11 (pistas 1-9 e longa exposição a pista 9).

Bii. Tubulina e fibrilarina foram usadas para mostrar eficiente fraccionamento celular do extracto.

C. Spinning disco de microscopia confocal de células manca. As células foram fixadas, permeabilizadas e incubadas com p53, MDM2 C410 e anticorpos policlonais de soro pré-imune. As lâminas foram incubadas com secundário de cabra Alexa-conjugado anti-coelho de cabra conjugado com FITC anti-ratinho. DAPI foi utilizado para corar os núcleos celulares. Fotos foram tiradas em 60X de ampliação. As setas indicam regiões de localização nuclear da proteína Mdm2-C.

A expressão elevada de MDM2-C em células Manca sugeriu que a proteína seria claramente detectável nos compartimentos celulares. Foi examinada a localização de endógena MDM2-C usando métodos de fraccionamento de células (Figura 4B) e do disco de fiação microscopia confocal (Figura 4C). Usando métodos de fraccionamento cromatina, detectou-MDM2-C no citoplasma e na cromatina (Fig. 4Bi, pistas 1-3) e a maioria das isoformas de MDM2 detectados com 4B11 foram no citoplasma (Fig. 4Bi, pistas 7-9 ). Exogenamente isoformas expressa MDM2 e MDM2-A-B tenham sido previamente demonstrado que exibem localização nuclear [43], apesar do facto de que as regiões que codificam para os sinais de localização nuclear de MDM2 e exportação são unidas para fora. Da mesma forma, a MDM2-C, que também tem as seguintes regiões de splicing para fora, localizada no citoplasma e núcleo dessas células hematopoiéticas (comparar DAPI e anticorpo área manchada na Fig. 4ci-III sondadas com C410 e Fig 4Cvi-VIII sondadas com pré-imune soro de coelho). Manca células expressam níveis elevados de proteína p53 de tipo selvagem [14], e observou-se algum co-localização das proteínas p53 e MDM2-C no citoplasma e núcleo como indicado pela cor amarela de intercalação (Fig. 4CV). Embora a importância da co-localização não é imediatamente compreendido, acreditamos que é uma observação importante. As setas vermelhas apontam para coloração de anticorpos forte que representa uma observação consistente de proteína localizada a áreas nucleares discretas (Fig. 4Ciii e 4CV). Uma vez que as células hematopoiéticas Manca são pequenos e não têm muito citoplasma, foi possível que o que apareceu foi citoplasmática na periferia do núcleo. Portanto, nós examinamos a localização MDM2-C em células epiteliais de cancro da mama e também observaram nuclear e citoplasmática MDM2-C localização (Figura 5C).

A. As células MCF-7 e T47D foram semeadas e tratadas com 10 nM de estrogénio (E2) durante cinco dias. As células foram lisadas e as proteínas foram analisadas através de Western blot. anticorpo anti-soro de coelho policlonal C410 MDM2 foi utilizado para a detecção de proteínas. soro policlonal pré-imune foi usado para detectar o sinal de fundo. anti-ratinho conjugado com HRP e anti-coelho foram utilizados como anticorpos secundários. Actina foi utilizado como um controlo de carga. Este é representativa de três experiências independentes.

Bi. As células MCF-7 e T47D foram lisadas por células inteiras ou extractos de fraccionamento de cromatina. 50 ug de amostras foram resolvidas usando 10% de SDS-PAGE e MDM2 C410 soros policlonais (pistas 1 – 6) e o anticorpo monoclonal de MDM2, 4B11 (pistas 13 – 18) foram utilizados para a detecção de proteínas. Pré imune foi usado para detectar o sinal de fundo (pistas 7 – 12). Os anticorpos secundários utilizados foram os mesmos que em A.

Bii. Tubulina e fibrilarina foram usadas para determinar a pureza do fraccionamento.

C. microscopia de disco giratório de células MCF-7 e T47D. As células foram cultivadas sobre lamelas e tratou-se com 10 nM de E2 durante cinco dias. As células foram fixadas e incubadas com o anticorpo p53 e anticorpo policlonal C410 Mdm2 para a detecção de proteínas. soro pré-imune foi usado como um controlo negativo para a coloração. As lâminas foram incubadas com secundário de cabra Alexa-conjugado anti-coelho de cabra conjugado com FITC anti-ratinho. DAPI foi utilizado para corar os núcleos. As células foram visualizadas em 60X de ampliação. Setas representam regiões de localização MDM2-C.

MDM2-C aumenta com o tratamento com estrogênio e se localiza focos pontuada distinta no citoplasma e núcleo das células de cancro da mama ER +

MDM2 é elevada após o tratamento de estrogênio de receptor de estrogênio positivo (ER + ) cancro da mama células [36]. Além disso,

MDM2

knockdown em células de cancro da mama tratadas de estrogénio resulta em diminuição da proliferação, proporcionando assim evidência para a importância de MDM2 no crescimento de células do cancro da mama. A expressão ao longo de MDM2 está associado ao aumento

mdm2

emendados transcritos variantes [3,24-28]. Portanto, nós examinamos a expressão da proteína MDM2-C em duas linhas de células de cancro da mama ER +, MCF-7 e T47D, possuindo diferentes genótipos para

mdm2

SNP30

9

(T /G em relação G /G respectivamente) e

p53

(tipo selvagem contra o mutante respectivamente). Observou-se um ligeiro aumento na proteína MDM2-C, após o tratamento com estrogénio de células MCF-7 e T47D (pistas Figura 5A 2 e 4). A razão para a diferença de peso molecular das isoformas MDM2-C pode ser devido a diferenças em modificações pós-tradução em lisados ​​de células inteiras. O soro imune pré anticorpo policlonal foi utilizado como um controlo de fundo para o anticorpo C410 e MDM2 resultou em praticamente nenhuma detecção de proteína (Figura 5A pistas 5-8). Além disso, em células T47D,

C-MDM2

mensagem foi aumentada duas vezes após o tratamento com estrogénio (dados não mostrados). Nós fracionado as células e examinou frações citoplasmáticos e cromatina para a proteína MDM2-C (Fig. 5Bi para C410, coelho monoclonal reactividade 4B11 imunológico e rato pré e Fig. 5Bii para marcadores de pureza fração). A fracção citoplasmática não continham cromatina, como é evidente pela ausência de coloração fibrilarina e cada fracção mostrou alguma proteína MDM2 reactivo-C (pistas Fig. 5Bi 2 e 5). Curiosamente, a fracção da cromatina de células MCF-7 mostraram uma forte espécies reactivas de MDM2-C e menos proteína reactiva 4B11 (Fig. 5Bi, comparar pistas 3 e 15).

Para determinar se o tratamento com estrogénio influenciou a localização de MDM2-C em células MCF-7 e T47D, realizamos immunoflouresence. A MDM2-C em células MCF-7 foi detectada num teste padrão de difuso e citoplásmica pontuada e localização nuclear após o tratamento e antes de estrogénio (Figs. 5Cii e 5Cvii). Apesar de muito pouco p53 detectável nas células MCF-7 (fig. 5Civ e 5Cix), o p53 citoplasmática apareceu para co-localizar com a MDM2-C, como co-coloração foi detectada como um sinal de intercalação amarelo (Figs. 5Cv e 5Cx ).

A visualização de MDM2-C por immunoflouresence nas células T47D, antes e depois do tratamento com estrógeno, exibido coloração semelhante a células MCF-7 (Fig. 5Cxii e 5Cxvii). No entanto, as células T47D não demonstram a co-localização de p53 mutante e MDM2-C (Fig. 5Cxv e 5Cxx). A razão para esta diferença de co-localização de células MCF-7 e células T47D poderá residir no facto de estas linhas de células têm de tipo selvagem contra as proteínas p53 mutantes, respectivamente. Muitos exogenamente expressa MDM2 spliced ​​isoformas não interagem com p53 [43,44] e são conhecidos para unir a maioria do domínio de ligação a p53 [29]. Observou-se que as células T47D expressa p53 mutante predominantemente nuclear (Fig. 5Cxiv e 5Cxix) enquanto que as células MCF-7 expressam baixos níveis de p53 do tipo selvagem citoplasmática e nuclear [45].

MDM2-C é altamente expressa em tecidos lipossarcoma e do carcinoma da mama

expressão alta MDM2 é frequentemente observadas em lipossarcoma e é usado atualmente como um biomarcador de diagnóstico de câncer [46-49]. Estávamos interessados ​​em examinar se o anticorpo C410 seria útil para examinar a MDM2-C como um biomarcador lipossarcoma em amostras de doentes. Utilizou-se imuno-histoquímica (IHC) para testar a expressão de MDM2-C em tecidos lipossarcoma humano a partir de amostras de pacientes humanos. Para dois dos três conjuntos de amostras analisadas, a coloração positiva para MDM2-C, foi observado (imagem representativa mostrada na Figura 6A). O soro imune pré detectado baixo coloração de fundo e quando examinamos tecidos lipoma, foi detectada apenas baixa coloração positiva MDM2-C. Nós começamos estudos semelhantes utilizando tecido do cancro da mama micro-matrizes e detectaram MDM2-C no carcinoma ductal invasivo (Figura 6B). Usando imunohistoquímica, observou-se um padrão de coloração similar de tecidos positivos com MDM2 C410 e MDM2 4B11 anticorpo (Fig. 6BII e 6BII), enquanto IgG de rato não resultou em coloração de tecidos (Fig. 6Biii).

A. A imuno-histoquímica de lipoma e lipossarcoma tecidos utilizando MDM2 C410 e anticorpos policlonais de soro pré-imune. foram usados ​​anticorpo biotinilado secundário, ABC reagente e DAB da Vector Labs. Imagens foram obtidas em 20X e ampliação de 40x. H E refere-se a Hematoxilina e Eosina de contraste. Actina foi utilizado como um controlo de carga.

Informações de Apoio

Figura S1.