Abstract

As mutações no receptor do fator de crescimento epitelial

(EGFR)

, bem como em o alvo a jusante EGFR

KRAS

são frequentemente observadas no cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC). doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), um fator de risco independente para o desenvolvimento de NSCLC, está associada a um aumento da activação de EGFR. Neste estudo, determinou presença de

EGFR

e

KRAS

mutações de ponto de acesso em 325 pacientes com NSCLC consecutivos submetidos a

EGFR

e

KRAS

análise de mutação no definição de diagnóstico e para quem a função pulmonar foi determinada no momento do diagnóstico NSCLC. Informações sobre a idade no momento do diagnóstico, sexo, tabagismo, capacidade vital forçada (CVF) e volume expiratório forçado em 1 segundo (FEV

1) foi recolhido. doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC) foi definida de acordo com critérios GOLD 2013. Qui-quadrado, t de Student e regressão logística multivariada foram utilizados para analisar os dados. Um total de 325 pacientes com NSCLC foram incluídos, 193 com DPOC e 132 sem DPOC. DPOC não foi associada a presença de

KRAS

mutações de ponto de acesso, enquanto o

EGFR

mutações foram significativamente maiores em pacientes não DPOC NSCLC. Ambos sexo feminino (HR 2,61; IC 95%: 1,56-4,39; p 0,001) e tabagismo (HR 4,10; IC 95%: 1,14-14,79; p = 0,03) foram associados com

estado mutacional do KRAS

. Em contraste, apenas fumando (HR 0,11; IC 95%: 0,04-0,32; p 0,001) foi inversamente associado com o

estado mutacional EGFR

. Fumar relacionados G T e G transvers�s C foram significativamente mais frequente no sexo feminino (86,2%) do que no sexo masculino (61,5%) (p = 0,008). A mutação exão 19del foi mais frequente em não-fumantes (90%) em comparação com os fumantes atuais ou passadas (36,8%). Em conclusão,

KRAS

mutações são mais comuns em mulheres e fumantes, mas não estão associados com DPOC-status em pacientes com NSCLC.

EGFR

mutações são mais comuns em pacientes não-fumadores NSCLC

Citation:. Saber A, van der Wekken AJ, Kerner GSMA, van den Berge M, Timens W, Schuuring E, et al . (2016) Doença Pulmonar Obstrutiva Crónica não está associada a

KRAS

Mutações em Non-Small Cell Lung Cancer. PLoS ONE 11 (3): e0152317. doi: 10.1371 /journal.pone.0152317

editor: Melanie Königshoff, Comprehensive Pneumologia Center, Alemanha |

Recebido: 19 de novembro de 2015; Aceito: 11 de março de 2016; Publicação: 23 de março de 2016

Direitos de autor: © 2016 Saber et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

financiamento:.. os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

CONFLITO dE iNTERESSES:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) é associado com câncer de pulmão também após a contabilização de outras doenças respiratórias e tabagismo [1-2]. Um aumento do risco de câncer de pulmão em pacientes com DPOC era evidente em uma meta-análise [2]. Cerca de um terço dos fumantes com DPOC morreu de câncer de pulmão em um follow-up de 14,5 anos [3]. Por outro lado, 50-70% dos pacientes com câncer de pulmão tem DPOC acordo com os resultados de testes de função pulmonar no momento do diagnóstico [4]. Em um mais recente grande estudo prospectivo, a associação entre DPOC e câncer de pulmão foi explicado em grande parte pela [5] fumar. O odds ratio (OR) para pacientes com diagnóstico de DPOC de desenvolver câncer de pulmão no prazo de 6 meses foi de 11,4. No entanto, o OR caiu para 6,8 após correcção para [5] fumar. Isto é consistente com a noção de que a DPOC tenha sido reconhecida como um fator de risco independente para o desenvolvimento de câncer de pulmão [6].

KRAS está envolvido na regulação da proliferação celular [7]. Mutações no

KRAS

são encontrados principalmente em códons 12, 13 e 61 e resultar em ativação constitutiva da proteína [8].

KRAS

mutações são observados mais frequente em pacientes fumantes com adenocarcinoma (5-40%) do que nos outros subtipos de câncer de pulmão [7, 9]. Mutações no

KRAS

estão associados com pior prognóstico dos pacientes com NSCLC [10]. Além disso, uma inflamação das vias respiratórias da DPOC-like pode aumentar a carcinogénese do pulmão na presença do p.G12D

K-ras

activação mutação em um modelo de rato [11].

EGFR desempenha um papel crucial na cicatrização de feridas e reparação de tecidos no pulmão, especialmente na parede brônquica. Superexpressão de EGFR foi relatado na mucosa brônquica de indivíduos asmáticos não-fumadores comparados aos controles normais [12]. Além disso, a activação do EGFR prolongada leva a metaplasia [13]. A exposição de células epiteliais à fumaça do cigarro induzida fosforilação aberrante e activação de EGFR e isso pode posteriormente mediar o desenvolvimento de câncer de pulmão [14-15]. As mutações no domínio de cinase, também conduzir à activação da via EGFR independente de se ligar ao seu ligando [16]. Estes ativando

EGFR

mutações são comuns no cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) com uma frequência de cerca de 10-15% em caucasianos [17-18].

EGFR

mutações têm sido associadas com pacientes não-fumadores NSCLC [19]. A p. (L858R) no exão 21 (referido como L858R) e deleções no exão 19 (referido como 19del exão) dos

EGFR

genes são as mutações ativadoras mais comumente observados [20]. Nós já mostrou uma associação significativa entre o

mutações e evolução clínica [21] EGFR

.

In vivo

estudos em modelos de ratos condicionalmente que expressam tanto o L858R ou um exon19del alelo mutante do humano

gene EGFR

têm apoiado o papel dessas mutações na iniciação e desenvolvimento de câncer de pulmão [22] .

O tabagismo é um fator de risco conhecido para tanto DPOC e câncer de pulmão [23-24].

KRAS

mutações são descritas como uma assinatura para o tabagismo [25], enquanto que

EGFR

mutações são mais comuns em não-fumantes. Nossa hipótese é que

KRAS

mutações estão associados positivamente com o estatuto de DPOC em pacientes com NSCLC, enquanto activa

EGFR

mutações são negativamente associado com DPOC em pacientes com NSCLC. Para estudar esta hipótese que analisou pacientes com NSCLC rastreados para a presença de

EGFR

e

KRAS

mutações em um cenário de diagnóstico e investigaram se a presença de

EGFR

e

KRAS

mutações em pacientes com NSCLC foi relacionada com a DPOC.

Materiais e Métodos

Os pacientes

pacientes consecutivos com CPNPC avançado, diagnosticado entre novembro de 2008 e julho de 2012, e para quem

KRAS Comprar e

EGFR

análise de mutação foi realizada em um ambiente clínico, foram selecionados para este estudo. Nesta coorte foram selecionados mais pacientes para os quais estavam disponíveis dados de função pulmonar. Todos os pacientes tiveram estágio IV NSCLC e tinha um ou metástases mais visceral no momento do diagnóstico. Anteriormente, 165 dos pacientes com NSCLC foram descritos em um estudo sobre

EGFR

e

KRAS

mutações em relação ao resultado clínico [21]. Os pacientes com pós-transplante de pulmão NSCLC foram excluídos deste estudo. Para todos os pacientes, os dados sobre sexo, tabagismo (incluindo o ano pack se disponível), a idade no momento do diagnóstico, fase de diagnóstico de acordo com a 6

th edição TNM, localização de metástases, data de início e (diferentes) linhas de tratamento foram coletado. Os dados sobre a função pulmonar foi recentemente realizada para todos os pacientes incluídos neste estudo. Todos os procedimentos e protocolos foram realizados de acordo com as diretrizes para a boa prática clínica e após consentimento informado foi obtido de todos os pacientes.

Consentimento Informado e Ética

consentimento informado por escrito para o sangue e tecido tumoral de todos pacientes foi obtido antes biobanking. Este procedimento foi aprovado pela Comissão de Ética Médica do Centro Médico da Universidade de Groningen. Este estudo foi realizado em conformidade com as disposições da Declaração de Helsinki e as diretrizes de boas práticas clínicas. Para este estudo, todos os dados do paciente foram anónimas e a identificação removida antes da análise. Além da análise mutacional, testes de função pulmonar foram realizadas como parte da abordagem de diagnóstico de rotina e os resultados desses testes foi documentada no arquivo do paciente e se comunicava com os pacientes. Devido à natureza retrospectiva deste estudo, sob a lei holandesa para a investigação médica humana (OMM), sem permissão específica era obrigatória do Conselho de Revisão Institucional.

A função pulmonar testes

A espirometria foi realizada com um pneumotacógrafo diariamente calibrado (MasterscreenPneumo, Jaeger, Würzburg, Alemanha) de acordo com diretrizes padronizadas [26]. testes de função pulmonar são fornecidos após broncodilatador (salbutamol 100 microgramas). Os pacientes foram definidos como tendo DPOC se o volume expiratório forçado em 1 segundo (FEV

1) /capacidade vital forçada (CVF) (FEV1 /FVC) foi 0,70 com obstrução brônquica fixa ao longo do tempo não devido à obstrução tumoral endobrônquica. Estadiamento da DPOC foi realizada de acordo com critérios GOLD [27].

Histologia e

KRAS /EGFR

testes moleculares

Foram obtidas amostras de tumor, quer por broncoscopia, biópsias pulmonares transtorácica e /ou a partir de ressecções pulmonares. subtipagem histológica foi realizada de acordo com os critérios da OMS de 2004 [28]. A análise mutacional foi realizada como descrito anteriormente [21].

Estatísticas

Para dados distribuídos normalmente mostramos média e desvio padrão (SD) e usou um teste t de Student para determinar diferenças significativas. Para mediana de dados que não são normalmente distribuídos e gama são dadas e teste Qui-quadrado é usado para determinar a significância. A regressão logística foi realizada para estudar se a presença de DPOC tiveram qualquer efeito sobre

KRAS

ou

EGFR

estado mutacional usando o sexo, idade, histologia, e tabagismo como co-variáveis. A análise estatística foi realizada usando SPSS versão 22.0. Nominal

P

-Valores inferior a 0,05 foram considerados significativos. Os dados estão disponíveis na Tabela S1.

Resultados

As características dos pacientes e

KRAS

/

EGFR

mutações

Um total de 325 estágio pacientes IV NSCLC foram incluídos. Mais de 80% tinham adenocarcinoma, 174 (53,5%) foram 151 (46,5%) do sexo feminino e masculino. A média de idade no momento do diagnóstico foi de 63,6 (± 10,5 anos). Cento e cinco pacientes (32,3%) tinha um

KRAS

mutação. Para 1 em cada 105 doentes com um

KRAS

mutação, o tipo de mutação foi inconclusiva com um resultado PCR derretendo alta resolução positiva (GRH), mas com uma sequência de tipo selvagem com base no resultado sequenciamento Sanger. Para um paciente com um

EGFR

mutação, o

KRAS

estado de mutação não estava disponível. Os 219 pacientes restantes não tinham mutações no

KRAS e região hotspot. Vinte e nove pacientes (8,9%) teve um

EGFR

mutação. Em cinco pacientes, o

EGFR

estado mutacional não estava disponível; quatro destes pacientes tinha um

KRAS

mutação. Os outros 291 pacientes não têm

EGFR

mutações nas regiões de ponto de acesso. A idade média dos homens era mais elevada do que a média de idade de fêmeas (66,3 ± 9,8 anos vs. 60,5 ± 10,5 anos; p 0,001). Os machos apresentaram maior número significativo de anos-maço de fumar do que as fêmeas (média de 37,5 ± 20,6 anos-maço vs 30,1 ± 15,7 anos-maço; p = 0,015).

As características dos pacientes com DPOC em subgrupos estratificados

quase 60% (193/325) dos doentes com NSCLC tinha DPOC. Dois terços dos casos de DPOC eram do sexo masculino. A distribuição das fêmeas era quase igual em DPOC e grupos não-DPOC (Tabela 1). idade no grupo DPOC média foi maior, com 65,6 anos (± 9,9 anos) em comparação com o grupo não-DPOC com 60,6 (± 10,8 anos) (p 0,001). Encontramos uma relação significativa entre o tabagismo e DPOC, 62,6% dos fumantes atuais ou passados ​​tinham DPOC, enquanto apenas 18,2% dos não-fumantes tinham DPOC (p 0,001). Um modelo de regressão logística para a DPOC usando o sexo, idade e tabagismo como co-variáveis ​​revelou associação significativa com a idade (hazard ratio [HR] 1,05; 95% intervalo de confiança [IC]: 1,02-1,07; p 0,001) e tabagismo (HR 8,28; 95 % CI:. 2,61-26,24; p 0,001), mas não com sexo (Tabela 2)

DPOC e tumorais

KRAS /EGFR

mutações hotspot

KRAS

mutações foram observados mais frequentemente no sexo feminino em relação ao masculino (65/151 (43%) versus 40/173, (23%); p 0,001) e também mais frequentemente em atual ou passado fumantes (34,5%) do que em não-fumantes (13,6%) (p = 0,045) (Tabela 3).

KRAS

mutações não foram significativamente diferentes entre DPOC (34,2%) e os pacientes não-portadores de DPOC (29,8%) (Tabela 1), a presença sothe de

KRAS

mutações eram independentes da DPOC. Estratificação de acordo com FEV1 /FVC e estágio Ouro não revelou associação significativa com a presença de

KRAS

mutação (Fig 1A e 1B). No entanto, a porcentagem de FEV1 como uma variável contínua foi significativamente relacionado com a presença de

KRAS

mutações (Fig 1C), mas não em uma análise multivariada. Colocando as variáveis ​​(sexo, idade, tabagismo e DPOC) em um modelo de regressão logística confirmou a associação significativa entre

KRAS

mutações de ponto de acesso com o sexo feminino (HR 2,61; IC 95%: 1,56-4,39; p 0,001) e fumo (HR 4,10; IC 95%: 1,14-14,79; p = 0,03). (Tabela 2)

(A) FEV1 /FVC, (B) classificação DPOC OURO e (C) FEV1 percentual em

KRAS

pacientes mutantes e de tipo selvagem com NSCLC.

AP-valor foi calculado pelo teste t de Student.

BP-valor foi calculado pelo teste do qui-quadrado.

EGFR

mutações mostrou uma tendência para uma maior frequência em mulheres em comparação aos homens, (p = 0,073). Dez dos 22 (45,5%) não-fumantes tinha ativando

EGFR

mutações, enquanto que apenas 19 dos 289 (6,5%) dos fumantes atuais ou passadas teve um

EGFR

mutação (p 0,001).

EGFR

mutações foram observadas mais frequentemente nos não-DPOC (20/131, ou seja, 15,3%) como comparado com o grupo de DPOC (9/189, ou seja, 4,8%) (p = 0,001) (Tabela 3) . Usando sexo, idade, tabagismo e DPOC como co-variáveis ​​em um modelo de regressão logística para

EGFR

mutações, associação confirmedsignificant inversa entre tabagismo (HR 0,11; IC 95%: 0,04-0,32; p 0,001), e

EGFR

mutacional status (Tabela 2).

DPOC e tipo de

KRAS /EGFR

mutações

O

KRAS

p. (G12C) foi a mudança de aminoácido mais comum em ambos os sexos masculino e feminino com uma frequência de aproximadamente 41%. A p. (G12V) e p. (G12D) mutações foram os segundos mutações mais frequentes em mulheres e homens, com uma frequência de 20% e 25,6%, respectivamente (Tabela 4). Quarenta e três por cento dos

KRAS

mutações no grupo de fumantes atual ou passado foram p. (G12C) mutações, enquanto nenhum dos pacientes não-fumantes tinha essa mutação. Além disso, a G T e G transversões de C em

KRAS

ocorreu em 86,2% das mulheres e em 61,5% dos homens. A G A transição foi mais comum em homens do que nas mulheres (p = 0,008) (Tabela 5). estatuto DPOC não foi associada a qualquer tipo de

KRAS

mudanças de aminoácidos ou nucleotídeos substituições.

De todos

EGFR

mutação casos positivos a percentagem de pacientes com 19del exão não foi significativamente diferente entre as mulheres (11/18) e machos (5/11). Em não-fumantes, 9 em cada 10

EGFR

casos positivos mutação tinha uma 19del exão (Tabela 6), enquanto que em fumantes atuais ou passados ​​apenas 7 dos 19 pacientes com um

EGFR

mutação teve um 19del exão.

Discussão

em contraste com a nossa hipótese nós mostramos que a DPOC não está associada com a presença de

KRAS

mutações no cancro do pulmão, enquanto presença de

EGFR

mutações foi mais frequente em não DPOC, em comparação com pacientes com câncer de pulmão DPOC, após correcção do sexo e tabagismo. Encontrámos significativamente maior idade média no grupo de DPOC, em comparação com o grupo não-DPOC. Este resultado é consistente com o fato de que a prevalência da DPOC aumenta com a idade [29].

KRAS

mutações foram identificados em 32% dos pacientes com NSCLC, que incluíram principalmente doentes com adenocarcinoma. Observou-se uma relação entre a presença de

KRAS

mutações de ponto de acesso e tabagismo consistente com estudos anteriores [25, 30], mas não com DPOC. Em outros estudos nenhuma relação entre tabagismo e a presença de

KRAS

mutações têm sido observados em pacientes com câncer de pulmão [25, 30-32]. Estas diferenças podem ser causadas por diferenças na seleção de grupos de estudo, etnia, número de pacientes e tabagismo. A falta de uma associação com DPOC está em concordância com os resultados relatados estudo recente ina [33].

Embora as fêmeas fumadores eram mais jovens e fumantes leves com base em anos de carga do que os machos, percebemos que

KRAS

mutações eram mais comuns nos fumadores do sexo feminino do que nos fumadores do sexo masculino com NSCLC. Este suporta um aumento da susceptibilidade das fêmeas aos carcinógenos do cigarro conforme relatado anteriormente [34]. Além disso, estes resultados também são consistentes com um estudo anterior mostrando que as mulheres tiveram câncer de pulmão superior, ou a em todos os níveis de exposição ao tabaco [35]. Esta vulnerabilidade elevada para fumar pode ser causada pelos níveis mais elevados de expressão de genes que codificam enzimas metabolizadoras de tabaco cancerígena, como CYP1A1 e CYP1B1, em tecido pulmonar normal dos fumadores do sexo feminino em comparação com homens fumadores [36]. Uppstad e colaboradores [37], também mostraram maior expressão de CYP1A1 em linhas celulares derivadas de adenocarcinoma do pulmão de fêmeas em comparação com linhas celulares derivadas de adenocarcinomas de pacientes do sexo masculino.

Embora tenhamos observado o relacionado p fumar. (G12C)

KRAS

mutação na mesma freqüência em ambos os sexos, transversões relacionadas com o tabagismo, ou seja G T e G C, foram significativamente mais comum em mulheres do que em homens. Em um estudo anterior com um tamanho de amostra de mais de 2.500 pacientes, o c.34G T; . P (G12C)

KRAS

mutação ocorreu mais frequente no sexo feminino e fumantes atuais ou passadas, enquanto o c.35G A; p. (G12D)

KRAS

mutações foram mais frequentes em pessoas que nunca fumaram [20]. Isto sugere novamente que as fêmeas são mais suscetíveis de fumaça de cigarro relacionados

KRAS

mutações comparação com os homens.

Nós mostramos que

EGFR

mutações ativadoras foram mais comuns em mulheres, não fumantes e em pacientes não DPOC NSCLC. Em um estudo recente,

EGFR

mutações foram observadas em 12,8% (51/399) dos pacientes com câncer de pulmão sem DPOC e em 6,3% (7/111) dos pacientes com DPOC [38]. Suzukiand colegas [39] identificou

EGFR

mutações em 32% (56/177) dos não-DPOC e em 8% (4/52) dos pacientes DPOC NSCLC. Lim e colegas [33] encontrado

EGFR

mutações em 37,3% (91/244) de não DPOC e em 16% (17/106) dos pacientes com DPOC. Eles também encontraram uma associação inversa entre a presença de

EGFR

mutação com a gravidade da obstrução ao fluxo aéreo. A constatação de que

EGFR

mutações são mais comuns em pacientes com câncer de pulmão não-portadores de DPOC pode indicar que o desenvolvimento do cancro do pulmão é dependente de ativação

EGFR

mutações em doenças pulmonares não-DPOC patients.Chronic, tais como asma grave e DPOC, causar um aumento da activação do receptor do factor de crescimento epitelial (EGFR) [12, 40]. Além disso, a DPOC caracteriza-se por reacções inflamatórias epiteliais e muitas quimioquinas pro-inflamatórias e factores de crescimento são induzidas por factor de transcrição Factor Nuclear kB (NFkB). Este fator de transcrição pode ser activado através estresse físico e químico, tais como o fumo [41]. Além disso, o aumento da activação do EGFR por stress oxidativo, que está envolvida na patogénese de COPD, ou o fumo do cigarro pode ocorrer em células epiteliais brônquicas humanas [14-15, 42]. Todos juntos sugerindo que a ativação do EGFR na DPOC é induzido pelo tabagismo, estresse oxidativo e, posteriormente, pela inflamação, provavelmente via NFkB.

Em conclusão,

KRAS

mutações eram mais comum em mulheres e fumantes, mas são não associadas com DPOC-status em pacientes com NSCLC.

EGFR

mutações são mais comuns em mulheres e pacientes não-fumantes NSCLC.

Informações de Apoio

S1 Table. dados do paciente utilizado para análise estatística

doi:. 10.1371 /journal.pone.0152317.s001

(XLSX)

Reconhecimentos

Estamos gratos à equipe de diagnóstico molecular para

EGFR

e

KRAS

análise de mutação e ajudar com a coleta de dados.