Abstract

Fator de Crescimento Epidérmico inibidores do receptor tirosina quinase (EGFR-TKI), incluindo gefitinib, são eficazes para pulmão de células não-pequenas: PLOS ONE cancerosas (NSCLC) pacientes com

EGFR

mutações. No entanto, nestes pacientes, eventualmente, desenvolver resistência a EGFR-TKI. O objetivo do presente estudo foi investigar o envolvimento de autofagia na resistência gefitinib. Desenvolvemos células resistentes a gefitinib (PC-9 /GEF) do PC-9 células (contendo o exão 19 eliminação

EGFR

) após a exposição a longo prazo em gefitinib. GEF células PC-9 /(B4 e E3), foram 200 vezes mais resistentes a gefitinib que PC-9 /células wt. Comparado com 9 PC células wt /, tanto 9 PC células /gefE3 PC-9 /gefB4 e demonstrou maiores níveis basais LC3-II que foram inibidas por 3 metiladenina (3-MA, um inibidor da autofagia) e potenciado pela cloroquina ( CQ, um inibidor da formação de autophagolysosomes), indicando elevada autofagia em 9 PC-gef células /. 3-MA e CQ concentração-dependente sobrevivência celular inibido de ambos PC-9wt e 9 PC células-GEF /, sugerindo que a autofagia pode ser pró-sobrevivência. Além disso, gefitinib aumento dos níveis LC3-II e autolysosome formação tanto em PC-9 /células wt e PC-9 /células do GEF. Em 9 de PC células /wt, CQ potenciou a citotoxicidade pela baixa gefitinib (3 nM). Além disso, CQ superou a resistência adquirida a gefitinib em PC-9 /GEF células por aumento da citotoxicidade induzida por gefitinib, a activação de caspase 3 e poli (ADP-ribose) polimerase de clivagem. Usando um

In vivo

modelo de xeno-enxerto com o PC-9 /wt e /gefB4 células, a administração oral de gefitinib (50 mg /kg) 9 PC-inibiu completamente o crescimento do tumor de PC-9 /peso, mas não PC -9 /gefB4cells. Combinação de CQ (75 mg /kg, i.p.) e gefitinib foi mais eficaz do que apenas na redução do crescimento do tumor de PC-9 /gefB4 gefitinib. Nossos dados sugerem que a inibição da autofagia pode ser uma estratégia terapêutica para superar a resistência adquirida de gefitinib em

EGFR

mutação pacientes com NSCLC

Citation:. Tang MC, Wu MEU, Hwang MH, Chang YT, Huang HJ, Lin AM-Y, et ai. (2015) cloroquina Melhora Gefitinib citotoxicidade em resistentes a gefitinib não de pequenas células do cancro do pulmão de células. PLoS ONE 10 (3): e0119135. doi: 10.1371 /journal.pone.0119135

Editor do Academic: Jung Weon Lee, da Universidade Nacional de Seul, República da Coreia

Recebido: 01 de maio de 2014; Aceito: 26 de janeiro de 2015; Publicação: 25 de março de 2015

Direitos de autor: © 2015 Tang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. NSC 101-2314-B-002 -090 -MY3 pelo Ministério da Ciência e Tecnologia, Taiwan. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Autophagy, conhecido como um mecanismo de auto-comer, é caracterizado por a síntese de novo de autofagossomas dupla membrana que sequestram os componentes celulares, tais como proteínas e organelas excessiva ou desnecessária [1-3]. Fusão de autofagossomas com lisossomos supostamente degrada o conteúdo citosólicos em componentes essenciais para reciclar. Fisiologicamente, um nível basal de autofagia é vital para a homeostase celular. Além disso, a autofagia é declaradamente induzidos a lidar com o estresse, como hipóxia, bem como privação de nutrientes e considerado como uma estratégia de sobrevivência [1-3]. Em contraste, um papel pro-morte de autofagia é proposto como uma morte programada das células de tipo II por meio de sobre-activação de auto-comer [4]. Com efeito, indutores autophagy foram encontrados para reduzir o volume do tumor [5-7]. a morte de células de cancro No entanto, a inibição da autofagia alegadamente induzida [8-10], sugerindo que a autofagia desempenha um papel citoprotector para as células cancerosas. Em apoio a esta noção, por inibição autofagia 3-metiladenina (3-MA), cloroquina (CQ, um agente para inibir a lysosomotropic autophagolysosome formação) e autofagia (ATG) do gene -relacionados 5 silenciamento foi encontrado para aumentar os efeitos citotóxicos por quimioterapias e A terapia-alvo [11-16]. Assim, a autofagia torna-se um alvo potencial para tratamentos de câncer.

A resistência aos medicamentos tem sido um foco de interesse no estudo da terapia do cancro. Várias linhas de evidência sugeriram o envolvimento de autofagia na resistência à droga, tanto a resistência aos medicamentos inata e resistência aos fármacos adquirida. Por exemplo, CQ foi mostrado para superar a resistência primária de inibidores do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) tirosina cinase (TKI) em células de cancro do pulmão A549 [16] e trastuzumab em HER-2 positivo cancro da mama [17]. Vários

In vitro

estudos demonstraram que CQ e bafilomicina A1 restaurar a sensibilidade à Crizotinibe e trastuzumab em células resistentes adquiridas, respectivamente [18-19]. Além disso, 3-MA foi encontrado para melhorar o efeito citotóxico da cisplatina em células resistentes à cisplatina [20], indicando que a inibição da autofagia parece ser um alvo terapêutico para a resistência adquirida aos fármacos.

pulmão de não pequenas células cancro (NSCLC) é o cancro mais comum no mundo. Atualmente, os inibidores do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) tirosina cinase (TKI), incluindo gefitinib, erlotinib e afatinib, são altamente eficazes no tratamento de pacientes com cancro do pulmão específica

EGFR

mutações nas suas amostras de tumor, tais como o exão 19 exclusão ou exão 21 L858R mutação [21-23]. Apesar do sucesso do uso de EGFR-TKI no tratamento de doentes com NSCLC Leste asiático, todos os pacientes responderam, eventualmente desenvolvidas a resistência adquirida a EGFR-TKI [24-27]. No presente estudo, o envolvimento de autofagia na resistência gefitinib adquirida em

EGFR

mutação células NSCLC foi investigada utilizando o PC-9 /células wt transportando

EGFR

exão 19 exclusão ea gefitinib- adquirida PC-9 resistentes /células do GEF (PC-9 /gefB4 e PC-9 /gefE3).

Materiais e Métodos

Reagentes e anticorpos

Os produtos químicos utilizados foram gefitinib (uma simpática oferta do AstraZeneca, Alderley Park, Reino Unido), difosfato de cloroquina (CQ; Sigma, St. Louis, MO, EUA), 3-metiladenina (3-MA; Sigma) e Cremophor EL (Sigma). Os anticorpos primários incluídos associada a microtúbulos de proteína 1 de cadeia leve 3 (LC3; Cell Signaling Technology, Beverly, MA, EUA, # 2775), caspase 3 (Cell Signaling Technology, # 9668), e PARP (Cell Signaling Technology, # 9542) , α-tubulina (Cell Signaling Technology, # 2144) e anticorpo β-actina (Millipore, Bedford, MA, EUA). Os anticorpos secundários foram peroxidase-secundário conjugado IgG (Chemicon, Temecula, CA, EUA).

Desenvolvimento de PC-9 células resistentes a gefitinib

PC9 /gefB4 e PC9 /células gefE3 foram desenvolvido no nosso laboratório e publicado anteriormente [26]. PC-9 /células WT, uma linha celular de adenocarcinoma de pulmão humano abrigando uma deleção no exon 19 de

EGFR

[28], foram cultivadas numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 a 37 ° C em RPMI (Roswell Park Memorial Institute) contendo 10% de soro fetal bovino, 4,5 g /L de glucose, e 1% (v /v) de penicilina /estreptomicina. As células wt PC-9 /foram crescidas em meio de cultura contendo concentrações crescentes de gefitinib. Após 6 meses de passagens, as células que podem crescer em concentrações micromolares de gefitinib foram mantidas em meio isento de drogas durante 2 semanas e foram clonados. Dois clones (PC-9 /gefB4, e PC-9 /gefE3) foram obtidas para estudos futuros.

Crescimento ensaio de inibição

As soluções estoque de gefitinib e 3-MA foram preparados em dimetil sulfóxido enquanto estava em CQ ddsH

2O. Quinze cem células foram colocadas em placas de 96 poços de fundo plano e cultivadas durante 24 h. Para estabelecer IC

50 de gefitinib, várias concentrações de gefitinib foram incluídas no meio de cultura durante 96 h. Usando o ensaio de sulforrodamina B [29], a viabilidade celular foi determinada dividindo-se os valores de absorvância de células tratadas com a das células não tratadas. IC

50 calculada a partir da curva de concentração-resposta foi definida como a concentração de gefitinib que se obteve a inibição do crescimento de 50%. Para os efeitos de 3-MA e CQ, a inibição do crescimento foi medida após 96 h de incubação de 3-MA (0,1, 0,3 ou 1 mM) ou CQ (5, 10 ou 15 uM). Para o efeito da CQ na morte celular induzida por gefitinib, a inibição do crescimento foi determinada após 96 h de incubação de gefitinib mais CQ (5 ou 10 uM).

ensaio Western blot de proteínas

para avaliar o envolvimento de autofagia de células PC-9 /wt e resistentes a gefitinib, as células foram tratadas com gefitinib mais 3-MA ou CQ durante 24 h. As células tratadas foram recolhidas, lavadas com salina tamponada com fosfato (PBS) e lisadas no ensaio de radio-imunoprecipitação (RIPA) de tampão de lise contendo Tris HCl 20 mM, NaCl 150 mM, 1% (v /v) de NP-40, 1% (w /v) desoxicolato de sódio, 1 mM de Ethylenediaminetetraacetates (EDTA), 0,1% (w /v) de poliacrilamida de sulfato de dodecilo de sódio (SDS) e 0,01% (w /v) de azida de sódio (pH 7,5) durante 20 min em gelo. Os lisados ​​foram então centrifugados a 12000 rpm durante 10 min, e as concentrações de proteína do sobrenadante foram determinadas pelo kit de ensaio de proteína BCA. As amostras de proteína (30 ug) foram corridos em electroforese em gel de poliacrilamida-SDS e 12-13,5%, em seguida, transferida para um difluoreto de polivinilideno (Bio-Rad, EUA) a 90 V durante 120 min. As manchas foram sondadas com anticorpos primários durante a noite a 4 ° C. Após incubação do anticorpo primário, a membrana foi lavada e incubada com um anticorpo secundário (1: 3000) durante 1 h à temperatura ambiente. A imunorreacção foi visualizado usando Amersham quimioluminescência aumentada (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, E.U.A.). Após esta detecção, os anticorpos primários e secundários ligados foram retirados por incubação da membrana em tampão de extracção (100 mM de 2-mercaptoetanol, 2% de SDS) a 50 ° C durante 45 min. A membrana foi sondado com um anticorpo primário contra β-actina (1: 5000) /α-tubulina (1: 5000).

fluorescente e ensaio de coloração imunofluorescente

Autolysosomes de coloração: As células foram tratadas com gefitinib durante 24 h e, em seguida, o meio foi substituído por meio fresco contendo 50 nM de Lyso Tracker vermelho (LysoTR, Lyso Tracker vermelho DND-99, Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) e incubou-se a 37 ° C durante 30 min. Em seguida, as células foram lavadas em PBS e fixadas com 3,5% de paraf ormaldeido (em PBS) durante 10 min, permeabilizadas com 0,5% de Triton X-100 em TBS durante 30 min, e tratou-se com 2% de BSA em TBS durante 1 h, à temperatura ambiente . As amostras foram então incubadas com anticorpo LC3 (1: 200) durante a noite a 4 ° C, enxaguadas três vezes com 0,01% de Triton X-100 em TBS, e incubadas durante 30 minutos com um anticorpo secundário (IgG de coelho conjugado com FITC a 1: 250 ) a 37 ° C. Em seguida, as células foram ainda mais corado com DAPI e observado sob um microscópio confocal (Olympus FV1000, Olympus America Inc., Center Valley, PA, EUA).

Xenoenxerto rato modelo

Sessenta e três 6 -week masculino de idade, ratinhos BALB /c nus, pesando 25-30 g, foram usadas. O protocolo animal foi aprovado pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use of Taipei Veterans General Hospital, Taipei, Taiwan. (Permissão Número: 2011-037) .Tumors foram induzidos por injecção de PC-9 /gefB4 células PC-9 /wt e (10

7 células em 100 ul de PBS) por via subcutânea nas costas de ratinhos. Para obter a curva de crescimento do tumor, realizou-se a medição diária do tumor. diâmetro perpendicular com um paquímetro digital e volumes foram calculados por (comprimento x largura

2) /2. Quando os tumores cresceram até 200 mm

3, os ratinhos foram distribuídos aleatoriamente em 4 grupos tratados por via oral com veículo (10% de Cremophor EL /10% de etanol /4% de dextrose em DDH

2O), gefitinib isoladamente (50 mg /kg, por um gavagem), CQ sozinho (75 mg /kg, ip) e gefitinib mais CQ. Gefitinib foi preparado em 10% de Cremophor EL /10% de etanol /4% de dextrose e CQ foi dissolvido em PBS.

Estatísticas

Todos os dados são expressos como a média ± S.E.M. As comparações estatísticas de viabilidade celular foram feitas usando independente de amostras teste t de SPSS. valor P inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

autofagia basal elevada em PC-9 /células GEF

Para estudar a autofagia e resistência aos medicamentos, o nível de LC3-II, uma característica da proteína autofagia, foi medido em /wt, as células PC-9 /gefB4 e PC-9/9 gefE3 PC-. ensaio de Western blot mostrou níveis basais mais elevados de LC3-II em PC-9 /células GEF (B4 e E3), enquanto que em comparação com as células PC-wt 9 /(Fig. 1a). Consistente com o ensaio de Western blot, o estudo imuno demonstrou mais LC3 imunofluorescência puncta no PC-9 /gefB4 células em comparação com o PC-9 /células wt (Fig. 1B). Além disso, 3-MA e QC foram utilizados para caracterizar a autofagia. Descobrimos que 3-MA diminuíram (Fig. 1C) enquanto CQ aumentou os níveis basais LC3-II em PC-9 /peso, PC-9 /gefB4 células e PC-9 /gefE3 após tratamentos com medicamentos 24 h (Fig. 1D ). Estes dados indicam que as células PC-9 /GEF (E3 e B4) têm um nível basal mais elevado do que 9 de autofagia células PC-wt /. Além disso, o ensaio de sobrevivência de células foi utilizado para delinear o papel de autofagia utilizando 3-MA e CQ. ensaio SRB mostrou que o 3-MA e CQ concentração-dependente reduziu a sobrevivência celular em PC-9 /peso, PC-9 /gefB4 e-9 PC células /gefE3 (Fig. 2), sugerindo que a autofagia desempenha um papel pro-sobrevivência em proliferação celular.

(a) os dados de Western blot representativos mostraram os níveis basais LC3-II no PC-9 células /GEF (B4 e E3) PC-9 /wt e. (B) Estudos coloração de imunofluorescência foram realizadas utilizando anticorpo LC3 para mostrar pontos lacrimais LC3 no PC-9 /wt e PC-9 /gefB4 células. (C e D): PC-9 /p, 9 PC-células /gefE3 PC-9 /gefB4 e foram tratados com 3-metiladenina (3-MA, 10 mM) e cloroquina (CQ, 1 e 10 uM) durante 24 h. A proteína total de células tratadas foi colhida; níveis LC3-I e II foram analisadas com o ensaio Western Blot. Cada uma das pistas continha 30 ug de proteína em todas as experiências. Os resultados foram repetidos em expericias independentes.

/p, 9 PC-células /gefE3 PC-9 /gefB4 e foram tratadas com 9-PC (a) 3-MA (0,1-1 mM) e (B) CQ (5-15 uM) durante 96 h. A viabilidade celular foi determinada utilizando o ensaio de SRB. Os valores são a média ± S.E.M. (N = 3). *

P Art 0,05 estatisticamente significativas no 3-MA ou tratados com CQ grupos comparados com os controles.

autofagia induzida por Gefitinib

in vitro

O envolvimento de autofagia em citotoxicidade induzida por gefitinib foi investigada. ensaio de Western blot mostrou que a concentração de forma dependente gefitinib aumento dos níveis LC3-II em PC-9 /peso, PC-9 /gefB4 e PC-9 células /gefE3 (Fig. 3A). estudos de coloração de imunofluorescência demonstrou que 24 horas de incubação de gefitinib (1 uM) elevados pontos lacrimais LC3 em ambos PC-9 /wt e PC-9 /gefB4 células (Fig. 3B). Além disso, foi observado co-localização de imunofluorescência LC3 e LysoTR fluorescência em PC-9 /WT e PC-9 /gefB4 células tratadas com gefitinib (Fig. 3B), indicando que o gefitinib é capaz de induzir a formação de autofagia e autolysosome.

(a) /em peso, as células PC-9 /gefB4 e PC-9 /gefE3 foram tratados com gefitinib (nM) a várias concentrações durante 24 h 9-PC. A proteína total de células tratadas foi colhida; níveis LC3-I e II foram analisadas com o ensaio Western Blot. Cada uma das pistas continha 30 ug de proteína em todas as experiências. Os resultados foram repetidos em expericias independentes. (B) PC-9 /gefB4 células PC-9 /peso e foram tratados com gefitinib (1 uM) durante 24 h. coloração de imunofluorescência e estudos de fluorescência foram realizadas utilizando anticorpo LC3 e vermelho Lyso Tracker (LysoTR), respectivamente, para mostrar pontos lacrimais nas células. Verde, LC3 marcado com FITC; vermelho, LysoTR; azul, núcleo marcado com DAPI.

Devido à autofagia elevou-gefitinib, foi investigado o efeito da CQ na citotoxicidade induzida por gefitinib. Vinte e quatro horas após o tratamento com drogas, CQ aumentou ainda mais os níveis LC3-II induzida por gefitinib no PC-9 /wt e PC-9 /gefB4 células (Fig. 4a). estudos de sobrevivência de células demonstraram que o gefitinib (100 nM) sozinha induziu a morte celular profunda de 9 células de PC-wt /; No entanto, CQ (5 e 10 uM) não foi capaz de aumentar ainda mais a citotoxicidade induzida por gefitinib (Fig. 4B). Como para o PC-9 /gefB4 células, gefitinib (100 nM) sozinho induziu uma morte celular ligeira; CQ potenciou significativamente a citotoxicidade induzida por gefitinib (Fig. 4C), isto é, CQ superar a resistência de gefitinib em /gefB4 células PC-9. Para testar adicionalmente a potenciação de CQ em PC-9 /wt células, a baixa dose de gefitinib (3 nM) foi empregue. Enquanto 96 h de incubação de gefitinib (3 nM) induziu uma citotoxicidade insignificante no PC-9 /células wt, co-incubação com CQ (10 nM) e gefitinib reduziu profundamente a sobrevivência das células (Fig. 4D). A potenciação induzida pelo CQ de citotoxicidade induzida por gefitinib foi adicionalmente investigada por medição proteínas relacionadas com apoptose, incluindo os níveis de (ADP-ribose) polimerase (PARP) da caspase-3 e poli. Descobrimos que gefitinib (0,1 mM) induziu apoptose, mostrando caspase 3 activação e clivagem PARP em 9 de PC células wt /; CQ (10 uM) não aumentou consistentemente a apoptose induzida por gefitinib em PC-9 /células wt (Fig. 5). Em contraste, quando a gefitinib ou CQ não foi capaz de induzir a apoptose em PC-9 /gefB4 e PC-9 /gefE3 células, CQ mais gefitinib induzida significativamente caspase 3 activação e PARP de clivagem em ambos os PC-9 células /GEF (Fig. 5 ).

(a) do PC-9 /wt e PC-9 /gefB4 foram tratados com gefitinib (100 nM) e cloroquina (CQ, 5, 10 uM) durante 24 h. A proteína total de células tratadas foi colhido. níveis LC3-II foram analisadas com o ensaio Western Blot. Cada uma das pistas continha 30 ug de proteína em todas as experiências. Os resultados foram repetidos em expericias independentes. (B) PC-9 /p e (C) PC-9 /gefB4 células foram cultivadas com gefitinib (100 nM) e CQ (5, 10 uM) durante 96 h. (D) PC-9 /células wt foram cultivadas com gefitinib (3 nM) e CQ (5, 10 uM) durante 96 h. A viabilidade celular foi determinada utilizando o ensaio de SRB. Os valores são a média ± S.E.M. (N = 3). *

P Art 0,05 estatisticamente significativa na gefitinib ou grupos tratados com CQ em comparação com os controlos; # P 0,05 estatisticamente significativa em gefitinib mais grupos tratados com CQ comparado com somente grupos gefitinib

PC-9 /p, 9 PC-células /gefE3 PC-9 /gefB4 e foram tratados com gefitinib (100 nM. ) e cloroquina (CQ, 10 uM) durante 24 h. A proteína total de células tratadas foi colhido. Procaspase 3, caspase 3 activa, os níveis de clivagem de PARP foi analisada com análise Western blot. Cada uma das pistas continha 30 ug de proteína em todas as experiências. Os resultados foram repetidos em experimentos independentes.

potenciou a actividade anti-tumoral induzida por gefitinib Gefitinib além de CQ em PC-9 /gefB4 xenotransplantes

A potenciação induzida CQ do anti-tumoral actividade de gefitinib foi adicionalmente investigada utilizando ratinhos Balb /c nus com PC-9 /gefB4 xenoenxertos de tumor humano PC-9 /wt e (fig. 6). CQ sozinhos não alterou o crescimento do tumor de PC-9 /wt e PC-9 /gefB4 xenoenxertos de tumores humanos (Fig. 6). Em comparação com o crescimento do tumor tratado com veículo, a monoterapia gefitinib inibiu significativamente o crescimento do tumor de xenoenxertos PC-wt 9 /; co-administração de CQ não foi capaz de aumentar o efeito anti-tumoral por gefitinib no PC-9 /xenoenxertos wt (Fig. 6A). A inibição completa do crescimento do tumor de xenoenxertos PC-wt 9 /durou até ao final da experiência (Fig. 6A). Em contraste, gefitinib insignificante redução do crescimento do tumor de xenoenxertos PC-9 /gefB4 comparada com a de PC-9 xenoenxertos (Fig 6B;. P = 0,07). PC-9 /gefB4 tumores re-crescimento após 15 dias de administração de gefitinib (Fig. 6B). Surpreendentemente, CQ mais gefitinib suprimiu significativamente o crescimento do tumor de PC-9 /gefB4 xenoenxertos em comparação com gefitinib única (Figura 6B;. P 0,05)

ratinhos Balb /c nus portadores de PC-9 /peso (A. ) e PC-9 /gefB4 (B) xenoenxertos foram tratados com veículos como controlo (○, n = 4 para PC-9 /wt e PC-9 /gefB4, respectivamente), gefitinib (50 mg /kg /dia por um gavagem , ◆; n = 5 para gefB4 PC-9 /wt e PC-9 /, respectivamente), a cloroquina (CQ, 75 mg /kg, ip ▲; n = 4 para PC-9 /wt e PC-9 /gefB4, respectivamente), ou uma combinação de ambos (■; n = 5 para PC-9 /wt e PC-9 /gefB4, respectivamente) .Tumors foram deixadas a crescer até 200 mm

3 antes dos tratamentos de drogas. Os valores são a média ± S.E.M. (N = 4-5). ** P 0,001, estatisticamente significativa, em grupos de tratamento com gefitinib e gefitinib mais CQ em comparação com o grupo de veículo em xenoenxertos PC-9 /tumorais em peso. * P 0,05, estatisticamente significativa no grupo de gefitinib além de CQ em comparação com o grupo de veículo; # P 0,05 estatisticamente significativa no grupo CQ gefitinib mais em comparação com gefitinib isoladamente no PC-9 /gefB4 xenoenxertos tumorais por independente de amostras teste t. (C) Os dados representativos mostram 4 ratos com o PC-9 /xenoenxertos em peso e 4 ratos com PC-9 /gefB4 xenotransplantes que foram tratados com o veículo, CQ somente, gefitinib somente e gefitinib além de CQ.

discussão

a autofagia e drogas resistência

para desenvolver estratégias terapêuticas para a resistência adquirida induzida por gefitinib, usamos PC-9 /gefB4 e 9 PC células /gefE3 que possuem IC

50 gefitinib de aproximadamente 200 vezes mais do que a de PC-9 /wt células [26]. ensaio Western blot e estudo de imunofluorescência demonstraram níveis mais elevados basais de autofagia em ambos os 9 PC células /gefE3 PC-9 /gefB4 e. Utilizando 3-MA e CQ para impedir a formação e função de autofagia, o mecanismo para a autofagia basal elevada em células resistentes a gefitinib é proposto. Para lidar com tensões desfavoráveis, ou seja, a constante exposição a gefitinib, as células cancerosas aumentou autofagia para manter a homeostase metabólica e o crescimento celular adequado [4]. ensaio de viabilidade celular revelou que a autofagia era pró-sobrevivência, porque 3-MA e CQ diminuiu a sobrevivência de células de 9 PC células-GEF /PC-9 /wt e (B4 e E3). Em adição à resistência a gefitinib, Estudos anteriores relataram que as células de cancro da mama refractário-trastuzumab e células cancerosas de pulmão resistentes à cisplatina têm maior autofagia em comparação com as células cancerosas sensíveis [19-20]. Do mesmo modo, 3-MA e bafilomicina A1 (um inibidor de autolysosome maturação) foram encontrados para reduzir a viabilidade celular destas células resistentes [19-20]. Em contraste com a diferença de 200 vezes na IC

50 de gefitinib [26], 3-MA e CQ morte celular induzida a um grau semelhante em-9 PC células /GEF PC-9 e, indicando PC-9 /gefB4 células não eram resistentes a 3-MA e citotoxicidade induzida CQ.

O papel da autofagia na citotoxicidade induzida por gefitinib

diferentes terapias, incluindo a terapia de radiação [20], quimioterapias [30] e terapias-alvo [16, 31] foram relatados como indutores de autofagia. O nosso estudo confirmou esta noção de que gefitinib autofagia aumentada de uma maneira dependente da concentração em PC-9 /células GEF (B4 e E3) PC-9 /wt e. O papel da autofagia na citotoxicidade induzida por gefitinib foi adicionalmente delineado por combinação de CQ e gefitinib. Consistente com nosso estudo anterior [26], gefitinib (100 nM) sozinho induzida marcada citotoxicidade em PC-9 /células wt. O mecanismo citotóxico de gefitinib é conhecido para competir local de ligação do ATP no PC-9 /células wt carregando a

EGFR

exão 19 exclusão [32] e, assim, induzir citotoxicidade através da apoptose [26, 33-35]. A potenciação por CQ mais gefitinib em 9 PC-/células wt foi observada apenas quando a gefitinib foi reduzido para 3 nM, indicando que a CQ pode ser usado para aumentar a apoptose induzida por gefitinib no PC-9 /células wt. Um ensaio clínico de tratamento com gefitinib e hidroxicloroquina está passando em pacientes doentes CPCNP avançada [36], os nossos dados sugerem que quando se co-administrar com CQ e os seus análogos, doses mais baixas de gefitinib pode ser suficiente para pacientes com cancros do pulmão sensível ao gefitinib com menos lado efeitos [37].

a autofagia e adquiriu resistência aos medicamentos

em comparação com 9 PC células wt /, uma diferença de 200 vezes na IC

50 de gefitinib foi identificado em PC-9 /células gefB4 [26]. O nosso estudo anterior descobriu que os inibidores de MEK (AZD6244 e CI1040) profundamente inverteu as resistências adquiridos a gefitinib em PC-9 células /gefB4 [26]. Consistentemente, gefitinib (100 nM) sozinha era incapaz de induzir citotoxicidade significativa no PC-9 /gefB4 (Fig. 4C), PC-9 /gefE3 e PC-9 /gefE7 [26]. No entanto, o presente estudo mostrou que gefitinib mais CQ induzida significativamente a ativação caspase 3 e clivagem PARP em ambos os PC de 9 células PC-9 /gefB4 e /gefE3, indicando que CQ sensibilizados PC-9 /células do GEF (B4 e E3) para gefitinib . Em comparação com a diferença de 200 vezes na IC

50 de gefitinib, gefitinib não apresentaram diferenças significativas em elevação e morte celular LC3-II em 9 de PC células /gefE3 PC-9 /células wt, PC-9 /gefB4 e , indicando a autofagia não pode ser responsável na resistência gefitinib adquirido. No entanto, os nossos

in vitro

dados mostraram que CQ atenuada sobrevivência do PC-9 /gefB4 células, indicando que gefitinib e CQ pode ser eficaz para superar a resistência gefitinib. Além disso, vários

in vitro

estudos relataram que a inibição autofagia parece aumentar a citotoxicidade nas células Crizotinibe-resistentes [18], as células resistentes trastuzumab [19] e as células resistentes à cisplatina [20]. Até agora, limitada

In vivo

estudos têm-se centrado sobre o efeito terapêutico da CQ na resistência adquirida aos fármacos [18]. Nossos resultados de

in vivo

modelo de xenoenxerto de apoiar os

in vitro

dados em que gefitinib consistentemente o crescimento do tumor /p inibiu PC-9 e CQ não aumentar o efeito anti-câncer de gefitinib. Como para o crescimento do tumor de PC-9 /gefB4 xenoenxertos, CQ mais gefitinib atrasou significativamente o crescimento do tumor de PC-9 /gefB4 xenoenxertos em comparação com a monoterapia com gefitinib, indicando que CQ é capaz de sensibilizar as PC-9 /células gefB4 a gefitinib e em seguida, reduz o crescimento do tumor de PC-9 /gefB4 xenoenxertos humanos.

Em conclusão, o EGFR-TKI, tais como gefitinib, são conhecidos para o tratamento de cancros do pulmão com eficácias significativas. O nosso estudo anterior combinação de gefitinib e inibidores da ERK e demonstrados com sucesso potenciais terapêuticos significativos empregue para a resistência adquirida a gefitinib [26]. No presente estudo, mostramos que a autofagia pode desempenhar um papel citoprotector na tumorigênese e resistência adquirida. Além disso, CQ parece ser terapeuticamente útil para NSCLC tanto gefitinib-sensível e resistente à, sugerindo que CQ e seus análogos pode ser uma terapia promissora câncer [38-39] para pacientes com câncer de pulmão com

EGFR

mutação que desenvolvem uma resistência adquirida após receber tratamento com gefitinib.