Abstract

A fim de realizar o pleno potencial da terapia de gene suicida câncer que permite a expressão precisa do gene suicida em células de cancro, foi utilizado um promotor específico de tecido molécula de adesão celular epitelial (EpCAM) (GPE-2) que dirige a expressão do transgene Herpes simplex timidina-quinase de vírus (HSV-TK), preferencialmente, em que sobre-expressam EpCAM células cancerosas. níveis EpCAM são consideravelmente mais elevados em retinoblastoma (RB), um câncer de olho na infância com expressão limitada em células normais. Uso de regulação miARN, adjacente à utilização do promotor específico de tecido, seria fornecer a segunda camada de controlo para a expressão do transgene apenas nas células tumorais, poupando as células normais. Para testar essa hipótese, foi clonado let-7b alvos miRNA na região 3’UTR do gene suicida HSV-TK conduzido pelo promotor EpCAM porque let-7 miRNAs família, incluindo let-7b, foram encontrados para ser regulada negativamente nos tumores RB e linhas de celular. Usamos EpCAM mais de expressar e deixar-7 baixo regulada RB linhas celulares Y79, Weri-Rb1 (EpCAM

+ ve /let-7b

regulada para baixo), EpCAM baixo regulada, deixe-7 sobre expressando Müller normal da retina linha de células glial MIO-M1 (EpCAM

ve /let-7b

-regulada) e EpCAM-se regulada, deixe-7b-regulada linha de células da tiróide normal, N-Thy-Ori-3.1 (EpCAM

+ ve /let-7b

-regulada) no estudo. A proliferação celular foi medida pelo ensaio de MTT, a apoptose foi medida por sondagem clivado Caspase3, EpCAM e expressão TK foram quantificados por Western blot. Nossos resultados mostraram que a EGP2-promotor HSV-TK (EGP2-TK) construir com 2 ou 4 cópias de let-7b alvos miRNA expressa gene TK apenas em Y79, Weri-Rb-1, enquanto o gene TK não expressar em MIO -M1. Em resumo, temos desenvolvido um vetor duplo controle específico do tecido, miRNA-regulados, que expressa seletivamente o gene suicida em EpCAM sobre células que expressam

Citation:. Danda R, Krishnan G, Ganapathy K, Krishnan UM, Vikas K, Elchuri S, et al. (2013) Targeted Expressão do Gene Suicídio pelo Promotor Tissue-específicos e Regulamento MicroRNA de Terapia Genética do Câncer. PLoS ONE 8 (12): e83398. doi: 10.1371 /journal.pone.0083398

editor: Rajiv R. Mohan, da Universidade de Missouri-Columbia, Estados Unidos da América

Recebido: 27 de junho de 2013; Aceito: 05 de novembro de 2013; Publicação: 31 de dezembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Danda et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Conselho indiano de Pesquisa médica, Grant nº 35/6/2010 /-BMS Nano para realizar a clonagem, transfecção e análise funcional. Em parte, este trabalho foi apoiado pelo Departamento de Biotecnologia, Governo da Índia, Grant não BT /01 /CE1B /11 /V /16, para a realização do perfil da família deixá-7miRNA. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

os tratamentos convencionais como a quimioterapia, radioterapia e cirurgia são os meios mais eficientes para tratar pacientes com câncer [1]. Com base nos estágios da doença, métodos de tratamento atuais para retinoblastoma (RB) a neoplasia mais frequente do olho na infância, incluem quimioterapia intensiva, Radiação, consolidação, com resgate de células-tronco hematopoiéticas autólogas e ressecção cirúrgica. No entanto, os pacientes com sementes vítreas, sementes sub retina e doenças multifocais avançados bilaterais são um grande desafio com as opções atuais de tratamento [2], [3]. Recente descoberta de células-tronco cancerosas, um subconjunto de células cancerosas com propriedades semelhantes a células-tronco, que é, em parte, responsáveis ​​pelo crescimento do tumor com diferentes propriedades em comparação com as células tumorais diferenciadas estão aumentando a complexidade do tratamento do câncer [1]. Portanto, novos métodos de tratamento são necessários para lutar contra o câncer. Entre as várias abordagens, a terapia de gene suicida pode ser uma estratégia alternativa promissora uma vez que a expressão do gene suicida pode ser regulada para um tecido particular, [4], [5]. terapia de gene suicida envolve a entrega intracelular de um gene que codifica para uma enzima que transforma uma pró-droga para um produto citotóxico [6], [7]. O gene suicida mais vulgarmente utilizado é o vírus herpes simplex tipo I timidina cinase (HSV-TK). Vários estudos tinham usado terapia de gene suicida HSV-TK para tratar RB e outros tipos de câncer [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14]. expressão não específica do gene suicida, em células normais é uma limitação grave nas estratégias gene suicida existentes para a terapia do cancro.

promotores específicos de tecidos diferentes

De modo a controlar eficazmente a expressão do transgene apenas em células-alvo, vários estudos têm utilizado [15], [16], [17], [18], [19], [20]. Um tal promotor é a glicoproteína-2 /17-1 promotor epitelial /EpCAM (EGP2) que mata selectivamente o EpCAM células que sobre-expressam em muitos cancros por expressão restrita de TK (timidina-quinase), seguido por tratamento com ganciclovir (GCV) [21], [ ,,,0],22]. EpCAM /CD326 é uma glicoproteína de membrana de tipo I trans, que é expressa na membrana apical das células cancerosas e mostra a expressão baso-lateral em células epiteliais normais. Tem sido relatado para ser expresso especificamente em tecido epitelial, e sobre-expressa na maioria dos carcinomas epiteliais humanos, incluindo o colorrectal, da mama, da próstata, cabeça e pescoço, carcinomas hepáticos e retinoblastoma [23], [24]. a expressão do gene controlado nos tecidos alvo é crucial para a terapia de genes em particular no contexto da terapia de gene suicida cancro. Embora a terapia de gene suicida conduzido tecido promotor específico mostrou resultados promissores, gotejante expressão dos promotores específicos de tecido em células não-alvo foi avaliado [21]. Por isso, são essenciais estratégias alternativas para além da regulação do promotor específico do tecido da terapia de gene suicida

MicroRNAs (miRNAs) são uma classe de pequenos RNAs, não-codificante. ( 1000 em células de mamíferos) que regulam várias funções celulares que vão desde a divisão celular, a transdução de sinal e metabolismo. A regulação pós-transcricional da expressão génica através de interferência de ARN mediada por miARN (RNAi) é bem conhecido [25]. miRNAs são conhecidos por bloquear a tradução do mRNA ou reduzir a estabilidade do mRNA após a ligação perfeita do fio guia para os elementos miRNA-reconhecimento (MRE) dentro do 3

região luntranslated (UTR) dos genes-alvo [26], [27], [28], [29]. deixar-7 é uma classe de miARNs que estão envolvidas na regulação celular e supressão de tumor. Estudos anteriores sobre o câncer de próstata, pulmão e mama, mostrou-se a regulamentação dos miRNAs família let-7 [30], [31]. Recentemente, a proteína glial fibrilar ácida (GFAP) vectores de expressão de gene específico do tecido conduzido promotor, juntamente com as sequências alvo para a miARN desregulado (mir122a, mir31, mir127, mir143) foram introduzidos na região 3 ‘UTR do transgene [32], [ ,,,0],33], [34], [35], [36]. Esta abordagem permitiu que a expressão do transgene apenas em células de cancro de glioblastoma segmentados sem qualquer expressão em células normais astrócitos da mesma linhagem [34].

Neste estudo, construiu-se um vector de expressão de células de mamífero, o qual contém o promotor de EpCAM (EGP2) accionada gene suicida HSV-TK regulado pela expressão dos níveis de miARN desregulados. O objectivo consiste em expressar o gene suicida só na EpCAM

+ células ve com muito pouca ou nenhuma expressão em células normais da mesma linhagem. O miRNA let-7b está sob expressos em Y79, Weri-Rb-1 linhas celulares de cancro. Fizemos EGP2-TK construir com 2 e 4 cópias de sequências alvo de miRNA let-7b. A expressão do gene de TK é restrita a linhas de células de cancro, tais como Y79, weri-Rb-1, MDA-MB-453 e MCF-7, ao passo que a expressão do gene de TK é mínima na linha de células MIO-M1. Nós demonstramos pela primeira vez a utilização do promotor de EpCAM conduzido gene suicida TK miARN regulamentado de EpCAM positiva e deixou-7 células reguladas para baixo. Esta estratégia oferece um controlo do nível de duas camadas do transgene que pode conduzir a uma expressão do transgene selectiva nas células de cancro sem nenhuma expressão nas células normais.

Materiais e Métodos

instrução Ética

amostras de tumores de Retinoblastoma foram coletadas de bolas de olho enucleados como parte da terapia e utilizados para fins de pesquisa, um consentimento geral escrito foi obtido dos pais /responsáveis ​​da enucleação paciente submetido. O estudo foi realizado após aprovação do Sub-Comité (Institutional Review Board) Ética do hospital de olhos Sankara Nethralaya [apuramento Ética não: 147 (A) -2009-P].

amostras tumorais e detalhes patológicas

para este estudo foram utilizados 10 tumores retinoblastoma frescas, detalhes Clinocopathological para os tumores foram baseadas em grupo de trabalho retinoblastoma encenação internacional (IRSWG) [37], [38] e foram dadas na tabela S1. Agrupada retina adulta 50-55 (n = 3) anos de idade foram utilizados como controle e foram obtidos a partir olhos de cadáveres doados para CU Shah Banco de Olhos, Sankara Nethralaya.

cultura celular

A retinoblastoma linha celular Y79, weri-Rb1, e de células de cancro da mama linhas MDA-MB-453, MCF-7 foram obtidas a partir de Bio RIKEN Resource Centre (Japão). linha de células glial humana Retinal Müller MIO-M1 derivados da retina neural era dotado de G. A. Membro, UCL Institute of Ophthalmology, Londres, Inglaterra [39]. folicular linha de células epiteliais da tiróide humana Nthy-ori 3-1 era dotado de Dr.Omer Ugur, Hacettepe Instituto de Oncologia [40], [41]. Mio-M1, MDA-MB-453, MCF-7 foram cultivadas em modificação do meio de Eagle (DMEM) contendo glutamina, suplementado com 10% de soro inactivado por calor fetal de bovino (FBS), penicilina (100 UI /ml) e estreptomicina por Dulbecco (100 UI /mL). Nthy-ori 3-1 e Y79, weri-Rb1 foram cultivadas em RPMI 1640 suplementado com 10% de soro inactivado por calor de vitelo fetal, 2 mM de L-glutamina, piruvato de sódio 1 mM e 4,5% de dextrose e cultivadas em suspensão a 37 ° C em uma CO 5% incubadora

2-umidificado.

In vitro

transgene expressão análise

(EGP2-TK) foi gentilmente cedido pelo Dr. MG Rots, Departamento de terapêutica Gene Modulation, Centro Universitário de Farmácia da Universidade de Groningen, na Holanda. O vector de expressão contendo pUT649 um gene resistente à zeocina e que transporta o gene HSV-TK sob o controlo do promotor de citomegalovírus humano (CMV-TK) [gerado pelo Professor G.Tiraby (Universidade de Toulouse), Cayla, França] foram transientemente transfectados para Y79 , weri-Rb1, Nthy-ori 3-1, Mio-M1 utilizando Lipofectamina TM 2,000 reagente de transfecção (Invitrogen, EUA) de acordo com as instruções do fabricante.

Clonagem de alvos de miARN no plasmídeo EGP2-TK

para construir os plasmídeos com sequências de deixar-7 miARN alvo, EGP2-TK foi utilizado como uma espinha dorsal que contém o HSV-TK na jusante de promotor EGP2. Para a construção dos alvos miRNA, oligonucleotídeos foram projetados com alvos let-7b (sequência complemento perfeito de let-7b miRNA foi tomada a partir miRBase adesão no-MIMAT0000063), seguido de

KpnI

que são designados como T1A (tendo alvos perfeitos reverter complementar ao deixá-7b miRNA) e T1B (perfeitamente complementar à T1A) foram emparelhados e ligados entre

NotI

e

BstBI

sítios de restrição, resultando em EGP2-TK-2T ter 2 cópias de as metas de let-7b. O

KpnI

/

BstBI

fragmento foi digerido com as respectivas enzimas e ligado com os oligonucleotídeos ter mais duas cópias de sequências alvo deixe-7b. Que é designada por T2A (tendo alvos complementar perfeita para deixar-7b miARN) e T2B (perfeitamente complementar a T2A), respectivamente. Estes foram emparelhados e ligados resultando em EGP2-TK-4T ter 4 cópias das sequências alvo deixou-7B. As metas de controle C1A, C1B e C2A, C2B foram gerados tomando o perfeito complemento reverso do alvo miRNA let-7b. Durante todo o manuscrito EGP2-TK com 2 cópias de alvos let-7b serão mencionados como EGP2-TK-2T e 4 cópias de alvos let-7b como EGP2-TK-4T. Da mesma forma EGP2-TK com 2 cópias de sequência de controlo let-7b será referida como EGP2-TK-2C e 4 cópias da sequência de controlo será denotado como GPE-TK-4C. As construções de plasmídeos de ensaio de luciferase (luc) repórter foram gerados através da substituição do gene HSV-TK com a

Guassia luciferase

gene. As construções de luciferase foram nomeados como mencionado acima substituindo com TK Luc. A Tabela 1 lista os oligonucleotídeos utilizados no estudo.

miRNA análise de expressão

O Kit TaqMan® microRNA transcrição reversa ea TaqMan® Universal PCR Master Mix sem AmpErase® UNG da Applied Biosystems (CA, EUA) foi utilizado para a detecção e quantificação de miARN maduro. A quantificação foi feita de acordo com o protocolo do fabricante, utilizando 1 g de amostra de ARN total. Utilizou-se RNU6 miARN (ensaio ID, 001093) como controlo. TheTaqMan® MicroRNA (Applied Biosystems) ensaios individuais foram utilizados para as seguintes estimativas de miRNA: HSA-deixou-7a (ensaio ID, 000.377), HSA-let-7b (ID ensaio, 2619), HSA-deixou-7c (ID ensaio, 000.379), HSA-let-7d (ID ensaio, 002.283), HSA-let-7e (ID ensaio, 2406), HSA-let-7F (ID ensaio, 000,382) e HSA-let-7 g (ID ensaio, 0.002.282 ) e HSA-let-7i (ensaio ID, 002.221). Os dados foram normalizados utilizando valores de Ct para o U6 gene casa mantendo-se em cada amostra. Para calcular as quantidades relativas de miARN, o valor de Ct média do ARN U6 foi subtraído o da miARN alvo para se obter a mudança no valor de Ct. A mudança vezes na expressão do gene foi então determinada como unidades relativas log2. Os produtos de PCR foram detectados com um sistema de detecção 7500 sequência ABI PRISM e analisados ​​com o software SDS ABI PRISM 7500 (Applied Biosystems).

ensaio de gene repórter

Nós usamos luciferase ensaio de gene repórter promotor análise de força e estudando a regulação miRNA na expressão do transgene. pGluc plasmídeo contendo a construção de promotor de CMV accionado -luciferase foi adquirido a partir de (New England Biolabs, MA, EUA). O promotor EGP2 foi clonado em frente de um gene da luciferase (EGP2-luc) em substituição do promotor de CMV. Os 2 4 e cópias de sequências alvo deixou-7B foram clonados na região 3 ‘UTR do construto (EGP2-Luc). A transfecção foi feita de forma transiente com os seguintes plasmídeos CMV-Luc, EGP2-luc, EGP2-Luc-2T, EGP2-Luc-4T, EGP2-Luc-2C e EGP2-Luc-4C. Depois de 48 horas de transfecção com constructo de luciferase, as células foram lavadas com PBS e cultivadas em meio fresco durante mais 24 horas. As células foram colhidas e analisadas quanto a actividades da luciferase e β-galactosidase, de acordo com os protocolos do fabricante (New England Biolabs).

Western blot análise

De modo a analisar a expressão de TK e EpCAM proteínas, extractos celulares totais foram preparado por lise das células em tampão de lise [Tris 10 mM-HCl a pH 7,2 inibidores, ditiotreitol 2% de SDS, 10 mM, 1% de protease e fosfatase cocktail (Sigma Aldrich, MO, EUA)]. A concentração de proteína foi estimada pelo método de Lowry. Os lisados ​​de células foram misturados com tampão de carga 5X de Laemmli e fervido durante 5 min. Quantidades iguais (50 ug de proteína) foram sujeitos a electroforese num gel de 12% SDS-poliacrilamida e electro-transferidas para membrana de nitrocelulose. As manchas de membrana foram bloqueados durante 1 hora com 5% de leite magro em TBS contendo 0,1% de Tween-20 e depois incubadas durante a noite a 4 ° C com o anticorpo primário. O HSV-TK (fornecido pelo Dr. William C. Summers, Universidade de Yale) e anticorpos de EpCAM (sinalização celular, MA, EUA) foram utilizados a uma diluição de 1:100 e 1:150, respectivamente. As membranas foram lavadas e incubadas com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano apropriado (anti-coelho 1:5000; anti-rato 1:2000 (sinalização celular) durante 3 horas à temperatura ambiente e visualizada com peróxido de tetrametil benzidina /hidrogénio (TMB /H

2O

2, Bangalore Genei, Índia) de reagente de acordo com as instruções do fabricante. as membranas foram cortadas usando glicina 100 mM, pH 2, durante 40 min, bloqueado, e re-sondados para β-actina (Sigma). os blots foram digitalizados com um sistema UVP imagiologia BioDoc-TI (CA, EUA) e análise densitométrica de imagens digitalizadas foi realizada com o software ImageJ (NIH). a intensidade de cada banda foi normalizada com a intensidade da correspondente banda β-actina depois a normalização de fundo.

Medição da sensibilidade a ganciclovir (GCV)

o Y79, Weri-Rb1, Nthy-ori 3-1, MIO-M1cells foram semeadas numa placa de 96 poços 24 h antes da transfecção a uma densidade de 10.000 células por cavidade para determinar a viabilidade celular. a transfecção foi feita de forma transiente com plasmídeos contendo CMV-TK, EGP2-TK, EGP2-TK-2T, EGP2-TK-4T, EGP2-TK- 2C, EGP2-TK-4C e incubou-se durante 48 h. As células foram tratadas com várias concentrações (1, 10, 50.100 uM) de GCV durante 24 h. A sensibilidade à GCV foi avaliada utilizando o ensaio MTT colorimétrico. Um scanner de multi-poços (BioTek, VT, EUA) foi utilizado para medir a absorvância a 570 nm de comprimento de onda. Os controlos não tratados não transfectadas foi atribuído um valor de 100%. A sobrevivência das células foi calculado pela equação:. Teste OD /OD de controlo X 100%

Immunofluorscence

As seguintes linhas celulares transfectadas MIO-M1, Nthy-ori-3-1, weri-Rb1 , células Y79 foram lavadas com 1 x PBS e fixadas com paraformaldeído a 4% durante 10 min à temperatura ambiente e depois permeabilizadas com 0,25% de Triton X-100 durante 5 min. As células foram bloqueadas com soro de bovino fetal a 5% durante 30 min, incubadas com anti-caspase 3 clivada (sinalização celular) e anticorpo anti-Bcl-2 (sinalização celular) durante 3 horas, em seguida, com FITC (verde) e TRITC (vermelho) conjugado anticorpos secundários (Jackson Immunoresearch, PA, EUA) durante 2 h. As células marcadas foram visualizadas usando um Zesis Axio vison microscópio sistema invertido com objetiva de 10X. Para assegurar a especificidade da coloração, as imagens foram obtidas utilizando as configurações em que não foi detectável de fluorescência nos controlos negativos com anticorpos secundários sozinho (dados não mostrados).

A análise estatística

Os dados são expressos como média ± desvio padrão de 3 experiências com cada experiência feita em triplicado. A significância estatística foi calculada com o teste t de Student e um valor de p ≤ 0,05 foi considerado significativo.

Resultados

expressão restrita TK por EGP2 promotor

Analisamos a expressão seletiva do transgene pelo promotor EGP2 em Y79, weri-Rb1, Nthy-ori 3-1 linhas celulares. análise de Western blot mostrou a expressão da proteína EpCAM em Y79, Weri-Rb1, as células Nthy-ori 3-1 e sua expressão não foi visto na linha de células MIO-MI (Figura 1A). Portanto, o Y79, weri-Rb1, 3-1cells Nthy-ori foram considerados como EpCAM positiva (EpCAM

+ ve) e MIO-IM como EpCAM negativo (EpCAM

-ve) para a expressão da proteína de EpCAM. Para avaliar o promotor GPE-2 quanto à sua capacidade para regular a expressão de HSV-TK em células que expressam o EpCAM, que transfectadas transitoriamente com as células promotor EGP2 construto HSV-TK accionado (EGP2-TK). O CMV-promotor-driven HSV-TK (TK-CMV) construção foi utilizada como um controlo positivo. Em CMV-TK células transfectadas transientemente, TK proteína foi expressa em todas as linhas celulares (Nthy-ori 3-1, Y79, Weri-Rb1 e MIO-M1) (Figura 1B). Em EGP2-TK células transfectadas de forma transiente, expressão de TK foi visto em células 3-1, Y79 e weri-Rb1 Nthy-ori. Além disso, a expressão da proteína TK foi baixa em células MIO-M1 (Figura 1C). Isto pode ser devido ao leakiness do promotor EGP2 como relatado anteriormente em outros promotores de [34], [35]. Em tempo real experiências de PCR do gene de TK conduzido promotor de CMV mostraram expressão consistente em todas as linhas de células de 4 (Figura 1D). EGP2-TK transfectadas Nthy-ori 3-1, as linhas celulares Y79 e weri-Rb1 mostraram maior expressão significativa em comparação com o TK CMV-TK transfectadas linhas celulares. No entanto, o promotor de EpCAM significativamente reduzida expressão do gene TK na linha de células MIO-MI (Figura 1D). Ensaio do gene repórter mostraram que a transfecção de CMV-Luc exibiu uma expressão do gene mais elevada significativa em comparação com as células não transfectadas. A transfecção EGP2-luc para o 3-1, Y79, e linhas celulares weri-Rb1 Nthy-ori mostraram maior expressão de luciferase significativa em comparação com o CMV-Luc células transfectadas excepto no Mio-M1, onde a expressão da luciferase é significativamente menor em EGP2- transfecção Luc (Figura 1E). Estes resultados mostram que o promotor de EpCAM é selectivamente activado em linhas celulares de EpCAM positiva Y79, weri-Rb1, Nthy-ori 3-1, e não na linha celular negativa EpCAM MIO-M1.

expressão de EpCAM foi avaliada por Western e análise de mancha de β-actina foi utilizado como um controlo de carga (a). A expressão do transgene dirigida pelo promotor de CMV e EGP2 foi avaliada por transf ecção transitória de CMV-TK, EGP2-TK, CMV-Luc, e EGP2-luc. Após 2 dias de expressão de proteína transf ecção TK conduzido pelo promotor de CMV foi avaliada por análise de Western blot, e os resultados foram normalizados contra a β-actina (B). a expressão da proteína TK conduzido pelo promotor EGP2 foi avaliada por análise de Western Blot e os resultados foram normalizados contra a β-actina (C). quantificação de proteína foi quantificada utilizando o software ImageJ e expressão de proteína foi expressa em valores de intensidade relativa do sinal. Os níveis de ARNm TK foram quantificados por PCR em tempo real, os níveis de ARNm foram normalizados contra a GAPDH e foram expressos em unidades relativas de mudança de dobragem (D). A análise da expressão da luciferase foi realizado pela quantificação da luciferase Gaussia segregada. Os resultados foram normalizados contra células transfectadas-un e foram expressos em unidades de luz relativa (e). níveis normalizados de expressão de luciferase como percentagem mostrados como média ± D.P. (n = 3). * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001 vs. controlo, + p 0,05, ++ p 0,01, +++ p . 0,001 vs. CMV-Luc

promotor EGP-2 controla morte celular selectiva por expressão restrita de TK

a fim de avaliar os aspectos funcionais da expressão do gene TK, concentrações diferentes (1, 10, 50, 100? M) de tratamento com GCV foi feito por 24 horas em linhas celulares transfectadas transitoriamente CMV-TK ou EGP2-TK como Y79, weri-Rb1, Nthy-ori 3-1, MIO-M1. A concentração de 10 uM de tratamento com GCV mostrou quase de 50-60% da viabilidade celular no todo o CMV-TK transfectadas linhas celulares estudadas. A percentagem de viabilidade celular diminuiu com o aumento da concentração de GCV em Nthy-ori 3-1, Y79, e células weri-Rb1 (Figura 2A, 2C, 2D). Nestas linhas de células, a viabilidade celular foi diminuída sob o promotor TK EpCAM regulada em comparação com a do promotor de CMV TK regulada de EpCAM

+ ve células. Em células MIO-MI, a taxa de viabilidade celular é cerca de 60% sob a regulação do promotor CMV de TK /GCV (Figura 2B) e 90% sob a regulação do promotor EpCAM do gene. Além disso, a viabilidade celular diminuiu significativamente sob o promotor EpCAM TK regulamentada em Y79, Weri-Rb1, 3-1 células Nthy-ori. Estes resultados sugerem promotor EGP2 está expressando gene TK em EpCAM

+ ve e não nos EpCAM

linhas de células-ve.

ensaio de viabilidade celular por MTT foi avaliada por transfecção da EGP2-TK e CMV -tk plasmídeos para as linhas celulares. Nthy-ori-3-1 (A), Mio-M1 (B), Y79 (C), weri-Rb1 (D). Após 48 horas de transfeco, seguido por tratamento com GCV, a diferentes concentrações (1, 10, 50, 100 uM) durante 24 horas. Os resultados foram normalizados contra células transfectadas-un e foram expressos em percentagem de viabilidade celular. A viabilidade celular foi mostrada como percentagem média ± SD (n = 3).

Presença de deixá-7 família miARN no Retinoblastoma por em tempo real quantitativa de PCR

Tem sido relatado que , permitem-7 miRNAs familiares são apoptótica e altamente conservado entre as espécies em sequência e função e desregulamentação dos let-7 família leva ao câncer [25]. Analisamos o perfil de expressão de let-7 família em (n = 10) tumores retinoblastoma primárias e Y79, WER-Rb1, MIO-M1, linhas 3-1 celulares Nthy-ori (Figura 3). A família let-7 foi regulada para baixo em tumores primários, quando comparada com a da retina adulto normal. deixe-7a foi altamente regulada negativamente entre os let- 7 membros da família em tumores primários (Figura 3A, B). deixar-7c e 7d foram deixar-se altamente regulamentados em Y79 e weri-Rb1, respectivamente, quando comparado com a linha de Mio-M1cell (Figura 3C). Na linha celular de 3-1 Nthy-Ori, todos os miARN foram reguladas para cima em relação ao Mio-M1 (Figura 3C). Além disso, deixe-7b mostrou regulação para baixo consistente em ambas as linhas de células de retinoblastoma quando comparado a outros membros da família let-7 e mostrou alto-regulação na Nthy-ori 3-1. Assim, este (let-7b) foi escolhida para clonar sequências alvo de miRNA em nossas construções de plasmídeos.

A expressão de let-7 miRNAs foram quantificados utilizando PCR em tempo real. A análise de let-7 miARNs família expressão foi avaliada em tumores primários do retinoblastoma. Os resultados foram normalizados contra a retina adulta normal e foram expressos em valores de alteração de dobra em relação ao retina adulta normal (A, B). A análise de let-7 miARNs família expressão foi avaliado em linhas de células de retinoblastoma. Os resultados foram normalizados contra MIO-M1 e foram expressos em valores de alteração de vezes relativamente ao Mio-M1 (C). mudança vezes miRNA foi calculado usando 2

-▵▵CT método.

In vitro

ensaio de luciferase mediada por pCMV /EGP2-

luc

vetores

A transfecção de EGP2-TK e construções EGP2-luc na linha celular negativa EpCAM mostraram expressão significativa de TK e genes de luciferase (Figura 1 C, e). A citotoxicidade significativa após o tratamento com GCV observado na linha celular negativa EpCAM MIO-M1 sobre EGP2 TK-transfecção com o tratamento com GCV (Figura. 2B) pode ser devido à expressão de promotor gotejante EGP2 em linhas celulares negativas EpCAM. Uma expressão semelhante leaky do promotor GFAP foi observada em astrócitos normais [34]. Para regular a expressão não específica do transgene dirigida pelo promotor EGP2, que clonado alvos deixou-7b na região 3 ‘UTR do construto EGP2-Luc (Figura 4A). As células foram transfectadas com o EGP2-Luc, EGP2-Luc-2T-luc EGP2-4T, EGP2-Luc-2C, EGP2-Luc-4C construções de plasmídeos e expressão do gene da luciferase foi analisada após 24 horas. Uma redução significativa na atividade de luciferase foi observada com EGP2-luc-2T e EGP2-luc-4T quando comparado com EGP2-luc em MIO-M1 (EpCAM

ve /let-7b

-se regulamentada) e Nthy -ori 3-1 (EpCAM

+ ve /let-7b

-regulada) células (Figura 4B). Uma redução adicional significativa da actividade de luciferase em EGP2-Luc-2T em comparação com EGP2-Luc-4T foi observada em células MIO-M1. No entanto, em Y79 e Weri-Rb1 (EpCAM

+ ve /let7

regulada para baixo) células, não observamos redução significativa na atividade de luciferase de EGP2-luc-2T e EGP2-luc-4T em relação ao o EGP2-Luc (Figura 4B). Estes resultados enfatiza a necessidade de regulação da miARN da expressão do transgene, juntamente com o promotor específico de tecido para a expressão de transgene alvo.

miARN alvo sequências de duas ou quatro cópias de cópias, conforme detalhado na Tabela 1. O gene da luciferase repórter sob promotor de CMV foi clonado na construção de EpCAM-TK através da remoção do gene TK e inserção do gene da luciferase. miARN alvos foram clonados na região 3 ‘UTR do vector de expressão contendo o gene Gluc, com um promotor de EpCAM (A). A expressão da luciferase foi quantificado por secretada Gaussia luciferase. O plasmídeo constrói EGP2-Luc, EGP2-Luc-2T, EGP2-Luc-4T, EGP2-Luc-2C, e EGP2-Luc-4C foram transfectados para MIO-M1, Nthy-ori 3-1, Y79, weri-Rb1 linhas de celular. Após incubação durante 48 horas, os resultados foram normalizados para células transfectadas-un e foram expressos em unidades de luz relativas (B). níveis de luciferase são expressas como percentagem média ± D.P. (n = 3). * P 0,05, ** p 0,01, *** p . 0,001 vs EGP-2-luc-2T

celular citotoxicidade específica pela dupla transfecção controle do vetor com o tratamento GCV foi superior ETK sozinho

avaliou-se a citotoxicidade induzida por alvo o tratamento com GCV sobre EGP2-TK-2T e transfecção EGP2-TK-4T em comparação com os controlos EGP2-TK, EGP2-TK-2C e EGP2-TK-4C em todas as 4 linhas celulares. As linhas de células normais Nthy-ori 3-1 (Figura 5A) e MIO-M1 (Figura 5B) transfectadas com EGP2-TK-2T e EGP2-TK-4T constrói com o tratamento com GCV resultou numa morte celular significativa menor em comparação com o EGP2- TK. Estas linhas de células mostraram significativa menos citotoxicidade mediada por EGP2-TK-2T em relação ao construto EGP2-TK-4T. Em linhas de células de retinoblastoma Y79 (Figura 5C), weri-Rb-1 (Figura 5D) transfectadas com EGP2-TK, EGP2-TK-2T, EGP2-TK-4T, EGP2-TK-2C e EGP2-TK-4C constrói, seguido por tratamento com GCV não mostrou qualquer diferença significativa na morte celular. Estes resultados mostram que a citotoxicidade específica mediada por células por HSV-TK, após tratamento com droga GCV foi regulada por alvos de miARN deixou-7b nas linhas celulares normais.

ensaio de viabilidade celular por MTT foi avaliada por transfecção do EGP2-TK , EGP2-TK-2T, EGP2-TK-4T, EGP2-TK-2C, EGP2-TK-4C plasmídeos para as linhas de células, Nthy-ori-3-1 (a), Mio-M1 (B), Y79 ( C), weri-Rb1 (D). Após 48 horas de transfeco, seguido por tratamento com GCV, a diferentes concentrações (1, 10, 50, 100 uM) durante 24 horas, as leituras foram medidas a 570 nm utilizando espectrofotómetro. Os resultados foram normalizados para as células não transfectadas. A viabilidade celular foi mostrada como percentagem média ± D.P. (n = 3). * P 0,05, ** p 0,01, *** p . 0,001 vs. controlo

promotor EpCAM e sequência alvo deixe-7b medeia a expressão do marcador de apoptose em células de retinoblastoma

Para controlar a expressão gotejante relatado do gene TK nas células não-alvo normal (Figura 1 2), que transfectadas EGP2-TK, EGP2-TK-2T, EGP2-TK-2C constrói-se nas seguintes linhas celulares : N-Thy-Ori-3.1, MIO-M1, Y79 e Weri-Rb-1. Uma vez que, observou-se EGP2-TK-2T mostrou efeito significativo no controle da expressão do transgene, nós escolher apenas EGP2-TK-2T para analisar marcadores de apoptose após tratamento com GCV. A construção EGP2-TK foi altamente expressa em EpCAM

+ ve linhas celulares, Nthy-ori 3-1 (Figura 6A, pista 1), Y79 (Figura 6A, coluna 3), weri-Rb-1 (Figura 6A, pista 4), em comparação com EpCAM

-ve MIO-M1cell linha (Figura 6A, coluna 2). A transfecção da construção EGP2-TK-2T restrito a expressão TK apenas em linhas de células de retinoblastoma (Figura 6B, a pista 3, 4) e não em linhas de células normais, tais como MIO-M1 e Nthy-ori 3-1, mesmo na presença de proteína EpCAM. As linhas de células de retinoblastoma EGP2-TK-2T transfectadas tratadas com droga GCV mostrou o marcador de apoptose, activado Caspase3 e marcador necrótico PARP-1 expressão (Figura 6C, faixas 3, 4), mas não em linhas celulares normais (Figura 6c, pistas 1, 2). Para validar melhor a expressão dos marcadores de apoptose, foram realizadas experiências immunofluroscence onde foram observados resultados semelhantes, que apoia a expressão do marcador de apoptose em Western blot (Figura S1). Em vez de PARP foi utilizado Bcl-2, que é um marcador de anti apoptótica.

análise de Western blot foi realizada para detectar a presença da proteína TK, EGP2-TK foi transfectado em Nthy-ori-3-1, Mio-M1 , Y79 e linhas celulares weri-Rb-1 (A).