Abstract
Introdução
Apesar da melhoria das estratégias de tratamento para cabeça e carcinoma de células escamosas do pescoço (CECP), Os resultados não foram significativamente melhorado; destacando a importância de identificar novas abordagens terapêuticas para atingir esta doença. Para enfrentar esse desafio, procedeu-se avaliar o papel do ferro para CECP.
Experimental Design by
Os níveis de expressão de genes relacionados com o ferro foram avaliados em linhas celulares CECP usando RT-PCR quantitativo. efeitos fenotípicos celulares foram avaliados através de viabilidade (MTS), a sobrevivência clonogênica, BrdU, e ensaios de formação de tumor. O significado prognóstico de proteínas relacionadas com ferro foi determinada utilizando imuno-histoquímica.
Resultados
Em um painel de linhas celulares CECP, hemocromatose (HFE) foi um dos genes mais overexpressed envolvidos na regulação do ferro.
In vitro
knockdown de HFE em linhas de células de carcinoma epidermóide diminuiu significativamente a expressão da hepcidina (HAMP) e nível de ferro intracelular. Este, por sua vez, resultou numa redução significativa na viabilidade das células de carcinoma epidermóide, clonogenicidade, síntese de ADN, e a sinalização de Wnt. Estas alterações celulares foram revertidos pela re-introdução de ferro de volta para as células CECP após knockdown HFE, indicando que o ferro foi mediar este fenótipo. Concordante, o tratamento de células CECP com um quelante de ferro, ciclopirox olamina (CPX), reduziu significativamente a viabilidade e sobrevivência clonogênica. Finalmente, os pacientes com elevada expressão HFE experimentado uma sobrevida reduzida em comparação com pacientes com baixa expressão HFE.
Conclusões
Nossos dados identificar HFE como potencialmente novo marcador de prognóstico para CECP que promove a progressão do tumor
através
os níveis de ferro intracelulares elevadas e HAMP, levando ao aumento da proliferação celular e formação de tumores. Assim, estes resultados sugerem que os quelantes de ferro pode ter um papel terapêutico na gestão HNSCC
Citation:. Lenarduzzi M, Hui ABY, Yue S, Ito E, Shi W, Williams J, et al. (2013) Hemocromatose Melhora a progressão tumoral
via
regulação positiva de intracelular de ferro em Câncer de Cabeça e Pescoço. PLoS ONE 8 (8): e74075. doi: 10.1371 /journal.pone.0074075
editor: Seema Singh, University of South Alabama Cancer Institute Mitchell, Estados Unidos da América
Recebido: 18 de junho de 2013; Aceito: 22 de julho de 2013; Publicação: 26 de agosto de 2013
Direitos de autor: © 2013 Lenarduzzi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho tem sido apoiado por recursos do Instituto Ontário de Pesquisa do Câncer, a Canadian Institutes of Health Research, eo Dr. Mariano Elia Cadeira de Cabeça e Pescoço Cancer Research. Os autores também agradecem o apoio filantrópico da família de Wharton, da equipe de Joe, e Gordon Tozer. Michelle Lenarduzzi é um receptor de bolsas de estudo da Iniciativa de Treinamento Foundation Estratégico Terry Fox de Excelência em Radiation Research do século 21 (EIRR21) pelo Canadian Institutes of Health Research (CIHR), a Bolsa Ontario Pós-Graduação (OGS) eo Medical Biofísica Excellence prêmio. O suporte também é fornecido pelo Instituto Campbell Família de Pesquisa do Câncer e do Ministério da Saúde e planejamento de longo prazo. CIHR – https://www.cihr-irsc.gc.ca/e/193.html, EIRR21 – https://www.eirr21.utoronto.ca/, OGS – https://osap.gov.on.ca /OSAPPortal/en/A-ZListofAid/TCONT003465.html. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Cabeça e carcinoma de células escamosas do pescoço (CECP) é o sexto tipo de câncer mais comum no mundo, com ~ 650.000 novos casos diagnosticados e ~ 350.000 mortes por ano [1,2]. A maioria dos pacientes apresentam doença localmente avançada, e apesar das novas abordagens de tratamento, as taxas de sobrevida livre de doença em 5 anos estagnaram em 30-40% [3]. Estes maus resultados destacam a importância do desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para atingir esta doença.
O ferro é um elemento essencial envolvido em vários processos-chave, incluindo DNA e síntese do heme, a sinalização Wnt, e metabolismo celular [4,5]. Muitas células cancerosas exibem um aumento da demanda por ferro, a fim de manter a sua alta síntese de volume de negócios e DNA celular. Consequentemente, os genes envolvidos na regulação de ferro são frequentemente desregulado em cancros. Aqui, nós relatamos a superexpressão de hemocromatose (HFE) em CECP, e demonstrar sua capacidade de alterar o ferro intracelular e aumentam a proliferação celular.
A hemocromatose é glicoproteína trans-membrana, similar à molécula tipo classe principal de histocompatibilidade 1 ( MHC) que se associa com B
2-microglobulina para o transporte intracelular para a membrana do plasma [6]. Na membrana, HFE pode ligar-se a qualquer um dos receptores da transferrina 1 (TRF1) ou receptor de transferrina 2 (TFR2). Os sítios de ligação de HFE e amarrou ferro sobreposição de transferrina em TFR1 [7], regulando assim a absorção do ferro nas células. No entanto, a evidência mais recente sugere também que um papel central de HFE é para estimular a expressão da hormona reguladora ferro, hepcidina (HAMP), quer através da ligação com TFR2 [8], ou de forma independente [9]. A função do HAMP é internalizar e degradar ferroportina (FPN), o único exportador celular de ferro [10]; levando a um aumento dos níveis de ferro intracelulares através da inibição da libertação de ferro [10]. Como um exemplo, a sobreexpressão de HFE em macrófagos e linhas celulares de adenocarcinoma do cólon inibiu o efluxo de ferro intracelular [11,12].
Por outro lado, as mutações genéticas em
HFE
levar à condição de sobrecarga de ferro, hemocromatose hereditária (HH). A forma mais comum de HH é causada por uma única mutação de par de bases em HFE que resulta numa substituição C282Y [6], o que perturba a interacção entre HFE com B
2-microglobulina, e, por conseguinte, a orientação de HFE para a célula membrana. Os doentes com HH têm inadequadamente baixos níveis de [8] HAMP, destacando a importância da HFE para HAMP. Baixa HAMP resulta na libertação de ferro a partir de macrófagos reticuloendoteliais, e permite a absorção contínua de ferro a partir do intestino, levando a excesso de ferro em circulação [13]. Consequentemente, a transferrina circulante fica saturado, resultando no acúmulo de ferro nas células do parênquima de vários órgãos-finais, resultando em cirrose, diabetes, cardiopatia e câncer [13,14].
No presente estudo, relatamos a sobre-expressão de HFE em HSNCC, que por sua vez aumentou os níveis celulares de HAMP, e ferro intracelular. Perturbando os níveis de ferro intracelulares, HFE pode promover a proliferação celular, síntese de DNA, a sinalização Wnt, e formação de tumores
.
Materiais e Métodos
Declaração de Ética
Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com as orientações do Comitê de Cuidados animal da University Health Network (Toronto, Canadá). O protocolo foi aprovado pela Comissão de Cuidados com Animais na University Health Network (número de protocolo: 342,19).
As amostras dos pacientes foram coletados de 26 pacientes com CECP, com a aprovação do Conselho de Ética em Pesquisa Institucional University Health Network, (REB aprovação # 07-0521-CE). Essas amostras incluíram grupo de 12 recaída e 14 pacientes não-recaída combinado, com um tempo médio de follow-up de 3 anos. Os detalhes clínicos sobre esses 26 pacientes são apresentados na Tabela S1. Escrito ou consentimento oral não pode ser obtido a partir dos pacientes, devido ao período de nossa coorte (2003-2007). Portanto, nosso Conselho de Ética em Pesquisa Institucional University Health Network dispensou a exigência de consentimento informado por escrito dos participantes deste estudo.
linhagens de células e reagentes
A linha de células de CECP FaDu hipofaringe humana foi obtida a partir de a American Type Culture Collection (Manassas, VA) e cultivadas de acordo com as especificações do fabricante. As linhas de células humanas laríngeos escamosas, UTSCC-8 e UTSCC-42a (tipo presentes a partir de R Grénman, Hospital da Universidade de Turku, Turku, Finlândia) [15,16] foram mantidas com DMEM suplementado com 10% de soro fetal de bovino (Wisent, Inc) e 100 mg /l de penicilina /estreptomicina. As células epiteliais orais normais (NOEs) foram adquiridos comercialmente e cultivadas no meio recomendado (Celprogen). Todas as células foram mantidas em 37 ° C incubadora com umidificado CO 5%
2, autenticado no Centro de Genômica Aplicada (Hospital for Sick Children, Toronto, Canadá), utilizando o Kit AMPF /STR Identificador Amplificação por PCR (Applied Biosystems) , e rotineiramente testadas quanto à contaminação por micoplasma usando o kit de detecção de Mycoalert (Lonza Group Ltd).
a quantificação de ARNm
o ARN total foi extraído a partir de linhas celulares utilizando o kit de purificação de RNA total (Norgen), seguida de transcrição reversa usando SuperScript II transcriptase reversa (Invitrogen Canadá), de acordo com as especificações. níveis de transcrição de genes de ferro regulação: ferroportina (FPN), hepcidina (HAMP), hemocromatose (HFE), receptor de transferrina 1 (TFR1), ferritina de cadeia pesada (FTH1), cadeia leve ferritina (FTL) e ferritina mitocôndrias (FTMT) foram avaliados por qRT-PCR, utilizando SYBR verde mistura Mestre (Applied Biosystems), e o Prism 7900 Sequence Detection System ABI (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA), como previamente descrito [17]. As sequências iniciadoras usadas neste estudo são todos listados na Tabela S2.
experiências de transfecção
Os efeitos biológicos de HFE foram investigados utilizando ARNsi de segmentação HFE. siHFE1 (Hs_HFE_5 FlexiTube siARN) e siHFE2 (Hs_HFE_2 FlexiTube siARN) foram adquiridos de Qiagen. Um siRNA mexidos (Hs_Control_ss Flexitube siRNA) serviu como controle negativo. Todas as transfecções foram realizadas em meio completo sem antibióticos usando Lipofectamine 2000 e 20 nM siRNA, como descrito anteriormente [18].
Reagentes
Ciclopirox olamina (CPX), Deferoxamine sal de mesilato (DFO), citrato férrico de amónio (FAC) foram obtidos a partir de Sigma-Aldrich.
viabilidade e clonogénicos Ensaios
A viabilidade das células transfectadas com CECP siHFE + radiação (RT), ou células tratadas com CPX, foi determinada utilizando CellTiter 96 celular não radioactivo Ensaio de Proliferação (MTS) (Promega Biosciences), de acordo com as recomendações do fabricante. A capacidade de formação de colónias de células transfectadas com CECP siHFE + RT, ou células tratadas com CPX + RT foi determinada utilizando o ensaio clonogénico como previamente descrito [19]. Resumidamente, 48 horas após a transfecção com siHFE ou 72 horas após o tratamento com CPX, as células foram re-FADU semeadas em placas de 6 poços, e incubaram-se a 37
0C sob 5% de CO
2 durante 10-12 dias. As placas foram então lavadas e coradas com 0,1% de violeta cristal em 50% de metanol, e o número de colónias foi então contado. A fracção de células sobreviventes foi calculada pela comparação dos siHFE vs siCTRL ou CPX vs CTRL.
Citometria de Fluxo
análises de citometria de fluxo foram realizadas num citómetro de fluxo FACSCalibur (BD Biosciences), analisa foram realizadas utilizando FlowJo 7,5 software (Árvore Star, San Carlos, CA, EUA), como descrito anteriormente [17].
lábil ferro
A piscina de ferro lábil celular foi medida utilizando calceína-acetoxymethylester (calceína-AM) como especificado pelo fabricante (Invitrogen). As células transfectadas foram incubadas com 1 uM de calceína-AM durante 15 minutos a 37 ° C. As células foram lavadas com PBS, em seguida, medida por citometria de fluxo, como previamente descrito [18].
incorporação de BrdU
incorporação de BrdU foi medida utilizando Exalpha BrdU Biológica Colorimétrico ELISA Kit. Resumidamente, as células transfectadas foram incubadas com o reagente BrdU por 24 horas, fixadas, coradas e analisadas de acordo com as especificações do fabricante, conforme descrito anteriormente [18].
Experimentos ROS
espécies reativas de oxigênio
intracelulares (ROS) níveis foi medida utilizando o não-específica 5- (e 6-) clorometil-2 ‘, 7’-diacetato dichlorodihydrofluorescein (CM-H2DCFDA; excitação 488 nm, emissão 525 nm) conforme indicado pelo fabricante (Invitrogen). As células transfectadas foram incubadas com 5 uM de MC-H2DCFDA durante 30 minutos a 37 ° C. As células foram lavadas com PBS, em seguida, medida por citometria de fluxo [18].
Western Blot
FaDu células foram transfectadas com siHFE ou de controlo, 48 horas após a transfecção, as células foram lisadas em Tris 1M HCI (pH 8), NaCl 5 M, e 1% de NP40, mais o cocktail inibidor de protease (Roche Diagnostics). A concentração de proteína foi avaliada como previamente descrito [17]. As membranas foram sondadas com anticorpo anti-B-catenina monoclonal de coelho (sinalização celular, 8814) ou anticorpo monoclonal anti-HFE (Abnova) seguido de anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano (Abcam). GAPDH e a expressão da proteína α-tubulina foram utilizados como controlos de carga. Western blot foram quantificados com o Adobe Photoshop Pixel Quantificação Plug-In (Richard Rosenman Advertising design).
Experiências de resgate Ferro
FaDu células foram transfectadas com siHFE ou controle; 24 horas após a transfecção, as células foram tratadas com 5 uM de DFO, 5um de FACS ou um controlo negativo (DMSO). Quarenta e oito horas pós-transfecção, as células foram tratadas FADU com ou sem 2 Gy de RT. Cinco dias após a transfecção, a viabilidade celular foi medida como descrito acima.
Formação Tumor Ensaio
FaDu células foram transfectadas com siCTRL ou siHFE. Quarenta e oito horas mais tarde, as células viáveis foram colhidas e 2,5×10
5 células foram suspensas em 100 ul de meios de comunicação, e injectadas por via intramuscular no músculo do gastrocnémio de esquerda 8-10 semanas de idade, fêmea grave imunodeficiência combinada (SCID) de BALB /c ratos. O crescimento tumoral foi monitorizado medindo o diâmetro do tumor, mais de perna (TLD) de duas a três vezes por semana; os ratinhos foram sacrificados uma vez que o DPN atingiu 13 mm, como um ponto final humano.
Tumor ensaio de formação com CPX
Para o estudo CPX, duas semanas após a implantação de células tumorais FaDu como descrito acima, os murganhos foram tratados diariamente, de segunda a sexta-feira por gavagem oral com CPX (25 mg /kg) em água ou um veículo de controlo para um total de duas semanas. O crescimento tumoral foi monitorizado medindo o diâmetro do tumor, mais de perna (TLD) três vezes por semana; camundongos foram sacrificados uma vez que o TLD chegou a 13 mm como um ponto-final mais humano.
imunohistoquímica do Ferro Proteínas
A expressão de TFR1 e HFE foi avaliada em 26 seções HNSCC biópsia de diagnóstico primário usando recuperação antigênica microondas em combinação com o sistema Nível-2 Ultra estreptavidina e anti-HFE (Sigma HPA017276, 1/300 diluição), ou anti-TFR1 (Sigma HPA028598, diluição de 1/500), como previamente descrito [17]. Resumidamente, 4-UM secções foram deparaffin, tratado com um reagente de recuperação de antigénios, bloquearam-se com peróxido de hidrogénio a 3% e incubou-se com anticorpo anti-HFE ou anti-TFR1 a 4 ° C durante a noite. No dia seguinte, as secções foram incubadas com um anticorpo secundário biotinilado e estreptavidina para completar a coloração. coloração citoplasmática de anti-HFE ou anti-TFR1 foi pontuada de 0 a 3 com base na intensidade de coloração que foi definido em conformidade: 0 (sem coloração); 1 (aumento da coloração leve comparar com o epitélio normal correspondente); 2 (aumento da coloração moderada) e 3 (aumento da coloração intensa).
Análise Estatística
Todos os experimentos foram realizados pelo menos três vezes independentes, e os dados são apresentados como a média + erro padrão da média (EPM). A comparação entre os dois grupos de tratamento foram analisados utilizando
t
teste de Student. testes de dois lados foram aplicadas. Os resultados foram considerados significativos se o valor de p era inferior ou igual a 0,05. Análise e gráficos foram concluídas utilizando Graphpad Prism Software (Graphpad Software, Inc).
Resultados
HFE é sobre-expresso em linhas celulares de CECP em comparação com a linha de células NOE
Para identificar diferencialmente expressos genes de regulação de ferro em HNSCC, os níveis de expressão de mRNA basais em três linhas de células de carcinoma epidermóide, foram comparados aos de um NOE utilizando qRT-PCR. HFE foi anotado para ter o mais elevado nível de expressão 80 vezes a sobre-expressão em HNSCCs contra a linha celular de NOE (Figura 1A). A ferritina (FTH1) teve a segunda maior nível de sobreexpressão no FaDu e células UTSCC 42a, em comparação com o NOE. De nota, TFR1 também pareceu ser ligeiramente sobre-expresso em HNSCC em comparação com a linha celular de NOE.
(A) análise de qRT-PCR da FPN, HAMP, HFE, TFR1, FTH1, FTL e expressão em FTMT FaDu, 42a UTSCC e linhas celulares de cancro UTSCC8 CECP, normalizado a esses genes em células de NOE. células (B) FaDu foram transfectadas com 20 Nm de siCTRL ou siHFE1. A viabilidade celular foi avaliada nas células FADU pelo ensaio de MTS 24-72 horas pós-transfecção. células (C) FADU foram transfectadas com 20 nM de siCTRL ou siHFE1, então irradiadas 48 horas após a transfecção (4 Gy). A viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio de MTS 5 dias pós-transfecção. (D) a sobrevivência de células clonogénicas FADU foi medido 10 a 12 dias depois de semear as células re-tratados com siCTRL (20 nM) ou siHFE1 (20 nM) durante 72 horas. (E) A viabilidade celular das células de NOE foi avaliada por ensaio de MTS 24, 48 e 72 horas após a transfecção com 20 nM de siCTRL ou siHFE1. células (F) NOE foram transfectadas com 20 Nm de siCTRL ou siHFE1 ou 2 ?, em seguida, irradiada de 48 horas após a transfecção (4 Gy). A viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio de MTS, 5 dias após a transfecção. * P 0,05, ** P . 0.005, p = NS (não significativa)
Efeitos in vitro de HFE down regulation
A fim de avaliar o significado biológico de HFE sobreexpressão, knockdown experimentos foram realizados em células CECP utilizando uma abordagem de siRNA. knockdown sustentada foi conseguida em células FADU durante até 72 horas utilizando dois siRNAs independentes de segmentação HFE, tanto a transcrição e níveis de proteína (Figuras S1A e S1B). CECP células demonstraram uma redução significativa na viabilidade das células, com ou sem radiação após transfecção com siHFE comparação com siCTRL (Figura 1B-C, S1C-E). Além disso, a capacidade das células CECP para formar colónias foi significativamente reduzida com ou sem radiação após transfecção com siHFE em comparação com o siCTRL (Figura 1D, S1F-G). Em contraste, a viabilidade das células de NOE com ou sem radiação manteve-se inalterada após a transfecção com siHFE em comparação com o siCTRL (Figura 1E-F, S1H). Em geral, estas observações demonstraram que a diminuição HFE preferencialmente reduzida viabilidade e a clonogenicidade em comparação com as células de carcinoma epidermóide NOE. Para entender melhor o mecanismo (s) responsável por mediar este fenótipo, investigamos a capacidade de HFE para regular ferro celular.
HFE regulada HAMP ea piscina de ferro lábil em células CECP
Para determinar se HFE foi envolvido na regulação da hepcidina (HAMP), medimos níveis de mRNA de HAMP por qRT-PCR após transfecção com siHFE. FADU células demonstraram uma diminuição significativa nos níveis de transcrito de ARNm HAMP ( 0,5 vezes) durante até 72 horas após a transfecção com siHFE em comparação com o siCTRL (Figura 2A). Além disso, a piscina ferro lábil (LIP) também foi significativamente diminuída (em ~ 20%) após knockdown HFE em células em comparação com CECP siCTRL (Figura 2B). Em contraste, não houve alteração significativa no lábio em células NOE siHFE transfecção (Figura 2C). Em geral, estas experiências demonstraram a capacidade de HFE para alterar os níveis de ferro celulares, preferencialmente, em comparação com células de carcinoma epidermóide NOE. Para determinar se os níveis de ferro intracelulares estiveram envolvidos na mediação esses fenótipos siHFE, foi realizada uma série de experiências de resgate de ferro.
(A) qRT-PCR dos níveis de HAMP em 24, 48 e 72 horas pós-transfecção com 20 nM cada um dos siHFE1 ou siHFE2, em relação a dobrar-mudança de células tratadas com siCTRL. (B) Cellular piscina de ferro lábil (LIP) em células FaDu e UTSCC8 transfectadas com 20 nM cada um dos siCTRL ou siHFE, detectados por citometria de fluxo com calceína-AM em 24-72 horas pós-transfecção. (C) LIP celular de células NOE transfectadas com 20 nM de siCTRL ou siHFE, detectados por citometria de fluxo com calceína-AM em 24-72 horas após a transfecção. * P 0,05, ** P . 0,005, p = ns (não significativo)
Ferro medeia a proliferação de células de HFE
A viabilidade celular foi medida em células tratadas CECP com siHFE sozinho, siHFE com um quelante de ferro com deferoxamina (DFO), ou siHFE combinado com ferro solúvel (FAC), ambos com e sem RT (Figuras 3A S2A-B). Estes estudos demonstraram que a adição de DFO ainda mais reduzida viabilidade das células após CECP HFE knock-down, que foi completamente resgatado pela adição de CAA; RT não teve nenhum efeito significativo sobre diferencial este processo. Estes resultados confirmaram que o ferro era um mediador fundamental destes efeitos. Passamos então a avaliar os efeitos da siHFE em processos dependentes de ferro a jusante.
células FaDu (A) foram transfectadas com 20 nM cada um dos siCTRL ou siHFE1, em seguida, tratada com 5 uM de DFO, ou 5uM da FAC , 24 horas pós-transfecção, seguido de RT ± (4 Gy), 48 h pós-transfecção. A viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio de MTS 5 dias pós-transfecção. incorporação (B) BrdU foi avaliada em células FaDu 5 dias após a transfecção com 20 nM cada um dos siCTRL ou siHFE1, ± RT (4 Gy, 48 horas após a transfecção). células (C) FaDu foram transfectadas com 20 nM cada um dos siCTRL ou siHFE, ± RT (4 Gy, 48 horas após a transfecção). ROS nível celular total foi detectada por citometria de fluxo com CM-H2DCFDA 24-72 horas pós-RT. (D) Western blot de B-catenina foi medida em células FaDu 24-72hr transfecção post com siCTRL (20 nM) ou siHFE1 (20 nM); imagens (acima), a quantificação (abaixo). * P 0,05, ** P 0,005, *** P 0,0005, p = NS (não significativos)
O ensaio de incorporação de BrdU foi utilizado para medir alterações na síntese de DNA. CECP células transfectadas com siHFE demonstraram uma redução significativa (60%) na incorporação de BrdU em comparação com as células tratadas com siCTRL (Figura 3B, S2C). Em contraste, não foi observada alteração significativa na incorporação de BrdU para células transfectadas com NOE siHFE comparação com siCTRL-tratamento (Figura S2D). A citometria de fluxo foi utilizado para medir alterações nos níveis de ROS após siHFE. Como esperado, as células FADU demonstrou uma redução significativa nos níveis de ROS após transfecção com siHFE comparação com siCTRL, ambos com e sem RT (Figuras 3C e S2E). Por último, a via Wnt foi examinado por análise de alterações em B-catenina. células FaDu transfectadas com siHFE demonstraram uma redução significativa (~ 40%) nos níveis de B-catenina por até 72 horas em comparação células tratadas com siCTRL (Figura 3D).
siHFE marginalmente reduz a formação de tumor in vivo
em seguida, foram avaliados os efeitos de HFE knock-down em um
in vivo
modelo de tumor. Tumorigenicidade foi medido
in vivo
usando ratos SCID injectado por via intramuscular com células FaDu transfectadas com siHFE ou siCTRL. Supressão de siHFE marginalmente diminuída a formação de tumor em comparação com o controlo negativo, visível em pontos de tempo posteriores ( 27 dias). (Figura S2F)
quelante de ferro CPX reduziu a proliferação celular em linhas de células de carcinoma epidermóide
dadas as dificuldades na aplicação terapêutica de uma estratégia de siRNA, células CECP foram tratados com um quelante de ferro clinicamente aprovado, ciclopirox olamina (CPX), para determinar se o fenótipo siHFE pode ser reproduzido. O tratamento de linhas de células de carcinoma epidermóide com 5 uM de CPX resultou numa redução significativa na formação de colónias, com ou sem RT, em comparação com as células tratadas com veículo (Fig 4A, S3A-B). Em contraste, CPX teve um efeito muito menor sobre a viabilidade das células em comparação com NOE FADU (Figura 4B). Infelizmente, a administração de CPX durante 2 semanas a 25 mg /kg não conseguiu reduzir o crescimento tumoral no modelo de xenoenxerto FaDu (Figura S3C).
(A) a sobrevivência de células clonogénicas FADU foi medido 10 a 12 dias depois re-sementeira de células que foram tratados com etanol (5 uM) ou CPX (5 uM), durante 72 horas, seguido por RT (0, 2, 4 ou 6 Gy). (B) A viabilidade celular das células FaDu e NOE foi avaliada pela MTS ensaio de 72 horas após o tratamento com CPX (2,5 hum, 5 um ou 10 um). * P 0,05, ** P 0,005, *** P 0,0005, p = NS (não significativa)
proteínas de ferro são de-regulada em amostras de tecido CECP primária
a imuno-histoquímica (IHQ) foi utilizada para confirmar visualmente a expressão de HFE e TFR1 em tecidos CECP. Intenso imuno-expressão de ambos HFE e TFR1 foi observada no citoplasma das células tumorais, mas não no estroma adjacente ou linfócitos infiltrantes (Figura 5A e 5B). Em contraste, foi observado um mínimo de imuno-expressão de HFE e TFR1 numa laringe normal (Figura 5C-D), confirmando a expressão mais elevada de HFE e TFR1 em HNSCC versus tecidos normais. Quando a expressão de HFE ou TFR1 foram dicotomizadas entre alto (IHC ≥2)
vs
baixa. (IHC 2) níveis, os antigos grupos experimentaram uma sobrevida global mais curto em comparação com o último (Figura 5E-F ; p = 0,08); embora a significância estatística não foi alcançada devido ao pequeno tamanho da amostra. Da mesma forma, a pontuação média IHC tanto para HFE e TFR1 foi maior nos vs. amostras de pacientes não-recidiva recidiva (Figura S4A-B), mas foi estatisticamente significativa apenas para a expressão HFE (p = 0,04).
(a) a imagem representativa da expressão imuno-histoquímica HFE de uma biópsia HNSCC primário; as setas que indicam as células de tumor exibem sinal citoplasmática. (B) Uma imagem representativa da expressão imuno-histoquímica TFR1 de uma biópsia HNSCC primário; as setas que indicam as células de tumor exibem sinal membrana citoplasmática. (C) Uma imagem representativa da expressão imuno-histoquímica HFE de uma laringe normal. (D) A imagem representativa da expressão imuno-histoquímica TFR1 de uma laringe normal. (E) de Kaplan-Meier de sobrevida global em pacientes com CECP dicotomizadas com base na alta (≥2)
vs
. baixa ( 2) pontuação HFE imunohistoquímica. (F) de Kaplan-Meier de sobrevida global em pacientes com CECP dicotomizadas com base na alta (≥2)
vs
. baixa ( 2). pontuações TFR1 imunohistoquímica
Discussão
A seguir, relata pela primeira vez que HFE superexpressão parece ser um novo mecanismo responsável pela progressão da doença HNSCC. A sobre-expressão de HFE em HNSCC leva ao aumento da hepcidina, que por sua vez promove a acumulação de ferro intracelular, resultando na síntese de DNA aumentada, níveis elevados de ROS, sinalização de Wnt, todos a proliferação de células de tumor de condução e de clonogenicidade, com ferro como um mediador fundamental neste processo (Figura 6). Uma estratégia terapêutica potencial neste contexto é a utilização de uma olamina quelante de ferro ciclopirox (CPX), que preferencialmente reduzida sobrevivência clonogênica e viabilidade em células de CECP, com efeitos mínimos sobre as NOE. Além disso, HFE e TFR1 superexpressão demonstrou uma tendência de pior resultado, que documentar coletivamente o papel crítico da desregulamentação de ferro na progressão HNSCC.
Esquema mostrando que overexpresion HFE leva vinculativo B2M por tráfico de membrana celular. HFE aumenta HAMP directamente ou através TFR2. HAMP em seguida, sai da célula, através de um mecanismo desconhecido, e, por sua vez degrada FPN, o que leva à acumulação de ferro. Colectivamente, o que resulta em síntese aumentada de ADN, elevado ROS, e a sinalização de Wnt, todos a proliferação de células de tumor de condução e de clonogenicidade. Caixas em vermelho indicam os dados demonstrados neste estudo.
A evidência adicional da relevância destes ferro regula genes são fornecidos pelo exame das bases de dados CECP publicamente disponíveis (www.oncomine.org) [20 ], confirmando a superexpressão significativa tanto HFE [21], e TFR1 [21-23] no HNSCC amostras de pacientes, demonstrando que este é verdadeiramente um caminho comumente desregulado nesta doença. Além disso, também HFE foi sobre-expresso em outros cancros, incluindo o cérebro [24], carcinomas das células renais e [25]. Para identificar o potencial mecanismo (s), levando à sua sobre-expressão, o banco de dados HNSCC TCGA usando o software Cancer CBio Genomic Portal [26] foi interrogado comparando os níveis de transcrição tumorais para número de cópias de DNA em 295 conjuntos de dados discretos paciente. A maioria destes HNSCCs eram diplóides para
HFE
; daí alteração cromossômica não pareceu ser responsável pela sua sobre-expressão. No entanto, a amplificação do
gene TFR1
foi observada em 18% das amostras de CECP, o que correspondeu a níveis de expressão de mRNA TFR1 elevados, indicando alteração genômica como um mecanismo para TFR1 superexpressão para CECP. Dada a rede complexa de proteínas envolvidas na regulação de ferro [27], é evidente que vários mecanismos são responsáveis pela desregulação de ferro em cancros humanos. Por exemplo mTOR, que é frequentemente ativada em HNSCC [28] foi recentemente ligado a estabilidade TFR1 e regulação de ferro [29], proporcionando ainda um outro mecanismo para a desregulamentação de ferro em CECP. Assim, há provavelmente vários mecanismos diferentes que representam a superexpressão HFE para CECP, resultando em perturbações de ferro
A hemocromatose (HFE) é uma glicoproteína transmembranar, expressa amplamente por todo o corpo humano [30].; uma das suas funções principais é a de regular hepcidina (HAMP) [8], que, por sua vez, e internaliza ferroportin degradado (FPN) (ver Figura 6) [10]. HAMP alguma forma sai da célula, liga-se então a FPN na membrana do plasma, fazendo com que a fosforilação da tirosina que conduz à internalização de FPN. Uma vez internalizado, FPN é de-fosforilado, em seguida, ubiquitylated e degradada através da via lisossomal [31]. Em última análise, a degradação de FPN por HAMP leva à retenção de ferro intracelular.
Sob condições fisiológicas, HAMP é presumivelmente segregadas pelo fígado em resposta a alterações nos níveis de ferro do plasma. No entanto, evidências recentes sugerem que HAMP pode desempenhar um papel patológico em malignidades humanas; por exemplo, baixo FPN e alta HAMP têm sido associados com mau prognóstico no câncer de mama [32]. Níveis elevados de HAMP mRNA correlacionados com baixa expressão FPN no carcinoma colorectal [33]. O mecanismo preciso (s) qual elevada HAMP contribui para carcinogênese continua a ser elucidado; no entanto, é concebível que o HAMP pode ser segregada pelas células cancerosas para degradar FPN, aumentando assim os níveis de ferro intracelulares, tal como sugerido pelos nossos dados. De facto, os níveis séricos HAMP elevada tem sido associada com metástases carcinoma de células renais [34]; assim, os níveis elevados HAMP urinárias têm sido observados em pacientes com mieloma múltiplo [35], ambos sugerindo secreção patológica de HAMP pelas células cancerosas. Além disso, as células HeLa transitoriamente transfectadas com um plasmídeo contendo FPN e expostos a HAMP, resultou na internalização de FPN [10], demonstrando que os tumores responder aos HAMP de um modo semelhante como hepatócitos ou macrófagos.
A rede reguladora ferro contém mais de 151 espécies químicas e 107 reações passos [27], portanto, é estreitamente regulada. O fenômeno das células cancerosas que exigem mais ferro para manter a sua elevada síntese de volume de negócios e DNA celular é observada em muitas doenças malignas diferentes.