Abstract

Fundo

As células epiteliais no DNA liberação condições malignas para o extracelular compartimento. DNA livre de células de origem tumoral pode atuar como um ligante de mecanismos de detecção de ADN e mediar mudanças nas interações epiteliais-estromal.

Objectivos

Para avaliar e comparar o potencial efeito regulador autócrina e parácrina do normal e malignas epiteliais DNA em TLR9 e Sting mediada percursos em HT-29 células de adenocarcinoma colorrectal humano e fibroblastos normais. relacionados células-

Materiais e Métodos

DNA isolado do epitélio do cólon normal e tumoral de fresco amostras de tecido congelados removidos cirurgicamente foi utilizado para 24 e 6 horas de tratamento de HT-29 do carcinoma do cólon e células de fibroblastos de HDF-ct. Total genoma análise de expressão de ARNm e de qRT-PCR foi realizado para os elementos /membros da via de sinalização de TLR9. Imunocitoquímica foi realizada para os marcadores epiteliais (ou seja, CK20 e E-caderina), DNA metiltransferase 3a (DNMT3a) e NFkB (para células HDFα tratados).

Resultados

A administração de tumor derivado de DNA em HT29 células resultou em significativa (p 0,05) alteração do nível de mRNA em 118 genes (logFc≥1, p≤0,05), incluindo a superexpressão de genes metalotioneína (ou seja,

MT1H

,

MT1X

,

MT1P2

,

MT2A

), genes associados à metástase (ou seja,

TACSTD2

,

MACC1

,

MALAT1

), biomarcador tumoral (CEACAM5 ), genes metabólicos (ou seja,

INSIG1

,

LIPG

), genes molécula mensageira (ou seja,

DAPP

,

CREB3L2

).

Aumento

níveis de proteína de CK20, E-caderina, e DNMT3a foi observado após o tratamento de ADN de tumor em células HT-29. tratamento DNA saudável afetados expressão de mRNA de 613 genes (logFc≥1, p≤0,05), incluindo o aumento da expressão de moléculas de adaptador de chave de TLR9 via (por exemplo,

MyD88

,

IRAK2

,

NFkB

,

IL8

,

IL-1β

), via de STING (ADAR, IRF7, CXCL10, CASP1) e a

FGF2

gene.

Conclusões

ADN a partir do epitélio do cólon tumoral, mas não a partir de células epiteliais normais actua como um factor pró-metastática de células HT-29 através da sobre-expressão de genes pró-metastáticos através TLR9 /MyD88 via independente. Em contraste, o ADN derivado do epitélio do cólon induzida saudável TLR9 e picam via de sinalização em fibroblastos normais

citação:. Furi I, Kalmár A, B Wichmann, Spisak S, Scholler A, Bartak B, et al. (2015) DNA Cell livres do tumor Origem induz uma ‘metastático do perfil de expressão na linha celular de cancro HT-29. PLoS ONE 10 (7): e0131699. doi: 10.1371 /journal.pone.0131699

editor: Javier S. Castresana, da Universidade de Navarra, Espanha

Recebido: 08 de abril de 2015; Aceito: 05 de junho de 2015; Publicação: 02 de julho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Furi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão disponíveis através da Expressão gênica Omnibus (GEO), sob o número de acesso GSE67557

Financiamento:. Este estudo foi financiado pelo Fundo de Pesquisa e Tecnologia da inovação, Hungria, KMR_12-1-2012-0216 à BM e Investigação Científica da Hungria Fundo (concessão OTKA-K111743) para ZT. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

interações epiteliais-estromal alterados são fundamentais na formação do câncer. Entre os ligantes reguladoras conhecidas (fatores de crescimento, por exemplo, citocinas, quimiocinas, hormonas sexuais) DNA derivadas de tecido do tumor é também envolvidos nesta comunicação através de receptores celulares de detecção de ADN [1] De acordo com vários estudos [2-4] os fragmentos de DNA de origem tumoral (ou seja, 21 a 500 bases de sequências curtas de origem humana) desempenham um papel na formação de um microambiente tumoral de suporte (ou seja, promover a invasão pelo tumor e a evasão da vigilância imunológica) [5-8] o ADN isento de células origina a partir necrótica /células tumorais apoptóticas, e pode ser libertada activamente pelas células vivas para o compartimento intracelular [9-12]. Este tecido tumoral de DNA originado é detectável no plasma e no soro e poderia servir um biomarcador útil para a detecção do cancro [11]. Ele contém um número de entidades específicas de cancro, incluindo oncogenes, genes supressores de tumores, microssatélites aberrantes, genes aberrantes de metilação do DNA, e rearranjado cromossómico de ADN [12]. Estudos recentes confirmaram a captação e a retenção de oncogenes estimular a proliferação celular em células não malignas, após a integração (oncometastasis) para os destinatários cell’s genoma [13].

Na medida em que eles são entendidas, a detecção de ADN mecanismos nas células alvo compreendem duas principais vias de adaptador, ou seja, receptores toll-like (TLR9) e o estimulador de genes interferon (STING) vias. [14] citoplasmática TLR9 reconhece ligantes endógenos, tais como padrões moleculares associados a perigo (amortece) como as sequências de ADN não metilado [7, 8, 15] a quantidade total de DNA não metilados aumenta em paralelo com a hipometilação global do DNA no tecido do tumor em comparação com o tecido normal [16]. A expressão aumentada de TLR9 foi detectado em vários tipos de tumores. [1, 17-20] O aumento da expressão em células de carcinoma de TLR9 foi associada com maior potencial metastático, enquanto que uma maior expressão de TLR9 por células semelhantes a fibroblastos foi associado com uma baixa probabilidade de metástases [ ,,,0],21]

o STING via de sinalização é um adaptador para o ADN através de ligação de dinucle�idos cíclicos gerados pela enzima sintetase de GMP cíclico-AMP (cGAMP) (cGAS). [22-24]

Strong sinergismo tem sido observado entre cooperando STING e sinalização TLR9. Estas duas vias de sinalização são diferencialmente regulados por moléculas cruciais adaptador (IRF3 /7, picada, e MyD88) [25]. Além disso Deng et al. (2014) e Woo et al. (2014) forneceram evidências sugerindo células dendríticas detectar o DNA de células tumorais através do, caminho de detecção de ADN citosólica mediada por STING. [22, 26, 27]

Com base em nossos resultados anteriores, HT-29 células de adenocarcinoma de cólon humano refletido nível de metilação do DNA alterada (via atividade methyltranferase elevada DNMT3a) e CK20 expressão do marcador epitelial após a re-administração de DNA auto [28]. no presente estudo analisamos os efeitos autócrinos e parácrinos de ADN de tumor e o tecido saudável em células HT-29 de cancro e fibroblastos por análise da expressão de ARNm inteiro genómico, e qRT PCR para validação de genes de TLR9 via. Além disso análise imunocitoquímica foi realizada para os marcadores de diferenciação seleccionados, moléculas de adesão, e cell- metiltransferases, para efeitos de verificação no nível de proteína após o tratamento com DNA a partir de tecidos normais e tumorais.

Materiais e Métodos

HT -29 cultura de células

células HT-29 adenocarcinoma de cólon humano foram adquiridos à LGC Standards (cat. No. ATCC HTB-38) e cultivadas num laboratório de cultura de células específicas isentas de agentes patogénicos, a 37 ° C em 5% CO

2. Células HT-29 foram mantidas em meio modificado 5a (Cat No. M8403-500 mL Sigma-Aldrich, St Louis, EUA) de McCoy suplementado com 10% (vol /vol) de soro fetal de bovino (FBS; padrão de qualidade; PAA Laboratories GmbH, Pasching, Áustria), 160 ug /ml de gentamicina (Sandoz, Sandoz GmbH, Áustria), e 125 ug /ml de anfotericina B (Sigma-Aldrich, St Louis, EUA).

cultura

HDFα celular

HDFα células foram comprados na Life Technologies (cat. No. C0135C) e cultivadas em laboratório específica de cultura celular isento de agentes patogénicos, a 37 ° C em 5% de CO2. HDFα células foram mantidas em meio 106 (Life Technologies Corporation, Carlsbad, EUA) suplementado com LSGS (Life Technologies Corporation, Carlsbad, EUA) e anfotericina B (Sigma). 160 ug /ml de gentamicina (Sandoz, Sandoz GmbH, Áustria).

isolamento de ADN

O DNA genômico foi isolado de áreas macroscopicamente normais perto câncer colorretal (CRC) e das áreas de tecidos tumorais de cirurgicamente amostras de CRC removidos macrodissected frescos congelados (fase II, os tumores de cólon sigmóide e reto (25-50 mg de tecido) por PCR kit de preparação modelo High Pure (Roche GmbH, Alemanha) moderadamente diferenciado. Estes pacientes CRC foram todos confirmados por diagnóstico histológico definitivo e recebeu nenhuma quimioterapia ou radioterapia pré-operatória. O ADN isolado, livre de proteína foi tratada com 20 ul de ARNase A /T1 mistura a 37 ° C durante 1 hora (Thermo Scientific, Alemanha). A concentração de ADN isolado e purificado foi determinada por Nanodrop- 1000 espectrofotômetro (Thermo Scientific, Alemanha).

Ética declaração

o estudo foi realizado de acordo com a declaração de Helsinki e aprovado pelo Comitê de Ética Semmelweis University e da governamental Comissão de Ciência Regional e Institucional e Ética em Pesquisa (TUKEB), Nr: 23.970-2 /2011). consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes incluídos no estudo.

tratamento de DNA de células HDFα

HT-29 e HDFα células foram semeadas (HT-29 e com uma densidade de 0,5×10

6 e 0.1×10

6) em 6 cavidades de cultura celular Corning CellBIND placas com múltiplas cavidades em meio RPMI 1640 suplementado com gentamicina, anfotericina B e FBS. Quando as monocamadas atingiu 80-90% de confluência, 15 ug de ADN normal ou tumoral (dissolvido em 200 ul de fosfato estéril tamponado salino (PBS) foram adicionadas aos poços. O controlo negativo compreendeu os volumes apropriados de PBS. As células foram incubadas a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO2 e 95% de humidade.

Isolamento de ARN total para Affymetrix HGU133 mais 2,0 microarray e a expressão do gene qRT-PCR analisa

Após 24 horas, as células foram lavadas duas vezes em 5 ml de PBS estéril. Após a segunda lavagem, as células foram ressuspensas em 5 ml de PBS. 2.5 ml de suspensão celular foi usado para o isolamento de ARN total. o RNA total a partir dos isolados células HT-29 foi extraída com o RNeasy Mini kit (Qiagen, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. o ARN isolado foi guardado a -80 ° C.

expressão de ARNm de microarray análise

a quantidade e qualidade do ARN isolado foi testada medindo a absorvância e por gelelectrophoresis capilar usando o Bioanalyzer 2100 e 6000 ARN Kit de Pico (Agilent Inc, Santa Clara, EUA). sondas Biotinylated ARNc foram sintetizados a partir de 4,82 ± 0,60 mg RNA total e fragmentado usando o One-Cycle alvo rotulagem e controlo Kit de acordo com a descrição Affymetrix. Dez? G de cada amostra de ARNc fragmentado foram hibridados em HGU133 Plus2.0 matriz (Affymetrix) a 45 ° C durante 16 horas. Os microarrays foram lavadas e coradas utilizando Fluídica Estação 450 (Affymetrix) e um método de coloração de amplificação anticorpo de acordo com as instruções do fabricante. Os sinais fluorescentes foram detectados por um scanner GeneChip 3000 (Affymetrix).

A avaliação estatística da expressão de mRNA perfis análises

Pré-processamento e controle de qualidade foram realizadas de acordo com as sugestões do tumor Análise Melhor Grupo de Trabalho de práticas (Tumor Análise Best Practices Grupo de Trabalho, 2004). As imagens digitalizadas foram inspecionadas para artefatos; Foram avaliadas e grau de degradação do RNA; a percentagem de chamadas atuais (25% RIN 8, em todos os casos), a transcrição reversa foi realizada utilizando-se 1 ug de ARN total (de alta Capacidade de ADNc transcrição reversa kit, Applied Biosystems, EUA)

quantitativo em tempo real (qRT. ) A PCR foi efectuada utilizando sondas de Mestre e SYBR green (Roche GmbH, Alemanha). Os níveis de expressão de genes para cada uma das amostras individuais foram normalizadas para a expressão de GAPDH. expressão gênica relativa média foi determinada e as diferenças foram calculadas pelo método 2-Sc (t). primers de oligonucleotídeos de TLR 9 (dependente de MyD88) via de sinalização estão listadas na Tabela 1.

ensaios de viabilidade celular

0.1×10

6 HT-29 células foram semeadas a uma densidade de 0.1×10

6 em cultura de células Corning CellBIND placas de múltiplos poços em RPMI 1640, suplementado com gentamicina e FCS. Após 24 horas, o meio foi mudado; e, 15 ug de ADN de tumor e normal, [dissolvido em 200 ul de fosfato estéril tamponado salino (PBS)] foi adicionada aos poços. O controlo negativo é constituído por um volume adequado de PBS. As células foram incubadas a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO2 e 95% de humidade durante 72 horas.

Depois de 72 horas de tratamento, as células foram colhidas, lavadas duas vezes em 0,5 ml de PBS estéril, ressuspensas em 1,0 ml de gelo etanol frio a 70% e armazenadas a -20 ° C. A medição foi realizada em triplicado para cada grupo de tratamento.

As amostras foram centrifugadas durante 3 minutos a 1300 rpm. Em seguida, as células foram re-suspensas em 300 μ1 de tampão de extracção; e, foi adicionado 3 mL de RNAse (RNase A T1 Mix /, Thermo Fisher Scientific Baltics UAB, Vilnius, Lituânia). Após 15 min de incubação à temperatura ambiente, 3 mL de jodide de propídio (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA; Cat No. 81845.) Foi adicionado. A medição foi realizada por FACS em BD FACScalibur (New Jersey, EUA).

foram realizados ensaios de exclusão de azul tripano para avaliar a viabilidade celular após exposição ao tumor e de ADN isento de células normais. A viabilidade cell’s HT-29 foi então quantificada por contagem do número de células vivas e mortas utilizando um hemocitômetro no tumor tempo ponto 72h pós e administração DNA normal.

imunocitoquímica análise

De a suspensão de células HT-29 de 2,5 ml foi usada para a imunocitoquímica (ICC) analisa. Células HT-29 foram cito-centrifugada para uma lamela e fixadas em metanol a -20 ° C durante 10 minutos, e, em seguida, incubadas em TBS contendo 1% de albumina de soro de bovino, soro de cabra normal a 10%, glicina 0,3 M e 0,1% de Tween 20 , por 1h para permeabilizar as células e bloquear interacções não específicas proteína-proteína.

2×10

5 fibroblastos HDFα foram semeadas a um Lab-Tek lâminas de 8 poços câmara em 500 media ul (Thermo Scientific, Rochester, NY, EUA) e cultivadas até 80-90% de confluência. Após o tratamento do ADN, as células foram fixadas em metanol arrefecido em gelo a -20 ° C durante 10 minutos, e, em seguida, incubadas em PBS contendo 1% de albumina de soro bovino, /10% de soro de cabra normal, /0.3 M de glicina e de 0,1% de Tween 20, . TBS-Tween durante 1 h para permeabilizar as células e bloquear interacções não específicas proteína-proteína

para a imunocoloração, as células foram tratadas com murganho anti-humano monoclonal de anti-IgG de TLR9 (1: 300; ab85860, Abcam, Cambridge, MA, EUA), e anti-IgG de DNMT3a (1: 300; ab13888, Abcam, Cambridge, MA, EUA) a 4 ° C durante a noite, utilizando células HeLa como controlo positivo; anti-citoqueratina 20 (1: 200, clone: ​​PCK-26, Dako, Glostrup, Dinamarca), a E-caderina (1: 2, clone: ​​ECH6, Histopatologia Ltd, CPE, Hungria) utilizando mucosa do cólon humano como um controlo positivo; e de coelho anti-IgG de NFkB (1: 100, GTX102090, Genetex, San Antonio, Texas, EUA) utilizando as células de HepG2 como um controlo positivo

As secções foram incubadas durante 30 min com peroxidase de rábano-polímero marcado com peroxidase. (HRP) conjugada com anticorpo de cabra anti-ratinho /imunoglobulinas de coelho (Envision + System-HRP-DAB; Dako, Glostrup, Dinamarca). A coloração foi completada por incubação com 3,3’diaminobenzidine solução de cromogénio (solução cromogénio é parte do kit Envision). As secções foram contrastadas com hematoxilina.

Avaliação ICC

As lâminas foram digitalizadas usando uma resolução alta instrumento de digitalização Panorâmica (3DHistech Ltd., Hungria) e analisados ​​com o software panorâmico Visualizador Histoquant Module (3DHistech Ltd ., Hungria). Foram avaliadas 1000 células /deslizamento. No caso de E-caderina, CK20, imunorreacções citoplasmáticos foram marcados como negativos (-), fraca (+), moderada (++) forte e (+++). NFkB, dnmt3a nucleares /citoplasmáticas expressões foram marcados como negativos (-), fraca (+), moderada (++) e fortes (+++) imunorreacções. A densidade do negativo (-)., Fraco (+), moderada (++) e forte positiva (+++) pixels em células imunorreactivas foi avaliada

Resultados

Efeito do normal e ADN epitelial maligna de células HT-29

primeiro, tratadas as células HT-29 com o DNA isolado a partir de tecido normal ou de tumor. Ambos os tratamentos induzidas ARNm sobre-expressão de genes de metalotioneina (i.e. MT1H, MT1G, MT1X, MT1P2 e MT2A) (1H, metalotioneína -1G, -1X, -1P2, -2A) (Figura 1A e 1B). O tecido tumoral tratamento ADN derivado resultou na sobre-expressão significativa de n = 118 genes (ao nível do ARNm). Entre estes genes, observamos metástase genes associados por exemplo, biomarcador tumor CEACAM5 (moléculas de adesão carcinoembriônico relacionadas com antigénio das células 5), por exemplo, genes metabólicos INSIG1 (insulina induzida gene 1) LIPG (lipase endotelial) e genes molécula mensageira DAPP1 (adaptador dupla de fosfotirosina e 3-fosfoinositidos), CREB3L2 (proteína de ligação ao elemento de resposta a cAMP como 3-2) (Tabela 2)

mapa de calor mudanças de expressão RNA representando em células HT-29 de controle e células HT-29 tratado com DNA isolado de saudável (A) e tumoral (B) epitélio do cólon.

A lista completa de genes regulados está disponível em (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) com o número de acesso GSE67557.

Análise de 12 elementos de TLR9 via em células HT-29 por qRT-PCR

Em células HT-29, quer de tumor e DNA derivado saudável tecido do cólon afectado significativamente a expressão do gene de IL-1β relacionada com controlos tratados com PBS. A sobre-expressão desse gene era mais elevada após tratamento tecido tumoral de DNA derivada (log Fc 2,33; p £ 0,05), do que nas amostras tratadas com ADN normal (log Fc 1,59; p £ 0,05) em relação aos controlos não tratados (Fig 2A e 2B).

mudanças de expressão de genes via dependente TLR9 MyD88 sobre Affymetrix U 133 2.0 microarray no controle, ADN tratadas amostras normais e tumorais (a) Forma e q análise de RT-PCR de TLR9 MyD88 via dependente de células HT-29 ( B).

ensaios de viabilidade celular

os resultados do teste de exclusão de azul tripano refletidos que o tratamento DNA livre de células de tumor aumentou significativamente o número de células que vivem em relação ao grupo controle (av. 54,22 ± 3,03 vs. 42,00 ± 3,78; p ≤ 0,05). Nós também detectou diminuiu significativamente o número de células vivas no grupo tratado com DNA normal, relacionadas ao grupo controle (av 28,67 ± 3,08 vs. 42,00 ± 3,78;. P≤0,05); (Fig 3A e 3B)

Número de viver (A) e mortos (B) células HT-29 determinadas pelo Trypan teste de exclusão de azul.; PI análise do ciclo celular de HT-29 células cancerígenas do cólon (C).

A análise do ciclo celular PI mostraram significativamente maior população de células de estar (G1 + S + G2 + M fase) no DNA tumor tratado grupo vs. grupo controle (av 39,11 ± 0,57 vs. 32,00 ± 2,50;. p≤0,05). tratamento DNA normal não afetou o ciclo celular de células contadas, mas observou-se uma contagem de células menor em amostras de DNA tratadas normais (Fig 3C).

Efeito do DNA epiteliais normais e malignas nas células de fibroblastos

o tratamento de fibroblastos HDFα com ADN normal resultou na sobre-expressão de vários genes na via de TLR9 MyD88, citocinas, quimiocinas, factores de crescimento, os genes relacionados com apoptose, e prostaglandinas. No total, o DNA a partir de tecido de cólon normal, resultou numa alteração significativa expressão para n = 613 genes (Fig 4A). Em contraste, o tratamento com ADN-tecido de tumor derivado afectou a expressão de apenas N = 12 genes (Fig 4B).

mapa de calor que representa as mudanças de expressão de RNA em células de controlo e células HDFα HDF-ct tratados com DNA isolado a partir de saudável (a) e tumoral (B) epitélio do cólon.

alterações de expressão de genes importantes induzidos por tecido saudável originado tratamento do ADN em células HDFα estão resumidos na Tabela 3. o ADN isento de células induzidas a regulação positiva de quimiocina ligandos como factores quimiotácticos, prostaglandinas e receptores de prostaglandinas, para além das vias de detecção de ADN.

a seguir ao tratamento do tumor do ADN dos fibroblastos HDFα, não se observou sobre-expressão dos elementos da via de TLR9, quimiocinas, factores de crescimento , genes relacionados à apoptose, prostaglandinas e receptores para prostaglandinas.

Uma lista completa dos genes regulados está disponível em (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) com o número de acesso GSE67557.

Análise de elementos 12 de TLR9 via em fibroblastos por qRT-PCR

cinco genes da via canonical TLR9 (IRAK2, MyD88, NFKB, IL-8, IL-1β) mostraram sobreexpressão significativa após o tratamento com tecido normal DNA livre de células derivadas relacionadas com células de controlo. tecido tumoral tratamento DNA derivado não afetou os genes de TLR9 MyD88 via. (Log Fc ≥1; p≤0,05); (Figura 5A e 5B).

alterações da expressão de genes via dependente de MyD88 TLR9 em Affymetrix 133 L 2,0 microarray no controle, ADN tratado amostras normais e tumorais (A) e Q análise de RT-PCR da via dependente de MyD88 TLR9 em HDF células alfa (B).

análise ICC de marcadores de diferenciação, adesão e metilação epiteliais

Aqui nós selecionamos três marcadores epiteliais ou seja, CK20. E-caderina, DNMT3a com base em nossos resultados anteriores. [28] tratados com PBS células HT-29 mostrou fraca membrana CK20 (Fig 6A), a E-caderina (Fig 6D) e fraca /moderada DNMT3a citoplasmático (Figura 6G) a expressão da proteína. tratamento ADN do tumor induzida aumento na expressão de CK20 fortemente positiva (+++) pixels, (Fig 6C) de E-caderina fraca (+) e moderada (++) pixels positivos (Fig 6F) e dnmt3a fracos (+) pixels positivos ( Fig 6I). (P≤0,05). Tumor ADN promovido expressão CK20 e E-caderina nas, células HT-29 adenocarcinoma do cólon não diferenciadas tanto em ARNm e o nível de proteína (Tabela 4, Figura 6C e 6F) (p £ 0,05). DNMT3a superexpressão da proteína correlacionados com os resultados anteriores [28].

CK20 expressão em células HT-29 do cancro do cólon após o tratamento por PBS estéril (A), por ADN a partir do epitélio de cólon normal (B), por a partir de ADN tumorais de cólon epitélio (C) a expressão da E-caderina, após o tratamento por PBS estéril (D), por ADN a partir do epitélio do cólon normal (E), por ADN a partir tumoral cólon epitélio (F) expressão DNMT3a após o tratamento por PBS estéril (L) , pelo DNA a partir do epitélio do cólon normal (h), por DNA a partir do epitélio do cólon tumoral (I).

análise ICC de fatores de transcrição e marcadores de metilação em fibroblastos

A NF-kB (subunidade p65) reflecte fraca expressão citoplasmática /nucleolic em PBS tratados fibroblastos de controlo (Fig 7D). Por efeito do ADN de tecido normal (Figura 7E), mas não tecido tumoral originado ADN, (Figura 7F) os fibroblastos reflectida aumento na expressão de NFkB fracos pixels positivos (+).

DNMT3a expressão em fibroblastos alfa HDF após o tratamento por PBS estéril (a), por ADN a partir do epitélio do cólon normal (B), por ADN a partir tumoral epitélio do cólon (C), a expressão de NFkB, após o tratamento por PBS estéril (D), por ADN a partir do epitélio do cólon normal (E ), por DNA a partir tumoral epitélio do cólon (F).

A expressão DNMT3a citoplasmática estava em um (++) fraca (+), moderada em fibroblastos normais (Fig 7a). A proporção de fraca (+) pixels positivos foi ligeiramente aumentado após o tratamento de ADN normal e tumoral (Figura 7B e 7C).

Os nossos resultados imunocitoquímicos sobre células HT-29 e fibroblastos HDFα estão resumidos na Figura 8A, 8B , 8C, 8D e 8E.

avaliação ICC de CK20 (a), e-caderina (B) e DNMT3a (C) em células HT-29 cancro do cólon e NFkB (D) e DNMT3a (e) em HDF fibroblastos alfa.

Discussão

O principal objetivo do nosso trabalho foi analisar mudanças na expressão gênica após a administração de DNA livre de células isoladas de tecido do cólon saudável e tumoral sobre HT-29 células epiteliais e fibroblastos. Não temos conhecimento de quaisquer estudos que examinaram as mudanças de expressão nos dois tipos de células diferentes que colaboraram durante tumorigênese ou o efeito do DNA livre de células de diferentes origens. De acordo com estudos publicados recentes, ADN bacteriano activa os receptores de detecção de ADN, possivelmente devido à sua frequência de sequências de CpG não metiladas em genoma bacteriano, o que é 20 vezes mais elevada do que no genoma de vertebrados. [35] A partir de outros estudos, ficou claro que o DNA de patogenicidade bactérias regular a expressão TLR9 [15], no presente estudo examinamos as alterações de expressão de genes induzidos por DNA de origem do tumor em células cancerosas, por matriz genoma inteiro. Esta abordagem é semelhante ao descrito por Lee et. ai. (2014) que demonstraram a captação, incorporação e efeito deste tecido do tumor originado DNA sobre a proliferação celular. [13]

Nossa align gene resultados de expressão são confirmadas com observações em publicações recentes, que demonstraram que o DNA do tumor intacto liga-se como um ligando para TLR9, mas não resulta na activação a jusante de TLR9 via [36]. No nosso estudo, os nossos resultados de matriz inteira do genoma fornecida evidência de que o DNA atos tumorais como um factor pró-metastático independentemente de entre as vias de TLR9 e picam por induzir a sobre-expressão de genes associados a metástase (MACC1, MALAT1, TACSTD2), o marcador de tumor (CEA) , genes metabólicos (INSIG1, LIPG) e genes molécula mensageira (DAPP, CREB3L2). MACC1 é um importante factor de pró-metastático que mostraram sobreexpressão significativa após o tratamento com ADN do tumor. Este gene está intimamente associada com as alterações das expressões de cycle- celular e proteínas relacionadas à invasão. [37] Os resultados refletem sobre-expressão de outros genes importantes pró-metastáticos (MACC1, MALAT1, TACSTD2) são confirmados pelos dados anteriores refletindo o importante papel desses genes na metástase e sua associação com mau prognóstico em vários cancros epiteliais humanas. [29, 37, 38]

o tecido tumoral tratamento DNA derivado afetados INSIG 1 e expressão LIPG. Estes dois elementos-chave do metabolismo de lípidos endotelial também são conhecidos por estarem associados com a progressão do cancro. [31, 32] A expressão aumentada LIPG foi classificado como um possível biomarcador cancro urinário. [32] Os estudos descritos aumento da expressão de moléculas mensageiras secundárias (ADPP, CREB3L2) no cancro do cólon com o crescimento e invasão de células cancerígenas do cólon via PI3K /AKT activação. [33]

observou-se que o tratamento com ADN do tumor também resulta em sobre-expressão de citoqueratina 20, e e-caderina, que foi validado tanto no ARN (Tabela 4) e o nível de proteína (Figura 6C e 6F ). E-caderina como um factor muito importante que regula a interacção célula-célula também mostraram maior expressão nas células HT-29 tratadas com ADN do tumor. E-caderina sobre-expressão conduz à supressão de β-catenina-Tcf transcrição /Lef-dependente e provavelmente inibe a apoptose de células. [39]

mudanças de metilação do DNA mediada por DNMT3a são característicos dos cancros do cólon. Re-expressão de factores de segmentação expressão DNMT3a diminuíram significativamente o crescimento do tumor. DNMT3a sobre-expressão após tratamento com ADN do tumor infere uma ligação potencial entre o estado de metilação de ADN derivada de tecido tumoral e o mecanismo de acção de sequências de ADN derivadas de tecidos tumorais que actuam através de receptores de detecção de ADN. Estudos anteriores destacar um papel crucial desta enzima na formação do cancro colorectal. [40]

tecido de câncer de cólon não é isolado, mas com o seu meio celular através de sinais de quimiocinas, citocinas, crescimento e apoptose está se comunicando com outros tecidos. Os estudos examinaram o papel dos fibroblastos normais e de cancro associados (FAC) em cancro colorectal e mostrou que FAC co-cultivadas com células epiteliais aumenta o crescimento de tumores [41], mas não determinar o papel de fibroblastos normais separadamente na tumorigénese. O nosso objectivo foi determinar a reacção de fibroblastos normais em torno das criptas epiteliais para o ADN libertado e para rastrear as vias incluídas no referido processo.

Em tratamento normal de fibroblastos com DNA a partir de tecido normal provocada a activação da via canónica TLR9 , como qRT-PCR revelou a sobre-expressão de muitos genes envolvidos na via dependente de MyD88 TLR9 (MyD88, IRAK2, NFkB, IL-8, IL-1β).

a partir dos resultados de análise do genoma inteiro de microarray pode-se concluir que o DNA saudável em fibroblastos não só é reconhecido por TLR9 MYD 88 via dependente, mas achamos que os elementos da via citosólica dependente de STING também mostrou superexpressão significativa, que inicia a produção de IFN. Usando o mapa via de KEGG (https://www.genome.jp/kegg-bin/show_pathway?hsa04623+340061) 4 genes (ADAR, IRF7, CXCL10, CASP1) da via de STING mostrou superexpressão significativa após o tratamento com DNA saudável em fibroblastos de HDF-ct. Este activado cgas /dependente de STING via sensoriamento DNA superexpressão induzida de interferon fatores reguladores IRF1, IRF2, IRF7, IRF9. e induziu um aumento da expressão de genes do receptor de interferão (IFNAR2, IFNGR2). (Log FC≥1, p≤0,05) A superexpressão de CASP1 e NLRC 5 sugerem ativação NLRC5 dependente do inflammasome. Davis et. ai. publicado que NLRC5 coopera com knockdown NLRP3and RNA de interferência mediada por NLRC5 quase eliminado caspase 1 actividade. [42]

NFkB como um factor regulador da transcrição mostrou sobre-expressão significativa nos fibroblastos tratados com DNA normal. (Fig 7E) Isso mostra que o DNA livre celular induzida translocação NFkB regula a liberação de citocinas pró-inflamatórias e fatores de crescimento.

análise do genoma microarray todo mostrou um número surpreendentemente diferente de genes que regulam a administração DNA saudável e tumor de tecido derivado (613 e 12 genes, respectivamente). Enquanto ADN saudável activado sistemas de detecção de ADN e upregulated muitos genes para citocinas, quimiocinas, factores de crescimento, os genes relacionados com apoptose, prostaglandinas, ADN do tumor afectadas apenas alguns genes, que não envolvem esta em processos de regulação. Nós pensamos que os fibroblastos normais não reagem com o DNA do tumor e uma interação câncer de fibroblastos de longo prazo poderia iniciar uma transformação de fibroblastos normais para fibroblastos associados a carcinoma apoio fenótipo “metastático”.

Nosso estudo aponta a possibilidade de metástase