Abstract

Fundo

Em nosso estudo recente, o tecido análise proteômica de lesões pré-malignas orais (passos ópticos) e mucosa oral normal levou à identificação de um painel de marcadores, incluindo prothymosin alfa (PTMA), para distinguir passos ópticos dos tecidos orais histologicamente normais. Este estudo teve como objetivo determinar o significado clínico da PTMA superexpressão na hiperplasia de células escamosas oral, displasia e cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas (CECP).

Metodologia

A imuno-histoquímica de proteína PTMA foi realizada em HNSCCs (n = 100), hiperplasia de células escamosas (n = 116), displasia (n = 50) e nos tecidos orais histologicamente normais (n = 100). A análise estatística foi realizada para determinar a associação de PTMA superexpressão com os parâmetros clínico e prognóstico da doença mais de 7 anos para pacientes com CECP.

Resultados

A nossa análise imunohistoquímica demonstrou superexpressão significativa de PTMA nuclear em células escamosas hiperplasia (63,8%), displasia (50%) e carcinoma epidermóide (61%) em comparação com a mucosa normal (p

tendência 0,001). O teste do qui-quadrado mostrou associação significativa de PTMA nuclear com estágios tumorais avançados (III + IV). análise de sobrevivência Kaplan Meier indicou sobrevida livre de doença reduzida (DFS) em pacientes com CECP (p 0,001; sobrevida média de 11 meses). Notavelmente, a análise de Cox-multivariada revelou PTMA nuclear como um preditor independente de mau prognóstico dos pacientes com CECP (p 0,001, o rácio da Hazard, HR = 5,2; IC95% = 2,3-11,8) em comparação com o grau histológico, T-estágio, estatuto nodal e estágio do tumor.

Conclusões

PTMA Nuclear pode servir como marcador de prognóstico para CECP para determinar o subconjunto de pacientes que são susceptíveis de demonstrar a recorrência da doença.

citação: Tripathi SC, Matta A, Kaur J, J Grigull, Chauhan SS, Thakar A, et al. (2011) sobre-expressão de Prothymosin Alpha prediz doença mau resultado em Câncer de Cabeça e Pescoço. PLoS ONE 6 (5): e19213. doi: 10.1371 /journal.pone.0019213

editor: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., Estados Unidos da América

Recebido: 11 de outubro de 2010; Aceito: 29 de março de 2011; Publicado em: 05 de maio de 2011

Direitos de autor: © 2011 Tripathi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. SCT é suportado por uma bolsa de Investigação Sênior de Conselho indiano de Pesquisa médica (ICMR), Nova Deli, Índia. AM é destinatário de MITACS Acelerar Fellow. RR agradece o apoio de Joseph e Mildred Sonshine Centro para Doenças cabeça e pescoço e Temmy Latner /Fundação Dynacare Família, Canadá. RR e KWMS reconhecer financiamento dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR), parcerias científicas e tecnológicas International Canada (ISTP Canada) e do Departamento de Biotecnologia (DBT), Índia. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

alpha prothymosin Humano (PTMA) é um ácido-rica proteína nuclear 12,5 kDa, não-histona, composta por 110 aminoácidos [1]. PTMA é conhecida por desempenhar um papel importante na regulação do ciclo celular, a proliferação, a transcrição, a remodelação da cromatina, de resposta ao estresse oxidativo e apoptose [2] – [8]. Superexpressão de PTMA tem sido relatado em várias doenças malignas como o câncer de mama [5], hepatocarcinoma [9], o cancro do pulmão [10], neuroblastoma [11], o cancro da bexiga [12], gástrica [13] e do trato urinário superior carcinoma de células transicionais [14]. Além disso, PTMA também serviu como marcador de prognóstico para cancros da mama, gástrico, da próstata e bexiga [5], [13], [15], [16]. Recentemente, identificamos PTMA entre o painel de biomarcadores que podem encontrar a sua utilidade em distinguir passos ópticos e HNSCCs de tecidos não malignos, usando tags isobáricos para quantificação relativa e absoluta (iTRAQ) rotulagem e espectrometria de massa de cromatografia líquida /conjunto multidimensional (LC-MS /MS) [17].

HNSCC está entre os dez cânceres mais prevalentes no mundo, com uma maior proporção que ocorre em países em desenvolvimento. Tabaco, quid betel e consumo de álcool, bem como vírus do papiloma humano (HPV) são os principais fatores de risco associados ao desenvolvimento de câncer de cabeça e pescoço [18] – [24]. carcinoma de células escamosas oral (CCEO), um dos principais subtipos de CECP, geralmente é precedido por lesões clinicamente bem definidos, tais como leucoplasia, que é causalmente relacionada com a exposição crônica da mucosa oral a agentes cancerígenos /promotores de crescimento em tabaco e /ou quid betel. Em média cerca de 1-2% destas lesões orais transformar em câncer por ano [25] – [27]. Além disso, mais do que 50% de todos os pacientes com CECP tem doença avançada no momento do diagnóstico [28]. Embora, tenha havido avanços em modalidades de tratamento que melhorem a qualidade de vida e têm valor paliativos, as taxas de sobrevivência para pacientes com CECP não melhoraram significativamente (cerca de 50%), muitas vezes devido à recorrência ou segundo tumor primário loco-regional observadas comumente em os sobreviventes [27] – [30]. Actualmente, os fatores prognósticos mais importantes para HNSCC são grau histológico do tumor, estágio, profundidade de invasão tumoral e comprometimento de linfonodos regionais no momento do diagnóstico. No entanto, nenhum desses fatores pode predizer o prognóstico de HNSCC de forma eficaz, reforçando a importância da identificação de novos biomarcadores para a detecção precoce, avaliação de risco e previsão precisa de recorrência para este malignidade.

Neste estudo, teve como objetivo determinar o significado clínico da PTMA superexpressão em cabeça e pescoço tumorigênese. Analisou-se a expressão de PTMA em uma grande coorte de amostras clínicas, incluindo a mucosa normal, hiperplasia de células escamosas, displasia e HNSCC por imuno-histoquímica. Além disso, investigamos as correlações de expressão PTMA nuclear com os parâmetros clínico de escamosas hiperplasia das células, displasia e HNSCC para determinar a sua utilidade como um biomarcador.

Resultados

Correlação de PTMA nuclear na hiperplasia de células escamosas, displasia e HNSCC com características clinicopatológicas

Para determinar o significado clínico da proteína PTMA na tumorigênese de cabeça e pescoço, sua expressão foi analisada em mucosa normal, hiperplasia de células escamosas, displasia e HNSCC utilizando imuno-histoquímica. A Figura 1A mostra a distribuição da pontuação total de PTMA nuclear na mucosa normal, hiperplasia de células escamosas, displasia e HNSCC. Dos 100 histologicamente tecidos normais analisados, 88 tecidos (88%) não apresentaram imunocoloração PTMA detectáveis ​​no núcleo das células epiteliais em tecidos normais (Tabela 1, Figura 1B (i)). expressão PTMA foi observada em 5 de 43 (11,6%) emparelhado tecidos normais e 7 de 57 (12,3%) apenas tecidos normais desemparelhados. análise de tendências quadrado Chi também mostrou aumento significativo na expressão nuclear do PTMA em tecidos obtidos a partir de diferentes estágios de tumorigênese de cabeça e pescoço (hiperplasia de células escamosas, displasia e HNSCC, p

tendência 0,001). Entre hiperplasia de células escamosas (n = 116), 74 casos (63,8%) apresentaram aumento significativo na imunorreactividade PTMA nuclear (p 0,001, OU = 12,9, IC 95% = 6,3-26,3) em comparação com os tecidos orais normais (Tabela 2 e A Figura 1B (iii)). expressão nuclear aumentada de PTMA também foi observada em 50% displasia (25 de 50 casos, p 0,001, OR = 7,3, IC de 95% = 3,2-16,6), em comparação com os tecidos orais normais (Tabela 3 e Figura 1B (v)), . As Tabelas 1, 2 e 3 resumem correlações de PTMA nuclear com os parâmetros clínico da mucosa oral normal, hiperplasia de células escamosas e displasia respectivamente. Curiosamente, PTMA nuclear mostrou associação significativa com os hábitos de consumo de tabaco de pacientes com hiperplasia de células escamosas (p 0,001)

(a) análise Box-Plot:. Os diagramas de caixa mostrando a distribuição dos escores totais com base em imuno-histoquímica de proteína PTMA em secções embebidas em parafina de tecidos normais orais, hiperplasia de células escamosas, displasia e HNSCC. O eixo vertical mostra a pontuação total de imunocoloração, obtida tal como descrito na secção de Métodos. Figura mostra a distribuição de pontuação total de expressão nuclear PTMA na hiperplasia de células escamosas (intervalo de pontuação 0-7), displasia (intervalo de pontuação 0-7) e HNSCC (intervalo de pontuação 0-7). (B) análise imuno-histoquímica de PTMA na cabeça e pescoço tecidos: seções parafina-encaixadas de mucosa oral normal histologicamente, hiperplasia de células escamosas, displasia e HNSCC foram coradas com o anticorpo anti-PTMA policlonal como descrito na secção de Métodos. (I) mucosa oral normal mostrando nenhum imunocoloração PTMA; (Ii) a hiperplasia de células escamosas não mostrando nenhuma marcação para PTMA; (Iii) a hiperplasia de células escamosas mostrando imunocoloração PTMA nuclear em células epiteliais; (Iv) displasia mostrando nenhum imunocoloração PTMA nuclear; (V) que descreve displasia imunocoloração PTMA nuclear em células epiteliais; (Vi) seção HNSCC mostrando nenhuma coloração PTMA nuclear; (Vii) a seção HNSCC ilustrando a coloração PTMA nuclear nas células tumorais; (Viii) secção de tecido câncer de bexiga mostrando imunocoloração PTMA nuclear; secção HNSCC (IX) usado como um controlo negativo, não mostrando nenhum imunocoloração PTMA em células de tumor; (Ampliação original i-ix × 200).

Entre HNSCC, 61% dos casos mostrou a localização nuclear de PTMA nas células tumorais, em comparação com tecidos orais normais (p 0,001, OU = 11,5, IC 95% = 5,7-23,7; Tabela 4 e Figura 1B (vii)). Os parâmetros clínico de CECP e suas correlações com expressão PTMA nuclear são apresentados na Tabela 4. Curiosamente, PTMA nuclear mostrou associação significativa com o estágio do tumor avançado (p = 0,03). Notavelmente, nenhum dos tecidos CECP apresentaram imunocoloração citoplásmica PTMA. O controlo positivo (cancro da bexiga) mostrou intensa expressão PTMA nuclear (Figura 1B (VIII)), enquanto que nenhuma imunocoloração foi observada em secções de tecido utilizados como controlos negativos, onde o anticorpo primário foi substituído por isotipo IgG específica (Figura 1B (IX)).

a capacidade de PTMA nuclear para distinguir escamosas hiperplasia das células, displasia e HNSCC da mucosa oral normal foi determinado através da avaliação de sensibilidade, especificidade, valores preditivos positivos e negativos e a área sob a curva (AUC) usando a análise Característica (ROC) Receiver Operating. Os valores de sensibilidade, especificidade e a AUC para a hiperplasia de célula escamosa, displasia e carcinoma epidermóide são dadas na Tabela 5. O valor preditivo positivo (PPV) foram de 86,0, 67,6 e 83,6 para expressão nuclear de PTMA respectivamente nos três grupos (Tabela 5).

PTMA superexpressão como um marcador de prognóstico independente para HNSCC

O poder de previsão estimada de expressão PTMA com mau prognóstico foi avaliada por análise de sobrevivência de Kaplan-Meier. pacientes com CECP abrigando PTMA nuclear mostraram uma redução significativamente a sobrevida livre de doença (p 0,001; sobrevida média de 11 meses) em comparação com os pacientes que não apresentam nuclear imunocoloração PTMA (Figura 2D). Cox-multivariada análise de regressão foi realizada para determinar o potencial prognóstico da PTMA nuclear para CECP em comparação com outros parâmetros clincopathological incluindo idade, sexo, grau histológico, T-estágio, de status nodal e estágio do tumor. Curiosamente, PTMA nuclear emergiu como um preditor independente e mais significativo de mau prognóstico em pacientes com CECP em análise multivariada (p 0,001, HR = 5,2; IC95% = 2,3-11,8).

(a) de Kaplan Meier estimativa da proporção acumulada de sobrevida livre de doença, o tempo médio de sobrevida livre de doença (DFS: nenhuma recidiva /metástase) em pacientes com CECP mostrando imunomarcação nuclear de PTMA foi de 11 meses, em comparação com os pacientes que não apresentam imunocoloração PTMA nuclear (p 0,001); (B) Os valores preditivos positivos: Os valores preditivos positivos [PPV (t)] por hora de reincidência do câncer por 51 pacientes com CECP com PTMA (+) (linha contínua) e para todos os pacientes 77 CECP com dados de sobrevivência (linha tracejada); (C) Negativo valores preditivos: negativo valores preditivos [NPV (t)] por hora de reincidência do câncer por 26 pacientes com PTMA (-) (linha contínua), e para todos os 77 pacientes (linha tracejada)

.

com base em nossos dados, o valor prognóstico adicional que a expressão PTMA nuclear prevista prevendo (PPV) ou exclusão (VPL) recorrência de câncer em pacientes com CECP foi medida pelos rácios: PPV

recaída /CECP (83 meses | PTMA ) /PPV

recaída /CECP (83 meses) = 78,4 /61,0; NPV

recaída /CECP (83 meses | PTMA) /NPV

recaída /CECP (83 meses) = 73,1 /39,0 (Figura 2e 2f). Assim, estes resultados demonstram claramente o potencial de PTMA nuclear como um marcador para prever a recorrência em CECP.

Verificação de PTMA superexpressão por RT-PCR e Immunoblotting

A superexpressão de PTMA na hiperplasia de células escamosas , displasia e carcinoma epidermóide em comparação com a mucosa oral normal foi verificada por meio de RT-PCR e immunoblotting nas mesmas amostras de tecido utilizadas para a análise imuno-histoquímica. A análise de RT-PCR demonstrou o aumento dos níveis de transcritos de PTMA em hiperplasia de células escamosas (H1, H2), displasia (D1, D2) e CECP (T1, T2, T3), em comparação com tecidos normais (N1, N2) (Figura 3A) . A análise de imunotransferência utilizando anticorpos específicos para PTMA mostrou claramente uma única banda intensa de 12,5 kDa em lisados ​​celulares totais obtidos a partir de hiperplasia de célula escamosa (H1, H2), displasia (D1, D2) e HNSCCs (T1, T2), enquanto que nenhuma banda pode ser detectada na mucosa oral normal (N1, N2) (Figura 3b). Juntos, esses resultados confirmam superexpressão de PTMA na hiperplasia de células escamosas, displasia e CECP em comparação com tecidos orais normais.

(a) análise de RT-PCR de PTMA na mucosa normal, hiperplasia de células escamosas, displasia e tecidos CECP . Painel mostra o aumento dos níveis de transcritos de PTMA em hiperplasia de células escamosas (H1, H2), displasia (D1, D2) e HNSCC (T1, T2, T3), em comparação com a mucosa oral normal (N1, N2) que mostrou níveis basais de transcrição PTMA . β-actina foi utilizado como um controlo para normalizar a quantidade de ARN utilizado em cada reacção de RT-PCR é mostrada no painel inferior. (B) Análise de imunotransferência: Análise de imunotransferência de PTMA na mucosa oral normal (N1, N2), a hiperplasia de células escamosas (H1, H2), displasia (D1, D2) e HNSCC (T1, T2). Uma quantidade igual de lisados ​​de proteína foram sujeitos a electroforese em 12% SDS-PAGE e transferidas para membrana de PVDF. A membrana foi incubada com os respectivos anticorpos primários e anticorpos secundários, conforme descrito na secção de Métodos e o sinal detectado pelo método de quimioluminescência aumentada. Painel mostra o aumento da expressão de PTMA em hiperplasia de células escamosas (H1, H2), displasia (D1, D2) e HNSCC (T1, T2) em comparação com a mucosa oral normal (N1, N2). GAPDH foi utilizado como controle de carga (painel inferior).

Discussão

A inflamação crônica na mucosa oral culmina no desenvolvimento de passos ópticos, algumas das quais o progresso para a malignidade franca. Neste modelo de várias etapas de cabeça e tumorigênese pescoço, lesões orais, tais como leucoplasia com evidência histopatológica de displasia, também considerado como lesões pré-malignas ou potencialmente malignos, estão em alto risco de progressão para o câncer – muitas vezes, mas nem sempre correlacionar com a gravidade da displasia epitelial [31]. No entanto, lesões orais com hiperplasia de células escamosas têm sido em grande parte excluída da análise molecular na maioria dos estudos. Aqui, nós demonstramos que as alterações na expressão da proteína pode ocorrer nas fases iniciais da cabeça e pescoço carcinogênese isto é, hiperplasia de células escamosas, o que pode explicar o aumento da proliferação. Outro grande desafio clínico é avaliar o prognóstico do CECP efetivamente, destacando assim a necessidade urgente de biomarcadores que podem predizer o risco de recorrência para CECP. As descobertas mais importantes do nosso estudo são: (i) aumento significativo na expressão PTMA nuclear na hiperplasia de células escamosas e displasia em comparação com os tecidos orais normais; (Ii) o aumento do potencial de PTMA nuclear para diferenciar escamosas hiperplasia das células, displasia e HNSCC da mucosa oral normal, com alta sensibilidade e especificidade; (Iii) potencial de PTMA nuclear na previsão de recorrência em CECP. Para o melhor de nosso conhecimento, esta investigação demonstra a primeira evidência clínica de aumento da expressão PTMA nuclear em lesões pré-malignas e CECP em grande escala. Além disso, estudo também verificou o nosso relatório anterior de aumento da expressão da proteína PTMA em passos ópticos identificados utilizando rotulagem iTRAQ e análise proteômica de tecido, embora em número limitado de casos [32].

O aumento significativo da expressão de PTMA nuclear lesões precoces com hiperplasia de células escamosas sugere seu potencial para identificar pacientes em um estágio inicial, antes do início da displasia. Isto é bem suportado pelo papel de PTMA nuclear na regulação do ciclo celular e proliferação [33]. Além disso, o aumento da expressão PTMA nuclear também tem sido relatada em resposta à inflamação. Notavelmente, timosina alfa 1 derivada a partir do seu precursor PTMA tem sido relatada como sendo um regulador endógeno da homeostase imune que controla a inflamação, a imunidade, e a tolerância em uma variedade de situações clínicas [34]. É importante ressaltar que a inflamação crônica tem sido amplamente associada ao desenvolvimento de CECP [35] e nossos achados de superexpressão PTMA nuclear na hiperplasia de células escamosas, displasia e tumores francas nos tenta a especular papel da PTMA na ligação entre inflamação e câncer desenvolvimento. Reconhecemos também a possível ligação entre a expressão PTMA nuclear e risco de confirmação necessidades de desenvolvimento de câncer em um estudo de acompanhamento de longo prazo de pacientes com hiperplasia de células escamosas; tais estudos longitudinais são um desafio, mas estes pacientes estão sendo acompanhados de monitorização regular da progressão da doença.

Em apoio das nossas descobertas, Suzuki et al., relataram um aumento da expressão PTMA nuclear com a progressão do epitélio normal, por meio intra-epitelial prostática neoplasia de carcinomas, sugerindo seu envolvimento na diferenciação e progressão do câncer de próstata [15]. Vários outros estudos também sugeriram um papel semelhante para a PTMA na proliferação celular como uma oncoproteína [5] – [7], [33], [36] – [38]. PTMA não está apenas relacionada com a proliferação, mas está directamente envolvido no processo, provavelmente como um componente no início da proliferação eventos desencadeada pelos genes myc [8], [39]. Ele também afecta a actividade de factores de transcrição específicos, incluindo o receptor de estrogénio (ER), p53, p21 e transdutores de sinal e activadores de transcrição 3 [36], [40], [41]. Notavelmente, a expressão é regulada positivamente PTMA por proteína de ligação de ARN estrogénio, Hur, c-myc e E2F, enquanto o p53 actua como um regulador negativo da transcrição [40], [42] – [44]. Além disso, PTMA interage com histonas e afeta cromatina remodelação processos [36], [45] – [47]. Além disso, o papel de PTMA na adesão, migração e proliferação foi reportado no cancro do ovário humano [48].

O mais importante, no nosso estudo PTMA expressão nuclear emergiu como um prognosticador pobre independente na análise multivariada, em comparação com os fatores clínicos e patológicos conhecidos para HNSCC incluindo grau histológico [bem diferenciado (WD), moderadamente diferenciado (MD) e pouco diferenciado (PD)], T-estágio, a positividade do linfonodo e estágio do tumor. Além disso, a análise do potencial preditivo de PTMA revelada a sua utilidade como um marcador para identificar HNSCC agressivo, apoiando a associação observada por análise de Kaplan-Meier e análise de regressão logística. Tomados em conjunto, estes resultados demonstraram o potencial do PTMA nuclear como um potencial marcador para prever mau prognóstico de CECP. No entanto, o papel biológico de PTMA na progressão HNSCC e recorrência não é claramente compreendido, garantindo, assim, maiores investigações em estudos futuros. perfis de expressão alterada de PTMA também tem sido relatada em diversas outras doenças malignas [5], [9] – [12], [14]. A sobre-expressão de PTMA tem sido relatada em diversas neoplasias e o nível de expressão está associado com prognóstico, o potencial metastático e sobrevivência global dos doentes. A sua sobre-expressão em cancro da mama está associada com o potencial metastático de tumores e com o risco de morte [5]. Tem sido relatado como um biomarcador potencial em cancro do cólon [49], um marcador de tumores para detecção de carcinoma de células de transição da bexiga urinária [16] e prognosticador no carcinoma do tracto urinário superior de transição de células [14].

Concluindo, PTMA nuclear foi observada em maioria dos escamosas displasia hiperplasia das células e HNSCC. estudos longitudinais em larga escala são necessários para avaliar o potencial de PTMA superexpressão para identificar pacientes com lesões orais em alto risco de desenvolvimento de câncer. Além disso, nosso estudo demonstrou importância do nuclear PTMA como pobres prognosticator de CECP.

Materiais e Métodos

Pacientes e coleta de dados clínico-patológico, amostras de tecido

O Comitê de Ética Institucional Humano a All India Institute of Medical Sciences (AIIMS), Nova Delhi, Índia, aprovou este estudo antes do seu início. Um termo de consentimento informado aprovado pela comissão de ética foi obtido de todos os participantes envolvidos no estudo. As amostras de tecido foram obtidos por procedimentos diagnósticos ou terapêuticos a partir de pacientes que apresentam características de hiperplasia de células escamosas (n = 116), ou displasia (n = 50) atendidos no Ambulatório dos Departamentos de Disciplinas cirúrgicos e Otorrinolaringologia, AIIMS, e de 100 pacientes com CECP submetidos a cirurgia de câncer de curativo durante o período 2002-2007, depois de obter o consentimento dos pacientes. Sempre que possível, não-tecidos malignos, emparelhadas (n = 43) foram tomadas a partir de um local distante do HNSCC cirurgicamente ressecado. Não malignas tecidos orais desemparelhados (n = 57) também foram coletadas dos pacientes atendidos no Departamento de Cirurgia Ambulatorial of Dental para a extração do dente. Tomados em conjunto, estes 100 tecidos orais não-malignas com evidência histológica do epitélio normal, constituiu o grupo normal. Após a excisão, os tecidos foram imediatamente congelados instantaneamente em azoto líquido e armazenado a -80 ° C no tecido Research Banco até utilização ulterior; uma parte do tecido, também foi recolhido em 10% de formalina e embebidos em parafina para análise histopatológica e imuno-histoquímica. O histologicamente confirmado epitélio oral normal, lesões orais com hiperplasia de células escamosas ou com displasia, e HNSCC como revelado por H e E de coloração foram utilizados para imuno-histoquímica, tal como descrito anteriormente [17]. dados demográficos, clínicos e patológicos dos pacientes foram registrados em um performa pré-concebido como descrito anteriormente [17], [50]. As informações documentais incluídas TNM clínica estadiamento (tumor, nódulo, metástase com base na classificação Cancer Center le União Internacional TNM de tumores malignos 2002), local da lesão, grau histopatológico (WD, MD, PD), idade, gênero e tabaco hábitos de consumo.

Follow-up Study

Setenta e sete pacientes com CECP submetidos a tratamento 2002-2007 foram investigados e avaliados no câncer de cabeça e pescoço clínica de acompanhamento em tempo regular, intervalos. status de sobrevivência dos pacientes com CECP foi verificado e atualizado a partir dos registros do Tumor Registry, Institute Hospital do Câncer Rotary, AIIMS, a partir de dezembro de 2009. Os pacientes com CECP foram monitorados por um período máximo de 83 meses. De acordo com o protocolo do hospital descrito anteriormente [50], [51], os pacientes CECP com T

1 e T

2 tumores foram tratados apenas com cirurgia, enquanto que a maioria dos pacientes com T

3 e T

4 doenças foram tratados por cirurgia radical seguida de radioterapia radical pós-operatório. Os pacientes foram revistos clinicamente em uma base regular e foi registrado o tempo de recorrência. Se um paciente morreu, o tempo de sobrevivência foi censurado no momento da morte; a história clínica, exame clínico e avaliação radiológica foram usadas para determinar se a morte tinha resultado de cancro recorrente (recidiva de pacientes) ou de quaisquer outras causas. sobreviventes livres da doença foram definidos como pacientes livres de evidência clínica e radiológica de recidiva local, regional ou distante no momento do último follow-up. Loco-regional recaída /morte foi observada em 51 de 77 (66%) pacientes monitorados durante o follow-up. Vinte e seis pacientes que não apresentaram recidiva estavam vivos até o final do período de acompanhamento. Apenas sobrevida livre de doença (DFS) foi avaliada no presente estudo, como o número de mortes devido à progressão da doença não permitiu uma análise estatística confiável. sobrevida livre de doença foi expressa como o número de meses a partir da data da cirurgia para loco-regional recaída /morte.

Imunohistoquímica

secções embebidas em parafina (5 um) da mucosa oral normal humana (n = 100), hiperplasia de células escamosas (n = 116), displasia (n = 50) e de carcinoma epidermóide (n = 100) foram recolhidos em lâminas revestidas com gelatina. Resumidamente, os cortes foram desparafinados em xileno, hidratado em álcool gradiente, e pré-tratado num forno de microondas durante 10 min a 800 W e 5 min a 480 W em Tris – tampão de EDTA (0,01 M, pH = 9,0) para o antigénio recuperação. As secções foram incubadas com peróxido de hidrogénio (0,3% v /v) em metanol durante 30 minutos para extinguir a actividade da peroxidase endógena, seguido de bloqueio com 1% de albumina de soro bovino (BSA) para impedir a ligação não específica. Em seguida, as lâminas foram incubadas com anticorpo policlonal de cabra anti-PTMA (N-18) (4 ug /ml, SC-18205, Santa Cruz Biotechnology, CA) durante 16 h a 4 ° C. O anticorpo primário foi detectado utilizando o complexo de estreptavidina-biotina com o LSAB Dako plus kit (Dako Cytomation, Glostrup, Dinamarca) e diaminobenzidina como cromogénio [32]. Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente a menos que especificado de outra forma. As lâminas foram lavadas com solução salina tamponada com Tris (TBS, 0,1 M, pH = 7,4), 3-5 vezes após cada etapa. Finalmente, as secções foram contrastadas com hematoxilina de Mayer e montadas com D.P.X montagem. Nas secções de tecido de controlo negativo, o anticorpo primário foi substituído por IgG de murganho de isotipo específico não imune. As secções de tecido de cancro da bexiga foram usadas como controlo positivo para a expressão PTMA [12]. As seções foram avaliados por exame microscópico de luz, utilizando Olympus BX51 microscópio.

Avaliação da coloração imuno-histoquímica

Cada lâmina foi avaliada por PTMA imunocoloração usando um sistema semi-quantitativa de pontuação tanto para a intensidade da coloração ea percentagem de células epiteliais positivas como descrito anteriormente [50]. a coloração imuno foi avaliada em seleccionados aleatoriamente cinco áreas da secção de tecido. Para a expressão da proteína PTMA, os cortes foram classificados como positivos, se as células epiteliais mostrou imunopositividade no núcleo quando observadas de forma independente por quatro de nós (SCT, AM, JK, SDG), que eram cegos para o resultado clínico (as lâminas foram codificadas e do marcadores não tinha conhecimento prévio da carga tumoral local, disseminação lymphonodular, e classificação das amostras de tecido). As secções de tecido foram pontuados com base na% de células imunocoradas como: 0-10% = 0; 10-30% = 1; 30-50% = 2; 50-70% = 3 e 70-100% = 4. As secções foram também teve uma avaliação semi-quantitativa com base na intensidade de coloração como negativo = 0; = Leve 1; = Moderados 2; intenso = 3 [50]. Finalmente, uma pontuação total foi obtido pela soma do pontuação de percentagem e a intensidade de positividade. A pontuação por todos os quatro observadores (SCT, AM, JK, SDG) foi discrepante em cerca de 5% dos casos e um consenso sobre o resultado final foi alcançado por re-avaliação destes slides e discussão.

Análise Estatística

os dados imuno-histoquímica foram submetidos à análise estatística utilizando o software SPSS 13.0 (Chicago). Sensibilidade e especificidade foram calculados e quantificados utilizando receptor análise da curva característica de operação (ROC). O valor preditivo (PV) descreve a proporção de casos corretamente classificados. Com base nos valores de sensibilidade e especificidade para PTMA, um ponto de corte ≥2 foi definido como critério positivo para imunopositividade PTMA nuclear para análise estatística. As relações entre a expressão da proteína PTMA e os parâmetros clínico foram testadas usando qui-quadrado eo teste exato de Fischer. Dois lados valores de p foram calculados e p 0,05 foi considerado significativo. Da mesma forma, foi calculado o valor preditivo positivo (VPP) e valor preditivo negativo (VPN) para a hiperplasia de células escamosas, displasia e HNSCC com relação aos tecidos normais.

A correlação de coloração PTMA à sobrevida do paciente foi avaliada utilizando tabelas de vida construído a partir de dados de sobrevivência com gráficos de Kaplan-Meier [50]. A análise multivariada foi realizada utilizando modelo de regressão Cox que incluiu PTMA superexpressão e os parâmetros clínico, tais como idade, sexo, grau histológico, T-estágio, estado nodal e estágio do tumor. A avaliação sistemática e rigorosa de positivo e valor preditivo negativo (VPP e VPN, respectivamente) para biomarcadores de prognóstico foi realizada como descrito anteriormente [50]. Para o estudo de seguimento de HNSCC, deixe T o tempo de falha, isto é, a primeira repetição é diagnosticada tempo depois da remoção cirúrgica do tumor. Para estes dados, os valores preditivos positivos e negativos em função do tempo são definidos da seguinte forma: PPV

tumor (t) = Prob (T≤t e recorrência | PTMA (nuclear) ≥2); NPV

tumor (t) = Prob (T T ou sem recorrência | PTMA (nuclear) 2); 0≤t≤83, Essas probabilidades são estimadas a partir das incidências acumuladas observadas ao longo dos respectivos períodos de tempo [52].

transcrição reversa-PCR

representativos amostras de tecidos congelados de diagnóstico histológico de tecidos normais orais (n = 5), a hiperplasia de células escamosas (n = 5), displasia (n = 5) e HNSCC (n = 5) foram usadas para a extracção de ARN total utilizando o reagente TRI (Sigma, MO) como descrito anteriormente [53] . O ADNc da primeira cadeia foi sintetizado utilizando 2 ug de ARN com oligo dT como iniciador com transcriptase inversa MMLV. A PCR foi realizada usando iniciadores específicos para a frente PTMA (5′-ATGTCAGACGCAGCCGTAGACACCA-3 ‘) e reverso (5′-CTAGTCATCCTCGTCGGTCTTCTGC-3’) [11]. Vinte microlitros de cada produto de PCR foi utilizado para a electroforese num gel de agarose 1,2% e fotografados utilizando o sistema ChemiImager.

A análise de imunotransferência de PTMA em tecidos orais

lisados ​​celulares totais foram preparados a partir de oral normal