Abstract

O papel da calcitonina peptídeo neuroendócrino (CT) e seu receptor (CTR) na progressão do cancro epitelial é um conceito emergente com grande potencial clínico. Expressão de CT e CTR é frequentemente elevados em cancros da próstata (PCs) e ativação do eixo CT-CTR em células PC não-invasivos induz um fenótipo invasivo. Aqui mostramos pela levedura e dois ecrãs de híbridos que se associa a CTR com a proteína de junção apertado zonula occludens-1 (ZO-1), através da interacção entre o motivo PDZ tipo 1 no terminal carboxi do CTR e do domínio PDZ3 de ZO-1 . A mutação de um ou outro motivo-PDZ de ligação C CTR ou o domínio ZO-1-PDZ3 não afetou a ligação do CTR com o seu ligando ou sinalização mediada por proteína-G, mas revogada ações desestabilizadoras de CT em junções apertadas e formação de metástases à distância por ortotopicamente implantado células PC em ratinhos nus, o que indica que estas interacções domínio PDZ foram patologicamente relevantes. Além disso, observou-se CTR-ZO-1 em amostras de PC interacções por imuno-histoquímica de ligação de proximidade, e identificou-se que o número de interacções em espécimes de PC metastáticos era várias vezes maior do que no PC não metastático. Os nossos resultados para o primeiro tempo demonstrar um mecanismo pelo qual é necessária a interacção mediada por PDZ entre CTR e ZO1 para metástase CT-estimulada de cancro da próstata. Uma vez que muitos receptores contêm motivos de ligação PDZ, isso sugeriria que as interações proteína motivo do adaptador de ligação PDZ constituem um mecanismo comum para a metástase do câncer

Citation:. Aljameeli A, Thakkar A, Thomas S, Lakshmikanthan V, Iczkowski KA, Shah GV (2016) calcitonina Receptor-zônula occludens-1 interacção é crítica para o calcitonina-Stimulated Prostate Cancer Metástase. PLoS ONE 11 (3): e0150090. doi: 10.1371 /journal.pone.0150090

Edição: Natasha Kyprianou, da Universidade de Kentucky College of Medicine, United States |

Recebido: 29 de outubro de 2015; Aceito: 09 de fevereiro de 2016; Publicação: 02 de março de 2016

Direitos de autor: © 2016 Aljameeli et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:.. NIH CA096534

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

do receptor da calcitonina (CTR) é um membro da família de classe B de receptores acoplados à proteína G (GPCRs), os quais contêm numerosos alvos de drogas. CTR liga neuroendócrino CT péptido para manter a homeostase do cálcio no osso e no rim [1]. No entanto, a sua expressão em vários órgãos e as suas acções no desenvolvimento, crescimento e diferenciação celulares sugere que a CTR pode ter um papel mais diversificada Tolcos et ai. [2], [3,4]. A abundância de transcrições CT e CTR é aumentada em próstatas neoplásicas e que se correlaciona positivamente com o grau de Gleason de cancro da próstata (PC). Além disso, a activação do eixo autócrino CT-CTR estimula vários processos associados com o crescimento tumoral, invasão, angiogénese, metástase e quimiorresistência, sugerindo que a CTR serve como um factor importante na progressão de um PC localizada a sua forma metastático [5-7] .

CTR sequência de ARNm isolado a partir de próstata humana carece de uma inserção de 16 aminoácidos no primeiro laço intracelular, uma característica da isoforma 2 do CTR [8,9]. CTR2 pares para ambos os estimuladores de ligação de GTP da proteína G

aS e G

αq para co-estimular a adenilil-ciclase e a fosfolipase C [10]. Além disso, CTR desestabiliza apertado e adherens junções e activa as vias de sinalização acoplados à proteína não-G tais como a PI-3-quinase (PI3K) -Akt-survivina e Wnt /beta-catenina [5,11]. No entanto, o mecanismo exacto pelo qual a CTR estimula a metástase do cancro da próstata ainda não foi identificado.

desde a ruptura das junções intercelulares e aquisição do fenótipo invasivo são obrigatórios passos na progressão tumoral, foi examinada a acção de CTR junções apertadas (TJs) e sua importância na metástase de células PC CTR-estimulado. Neste relatório, mostram que a (C) cauda citoplasmática de CTR associados com junção apertada (TJ) proteína zônula occludens-1 (ZO-1), através da interação entre o tipo 1 motivo de ligação PDZ no carboxi-terminal de CTR e PDZ3 domínio de ZO-1. Essa interação é fundamental para as ações da CTR no TJ desestabilização, bem como metástase das células cancerosas da próstata.

Materiais e Métodos

Animais

Homem balb /c nu /ratinhos nu (6-8 semanas de idade) foram comprados na Harlan (Madison, WI), e alojados dois por gaiola em unidades microisolator em uma instalação de barreira sobre uma arrestance de partículas de elevada eficiência (HEPA) cremalheira filtrado por sob condições padrão de 12 horas ciclo claro /escuro, alimentados

ad lib

em uma dieta padrão de laboratório autoclavado, e colocado em quarentena durante uma semana antes da sua utilização no estudo.

Cultura de células

LNCaP, linhas de células DU-145 PC-3 e foram obtidos a partir de American Tissue Culture Collection (Manassas, VA), e mantidas como recomendado pelo fornecedor no nosso laboratório por menos do que seis meses após a sua recepção. PC-31 sublinha era um isolado PC-3 orthologue que faltava CT e CTR mRNA (S1 apêndice, S1A-S1D Fig). A linha de células PC-3M foi fornecida pelo Dr. Isiah Fidler (MD Anderson Cancer Center, Houston, TX). PC-3, as linhas celulares PC-3M PC-31 e foram autenticados pelo perfil STR (S1 apêndice)

DNA construções:. FLAGCTRwt e FLAGCTRΔESS

ligação

CTR C-PDZ motif ( ESSA) foi substituído por alaninas através da inserção de incompatibilidades nos respectivos códons como sublinhado. As sequências dos iniciadores foram os seguintes:

Encaminhar Primer: 5′-AAG /CTT /ATG /GAC /tac /AAG /GAC /GAC /gat /GAC /AAG /AGC /TTC /aca /ttt /aca /AGC /CGG /TGC /tTG-3 ‘

iniciadores inversos:

CTRwt: 5′-CTC /gag /TCA /AGC /aga /TGA /CTC /ttg /CTC /tat /gat /att /CAA /agg /gat /gat /CTC-3 ‘

CTRΔESS: 5′-CTC /gag /TCA /AGC /AGC /AGC /AGC /ttg /CTC /tat /gat /att /CAA /agg /gat /gat /CTC-3 ‘

O full-length FLAG-CTRwt e FLAG-CTRΔESS foram inseridos no vector de expressão pcDNA3.1 por clonagem direccional (Invitrogen) [12].

ZO-1ΔPDZ

ZO-1 de sequência de cDNA foi mutagenizado por exclusão cada /ou todos os três domínios PDZ para se obter os seguintes quatro mutantes: ΔPDZ1 (AA 2-156) , ΔPDZ2 (aa 159-252), ΔPDZ3 (aa 294-633) e ΔPDZX (aa 67-1033) [13]. Todos os ZO-1 construções foram etiquetados myc na extremidade C-terminal e clonado no vector de expressão eucariótica pCB6 [13].

As construções de ADNc foram transfectadas em células PC-3 utilizando FuGene 6 ™, seleccionadas em G418, múltiplos Os clones foram examinados, e os que exprimem a expressão do transgene estável foram seleccionados para estudos subsequentes tal como foi descrito anteriormente [11,14].

de levedura de dois híbridos de triagem

a sequência de ADNc que corresponde ao domínio C-terminal de hCTR2 (resíduos 411-476) foi inserida no quadro no vector de expressão de levedura pNLex-NLS [15]. Este plasmídeo isca foi utilizada para transformar a RFY231 cepa de levedura:

MAT ± ura3-1 HIS3 trp1î

::

hisG

3LexAop-

LEU2

::

LEU2

. A levedura transformada foi então acoplado a levedura (RFY309:

MAT

α

his3î200 leu2-3 lys2î201 ura3-52 trp1îhisG

: pSH18-34) pré-transformada com uma biblioteca de cDNA de próstata humana em pJG4 vetor -5 (Origene). Todas as colónias resgatados foram escolhidas e sua dependência galactose, Leu e lacZ fenótipos foram testados [15,16]. ORF de todos os clones dependentes de galactose foram isolados por PCR e clonado no domínio de activação de transcrição (AD) pelo vetor de reparação lacuna. Os clones AD foram então acoplado contra a isca para reconfirmar que Leu e lacZ fenótipos foram dependentes da ORF. clones AD positivos foram ainda testados quanto à especificidade por meio de cruzamentos com 7 cepas isca expressar iscas independentes (

proteínas de Campylobacter

) [16].

Para verificar a intensidade de interação, tensão isca original foi acoplado com estirpes que expressam cada AD clone isolado, e activação repórter foi pontuada em 0-3 escala para o crescimento em placas de Leu (0 = sem crescimento; 3 = crescimento máximo); e 0-5 escala para a atividade lacZ em placas de X-gal (0 = branco; 5 = azul escuro). Todos os interagentes nessa tela marcou o crescimento máximo em Leu; e a ausência de actividade de lacZ indicam uma interação fraca, mas reprodutível.

cíclico (c), AMP, proteína cinase A (PKA) e a proteína quinase C (PKC) Ensaios

PC-3CTR e células PC-3CTRΔESS foram cultivadas em placas de 24 poços, lavou-se, e estimuladas com diferentes concentrações de CT (0-100 nM) durante 3 minutos. As células foram lisadas com solução gelada de TCA a 10%, e os lisados ​​foram analisados ​​quanto a níveis de cAMP por radioimunoensaio.

Para os ensaios de PKA e PKC, os lisados ​​de células não tratadas /CT-tratadas foram incubadas com o respectivo PKA ou péptido substrato de PKC e

32P-ATP, como descrito no protocolo fornecido pelo fabricante (Promega, Madison, WI). Em resumo, as células tratadas com TC ou veículo durante 10 minutos (2 x 10

6 células por 100 mm de prato) foram colhidas em tampão de lise (Tris 50 mM, pH 7,5, contendo EDTA 5 mM, 50 NaF mM, pirofosfato de sódio 1 mM, EGTA 0,5 mM, ß-mercaptoetanol 10, 1 ug /mL de leupeptina, e 1 ug /mL de aprotinina), sonicado, e os detritos foram removidos por centrifugação. Os extractos foram, então, incubados durante 5 min a 30 ° C no tampão de reacção [concentração final foi de 50 mM Tris, pH 7,5; MgCl 10 mM

2; 100 uM de ATP; 4 nM de [

32 P] ATP; 0,25 mg /ml de BSA; e PKA 50 uM ou péptidos substrato de PKC (Promega Corp., Madison, WI)]. 10 uM de cAMP (PKA actividade total), serviram como controlo positivo e PKI 1 uM, mais AMPc serviu como um controlo negativo para ensaios de PKA (actividade de fundo total). Triplicado de cada amostra foram analisadas, e colocados a hibridar em SAM2 membranas de captura de biotina no final da incubação (Promega Corp., Milwaukee, WI). As membranas foram então lavadas extensivamente com NaCl 2 M, bem como NaCl 1% H

2 3PO

4, e o substrato fosforilado ligado sobre um disco de filtro foi quantificada num contador de cintilação. atividade quinase PKI inibido foi calculado, e os dados foram relatados como picomoles ATP por min por g de proteína.

Imunofluorescência

As células (aproximadamente 5×10

4 células) foram cultivadas quer em câmaras Transwell (tamanho de poro 0.4μm) e crescidas até à confluência (aproximadamente 5 dias). As células foram então fixadas, e immunolabeled com o anticorpo primário apropriado (de ratinho anti-CTR, Acris Laboratories; coelho anti ZO-1 de soro, Invitrogen; coelho anti-claudina 3 anti-soro, Invitrogen) durante a noite a 4

0 C . Os anticorpos secundários conjugados com fluoróforos correspondentes foram aplicados. Após as lavagens, as lâminas foram observadas sob Nikon Optiphot-2 microscópio equipado para epifluorescência. As imagens foram capturadas com Retiga 1300 câmera conectada a um computador iMac carregado com iVision programa de análise de imagem (BioVision Technologies, Exton, PA). Todos os anticorpos foram caracterizados quanto à especificidade e reactividade cruzada, conforme descrito no Apêndice S1, S2A-S2C Fig.

Medição da Transepitelial resistência elétrica (TER) e paracelular Permeabilidade (PCP)

Aproximadamente 5×10

4 células foram semeadas em filtros Transwell (tamanho de poro 0.4μm) e cultivadas até à confluência (normalmente 5-6 dias). Ter (em poços em duplicado) foi medida a vários intervalos de tempo com medidor volt-ohm Evom como previamente descrito [11]. As leituras foram corrigidos para o branco (valores ter do filtro no meio do banho). A integridade e a densidade de célula monocamadas foram cuidadosamente monitorizados.

Para medições de PCP, as células foram cultivadas até à confluência em filtros Transwell. Tetra metil rodamina-dextrano (1 mg /ml, ~ 4 kDa, Sigma) foi adicionada à câmara superior. Fluorescência do meio câmara inferior foi medido em Modulus Microplate Reader (Turner Biosystems) após uma hora.

In vitro

Invasion Ensaio

experimentos Invasão foram realizadas em 24 poços , dois compartimentado, câmaras de invasão de Matrigel ™ tal como descrito anteriormente [17]

Correcção de crescimento:. Desde CT também induz a proliferação de linhas de células PC, determinou-se o factor para corrigir a possível proliferação de células que podem ter migrado em fase precoce do período de incubação de 24 h. 25 x 10

4 células foram colocadas em placas a intervalos de uma hora em placas de seis poços e cultivadas durante 1-24 horas. por cento de aumento no número médio de células em cada poço foi determinada. Esta correcção foi aplicada aos resultados de ensaios de invasão.

CTR-C Pull-down Ensaio

ADNc que codifica o domínio intracelular de CTRwt e CTRΔESS (aa 441-476) foi clonado pGEX vetor (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Controlo (C) -cDNA construir (sequência de ADNc aleatórias de comprimento equivalente) foi preparado por um controlo negativo. Os ADNc foram expressos em BL-21

Escherichia coli estirpe

, e a quantidade equivalente de cada proteína de fusão (aproximadamente 2 mg) foi absorvida em glutationa-Sepharose 4B (GE Healthcare). As esferas que contêm proteínas de fusão-GST de péptido C, CTR-Cwt e CTR-CΔESS foram depois incubadas com lisado de células PC-31. As proteínas ligadas foram eluídas com glutationa reduzida. A presença de ZO-1 no eluído foi detectado por Western blotting.

Ensaios de sobreposição

Sobreposição ensaios foram realizados como previamente descrito [18]. Os lisados ​​celulares foram preparados a partir de transfectantes de PC-3M estáveis ​​que expressam quer mutantes ZO-1ΔPDZ-myc ZO-1 peso-MYC ou, fraccionados num gel de SDS-PAGE e transferidos para membranas de nitrocelulose. A membrana foi cortada em tiras, representando cada pista do gel. As tiras foram, em seguida, bloqueadas em tampão Ocidental longe e incubados com GST purificada com etiquetas proteína de fusão CTRwt durante a noite a 4 ° C, e processada por imunotransferência GST. No controlo da carga de proteína, as transferências foram despojado e sondado para MYC.

Co-immunoprecpitation

privadas de soro PC-31-V, PC-31-CTRwt ou PC-31-CTRΔ ESS células (2 x 10

6 por 100 milímetros prato) foram estimuladas com /sem 50 nM de CT durante 3 minutos, lavadas e lisadas em tampão de IP como anteriormente descrito [19]. CTR em proteínas de lisados ​​normalizados foi imunoprecipitada com anticorpo anti-FLAG-EZ vista grânulos (Sigma), e eluiu-se com o péptido FLAG (600 ug /ml em PBS). immunopreciptates CTR foram processadas para imunotransferência ZO-1. Para controlar carga de proteína e transferência, as transferências foram despojado e sondado com imunoprecipitar anticorpos.

Acceptor Photo-branqueamento de ressonância de fluorescência Energia Transferência

PC-31 células (FRET) Microscopia

foram semeadas em vidro câmaras inferiores e cultivadas durante a noite. As células foram transfectadas com plasmídeos usando Lipofectamine ™ CTRwt-ECFP-N1 (ou CTRΔESS-ECFP-N1) e ZO-1 peso-EYFP-N1 (ou ZO1-ΔPDZ3-EYFP-N1), cultivadas durante 36 h adicionais, e fotografada vivo após o tratamento com 50 nM de CT (ou controlo) à temperatura ambiente utilizando Nikon Eclipse 2000 TE ligado com Sensicam-qe (Cooke Corporation, Romulus, MI). imagens PCP e YFP foram adquiridos com excitação a 436 nm e emissão a 480/535 nm, respectivamente. Um filtro dicróico 505 nm definido em Dual View foi usado para dividir as imagens (Insights ópticos, Santa Fe, NM). FRET foi gravada por monitorar a extinção do PCP durante YFP fotodegradação. As imagens foram analisadas com o software de imagem IPlab 4.0 (Scanalytics, Inc, Rockville, MD) e se aflige eficiências foram calculadas usando a fórmula: FRET

Eficiência = (doador PCP

após o clareamento doadores PCP

antes do branqueamento) /doador PCP

após o clareamento. Limiares para doadores (PCP), receptor (YFP), e se aflige imagens foram definidos no início da coleta de dados e mantiveram-se inalterados durante todo o conjunto de dados.

In situ

ensaio de proximidade de ligadura (PLA)

células PC fixos ou tecidos foram immunolabeled com anticorpos primários (anti-coelho de ZO-1 no soro e soro de cabra anti-CTR) durante a noite a 4 ° C. Os anticorpos secundários com sondas PLA anexados são fornecidos no kit Duolink ™ (Olink Bioscience, Uppsala, Suécia). CTR-ZO-1 de interacção foi observada por microscopia confocal a 400X. Um ponto fluorescente vermelha indica as duas proteínas estão dentro da distância de 35nm. O número de pontos por celular foi determinado pelo software de análise de imagem Blobfinder ™ [20].

tumores congelados próstata

Snap-congelados amostras de tumor de próstata humana foram obtidos de Louisiana Cancer Research Center, e foram processado para a co-imunoprecipitação, tal como descrito anteriormente [21]. Os tecidos tumorais cancerosas humanas da próstata foram obtidas a partir da Cancer Research Consortium Louisiana (LCRC; Nova Orleans, LA) com o consentimento por escrito do paciente e a aprovação Institutional Review Board de ambas as instituições, o IRB da Universidade de Louisiana em Monroe e Comité de Investigação da Universidade Tulane ( TURC) da Tulane University Medical Center e Louisiana Cancer Research Center. Para um estudo semelhante ver Liu et al [22].

crescimento de tumores e metástases Ortotópico

Para detectar micrometástases de células tumorais implantadas em ratos, nós transfectadas estavelmente as linhas celulares com DsRed-MCherry- Hyg-N1 (Clontech, Palo Alto, CA). colónias higromicina resistentes que expressaram forte fluorescência vermelha em um nível constante ao longo do período de observação foram selecionados e utilizados para implantação ortotópica

.

Todos os procedimentos com animais foram conduzidos de acordo com os princípios e procedimentos definidos pelo NIH e Institutional Animal Cuidado e Use Committee da Universidade da Louisiana em Monroe. Os procedimentos com animais utilizados neste estudo foram aprovados pelo IACUC da Universidade de Louisiana em Monroe. A cirurgia de implante ortotópico foi realizada sob anestesia com cetamina /xilazina, como previamente descrito [6]. As suspensões de células de tumor (1×10

6 células /20 ul) foram injectados na próstata dorsal, os animais foram monitorizados para o crescimento de tumores e metástases por fluorografia usando Kodak 4000 MM estação de imagens, e sacrificaram-se dentro de sessenta dias [23]. Os animais foram observados diariamente e humanamente sacrificados por CO

2 inalação quando se encontraram os seguintes critérios endpoint humanas: prostração, lesões de pele, perda significativa de peso corporal, dificuldade respiratória, epistaxe, movimento de rotação e queda de temperatura corporal. Vários órgãos foram recolhidos, fixados e examinados para a metástase do tumor. A eutanásia foi realizada por investigadores treinados Drs. Arvind Thakkar e Vijaybasker Lakshmikanthan. Dr. Shibu Thomas estava envolvido na primeira parte do estudo onde contribuiu para o desenvolvimento de construções, geração de linhas celulares e estabelecimento de modelo de implantação ortotópica.

Na necropsia, tumor primário e outros órgãos foram colhidos e pesados . Wet secções de órgãos foram examinados para a presença de SDP. Os restantes tecidos foram fixados em formalina tamponada neutra e processados ​​para a H E de coloração. A utilização de animais foi necessário avaliar a tumorigenicidade e metastastasizing capacidade de linhas celulares que expressam de tipo selvagem ou mutante CTR.

Homem BALB /c ratinhos nu /nu (6-8 semanas de idade) foram comprados na Harlan (Madison, WI), e alojados dois por gaiola em unidades microisolator em uma instalação de barreira em um arrestance partículas de alta eficiência (HEPA) cremalheira filtrado por sob condições padrão de luz de 12 horas /ciclos escuros, alimentados

ad lib

em um padrão autoclavado dieta de laboratório, e em quarentena durante uma semana antes da sua utilização no estudo.

resultados e Discussão

citoplasmática CTR (C) contém uma cauda de tipo I de ligação ao motivo PDZ

GPCRs Vários classe B ativar G não-sinalização mediada pela proteína interagindo com proteínas de andaime através de suas caudas citoplasmáticas [24-26]. Desde CTR também activado G não-sinalização acoplado a proteína, examinamos a sua sequência primária e descobriu que os quatro resíduos terminais de CTR C-tail (aa 471-74, ESSA) formado um tipo canônica motivo de ligação de domínio I PDZ [27, 28]. Nós inativado este motivo, substituindo estes resíduos com alanina (referido como ΔESS).

células PC-3 foram escolhidos porque eles não têm endógena CTR e permitir o estudo da CTR expressa sem a interferência do CTR endógeno. Foram comparados os níveis de CTRwt ou CTRΔESS em membranas plasmáticas de PC-3 linhas estáveis ​​com níveis endógenos CTR em membranas do plasma de outras linhas de células PC. As células PC-3 faltava CTR e células LNCaP exibido baixos níveis de CTR. No entanto, as células dos níveis de CTR em PC-3CTRwt e PC3-CTRΔESS foram comparáveis ​​aos níveis CTR endógenos de linha de células DU-145 mal diferenciadas conforme detectado por immunoblotting (Fig 1A1 e 1A2).

A1 . CTR imunorreactividade em membranas de plasma de linhas de células PC (30 ug de proteína /pista) foi determinada por análise de Western blot. A mancha foi sondado para ß-actina para a normalização. Representativos de três experiências separadas. A2. Densidade óptica do CTR e bandas de actina em cada blot foi obtido por análise de imagem na Kodak 4000 MM estação de Imagem. A figura apresenta os dados do grupo (razão de CTR OD /actina OD ± SEM de 3 borrões). B. PC-3-CTRwt e células PC-3CTR-ΔESS foram cultivadas em câmaras Transwell até à confluência, lavadas, fixadas e processadas para imunof luorescência CTR como descrito nos Métodos. As fotomicrografias são 400X. C. células PC-3CTR e PC-3CTRΔESS foram estimuladas com várias concentrações de CT (0-100 nM) durante 3 minutos. As células foram lisadas e os lisados ​​foram analisados ​​quanto a níveis de cAMP por radioimunoensaio. D-E. Lisados ​​de não tratado /tratado-CT-3CTRwt PC e PC-3CTRΔESS células foram incubadas com o respectivo péptido substrato de PKC e PKA ou

32P-ATP, como descrito no protocolo fornecido pelo fabricante (Promega, Madison, WI). foi determinada quantidade de péptido substrato

32 P-rotulados, e foi calculada a atividade.

A mutação de CTR-C PDZ de ligação motivo não altera a localização subcelular de CTR ou a sua proteína G-acoplado sinalização

Ambos CTRwt e CTRΔESS foram localizadas na membrana plasmática (Figura 1B). Para examinar a capacidade de CTRwt CTRΔESS e para activar os seus efectores acoplados à proteína G, examinámos toda a curva de dose-resposta da CT em acumulação de cAMP em linhas celulares e CTRwt CTRΔESS, e analisaram o efeito de 50 nM de CT em actividade de PKA e PKC. Ambos os receptores causou um aumento semelhante na acumulação de cAMP numa gama de concentrações de 0-100 nM e induzidos aumentos semelhantes em PKA e PKC actividade (Fig 1C-1E). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que ΔESS mutação não altera nem a localização do CTR nas membranas celulares PC-3 ou sua capacidade de ativar G

aS e G

αq de sinalização.

CTR- C PDZ de ligação motivo é necessário para a ação do CTR na estabilidade TJ e invasão

a. TER.

Para examinar o efeito da CT em junções apertadas (TJS), ter de células PC-3 que expressam polarizada, quer o vector (PC-3V), CTRwt ou CTRΔESS foi monitorizada durante 8 horas após a CT estimulação. As células PC-3V polarizadas exibido relativamente alta TER, e CT não alterá-lo (Fig 2A1). Em contraste, a expressão de CTRwt resultou numa redução de 40% do TER em células PC-3CTRwt (Fig 2A2). Esta redução é muito provavelmente desencadeada pela interacção do CTR transfectadas com baixos níveis de CT normalmente segregadas por células PC-3. De facto, a adição de TC exógena (50 nM) diminuiu TER ainda mais. No entanto, a expressão de CTRΔESS em células PC-3 não afectou TER quer antes ou após a adição de TC exógeno (Fig 2A3). Nós escolhemos 50 nM dose de CT com base nos nossos estudos anteriores mostrando a 10- aumento de 20 vezes em níveis endógenos de CT, bem como CT-populações de células secretoras de próstatas malignos [29,30]. Além disso, a TC foi maximamente eficazes na dose de 50 nM em estimular a invasão de células PC [17]. Nós também testamos CT em concentrações mais baixas. Observou-se que a CT diminuiu significativamente TER de células PC-3CTRwt nas concentrações de 1 nM ou superior quando incubadas durante 2 horas (Fig 2B). Mais uma vez, as células PC-3CTRΔESS não mostrou qualquer alteração no TER em todas as concentrações de CT sob essas condições (Fig 2B). Para testar o papel da estabilidade CTR endógeno em TJ, utilizou-se linha celular PC-3M, que é derivado de células PC-3, é altamente agressivo, e co-expressa CT, bem como CTR [30,31]. O knock-down da CTR endógena sozinho induziu um aumento significativo no TER de células PC-3M (Fig 2C).

A. Transepitelial resistência elétrica (TER): polarizada PC-3v, as células PC-3-CTRwt e PC-3CTR-ΔESS foram privadas de soro durante 4 horas, depois tratada com /sem 50 nM CT. TER foi medido com o medidor Evom volt-ohm. Os resultados são expressos como ohm-cm 2 ± S.E.M. para n = 6). células B. polarizada PC-3-CTRwt e PC-3CTR-ΔESS foram-privadas de soro durante 4 horas, depois tratou-se com /sem várias concentrações de CT 0-100 nM). TER foi medido duas horas após a adição de TC com medidor volt-ohm Evom. Os resultados são expressos como TER (Ohm-cm 2) ± S.E.M. para n = 6. células C. PC-3M foram estavelmente transfectadas com qualquer operadora pSuper.neo plasmídeo que expressa mexidos RNA (PC-3MV) ou vector pSuper.neo expressar CTR shRNA (PC-3MCTR

KD) [14,42 ]. As células foram cultivadas tal como descrito na Fig 2A e TER foi medido em vários intervalos de tempo até 2 horas na presença ou ausência de 50 nM de CT. Os resultados são expressos como média ± S.E.M. para n = 4. knock-down do CTR sozinho causou um aumento significativo no TER de células PC-3M, demonstrando a importância do CTR endógeno na regulação da estabilidade TJ de células PC-3M. D. paracelular Permeabilidade (PCP): polarizada PC-3V, as células PC-3-CTRwt e PC-3CTRΔESS foram tratados com /sem 50 nM CT. O PCP foi determinado por difusão de dextrano ~ 4kDa TRITC-conjugado da parte superior para a câmara inferior em uma hora. Os resultados são expressos como pg /ml /hora de TRITC-Dextrano difundido ± S.E.M. para n = 6. * p 0,05 (-CT VS + CT, um ANOVA de direcções e teste de Newman-Keuls). E. Numa experiência semelhante à 2B, o PCP foi determinado por difusão de ~ 4kDa dextrano TRITC-conjugado da parte superior para a câmara inferior em duas horas. Os resultados são expressos como pg /ml /hora de TRITC-Dextrano difundido ± S.E.M para n = 6. * p 0,05 (-CT VS + CT, One-way ANOVA e teste Newman-Keuls). F. PC-3mV e PC-3MCTR

KD células foram testadas quanto à de PCP, tal como descrito na Figura 2C. Mais uma vez, o knock-down do CTR produziu uma redução significativa em PCP de células PC-3M, demonstrando a importância do CTR endógeno na regulação da estabilidade TJ de células PC-3M. Os resultados são expressos como pg /ml /hora de TRITC-Dextrano difundido ± S.E.M para n = 6. * p 0,05 (-CT VS + CT, One-way ANOVA e teste Newman-Keuls). G. Invasion: PC-3V, PC-3CTRwt e PC-3CTRΔESS células foram adicionados a inserção superior de câmaras de invasão juntamente com /sem 50 nM de CT, e as células que passaram através da barreira de Matrigel ™ ™ foram contadas após 48 h. Os resultados são expressos como número médio de células invadidas por 400X campo ± S.E.M. para n = 6. * p 0,05 (PC-3V x PC-3CTR-WT); $ P 0,05 (PC-3CTR-WT vs. PC-3CTRΔESS); $ $ -p 0,05 (PC-3CTRwt + CT vs. PC-3CTRΔESS + CT) (One-way ANOVA e teste de Newman-Keuls). H. CTR imunorreatividade no PC-3V, as células PC-3-CTRwt e PC-3CTRΔESS. As células foram tratadas com /sem CT 50 nM. CTR em proteínas de lisados ​​normalizados foi quantificada por imunoblotting. blot representativos de três experiências separadas.

B. PCP.

TJs formar uma barreira que regula o movimento de iões, solutos e factores de crescimento entre as células. Para detectar se CT afecta o ‘caminho de fuga “, isto é, a barreira para grandes moléculas não carregadas, medimos difusão de dextrano-fluororo conjugado através de monocamadas de células polarizadas linha PC. As células PC-3V exibido relativamente baixo PCP e exógenos CT não alterá-lo (Fig 2D). Expressão de CTRwt em células PC-3, provocou um pequeno aumento na sua PCP, e a adição de TC aumentou significativamente PCP. Em contraste, a expressão CTRΔESS teve pouco efeito sobre o PCP na presença ou na ausência de TC. Quando testados em concentrações múltiplas de CT, CT induziram um aumento em PCP de células PC-3CTRwt nas doses de 1 nM ou superior após 2 horas de incubação (Figura 2E). Mais uma vez, CT não alterou o PCP de células PC-3CTRΔESS em todas as concentrações testadas (Figura 2E). As células PC-3M para examinar a importância da CTR endógena na estabilidade TJ, mais uma vez utilizados [30]. Como esperado, CTR

KD diminuiu significativamente PCP de células PC-3M (Fig 2F). Quando considerados em conjunto, estes resultados sugerem que o eixo CT-CTR podem estar envolvidos na regulação dinâmica de TJs em células da próstata.

C. Invasão.

CT aumenta a capacidade de invasão, e até induz um fenótipo invasivo em células PC não-invasivos [14]. Examinamos o papel de motivo de ligação PDZ na invasão CT-estimulado. Expressão de CTRwt em células PC-3 aumentaram a invasão de 2,5 vezes (Figura 2G). No entanto, a expressão de CTRΔESS não causou um aumento semelhante. Quando estimuladas com 50 nM de CT, as células PC-3-CTRwt responderam com um aumento de 2,5 vezes na invasão adicional, mas PC-3CTRΔESS não o fez. Desde CTRwt e CTRΔESS teve efeitos dramaticamente diferentes no TER, PCP e invasão, queríamos ter certeza de que as variâncias não eram devido às diferenças em seus níveis CTR. níveis imunorreactivo CTR foram semelhantes em todas as linhas de células, na presença ou ausência de CT (Figura 2H), que sugere que a interacção do CTR com a sua proteína parceira através do seu motivo de ligação PDZ é crítico para a sua acção desestabilizadora sobre TJs e promoção da invasão

CTR também desestabiliza TJs e aumenta a invasão de outras linhas celulares PC

Nós também testamos se CT produz efeitos semelhantes em LNCaP, PC-3M e linhas de células DU-145, que expressam endógena CTR (Fig 1A ). CT reduzida TER e aumentou PCP destas linhas celulares, sugerindo CT desestabiliza TJs em androgénio-responsivo, bem como linhas celulares de PC-andrógenos refractário (fig 3A e 3B). Da mesma forma, a TC aumentou significativamente a invasão de LNCaP menos invasivo, bem como mais invasiva DU-145 e células PC-3M (Fig 3C).

células LNCaP, PC-3M e DU-145 foram tratadas com 50 nM de CT , e seu ter (a), o PCP (B) e invasão (C) foram medidas como descrito em Métodos. Os resultados são apresentados como média ± SEM (n = 6). * P 0,05 de controle correspondente (-CT vs + CT, One-way ANOVA e teste de Newman Keuls). ^ P 0,01 (-CT vs + CT, One-way ANOVA e Newman-Keuls)

Identificação do CTR-interagindo proteínas

Uma vez que a ação da CTR no TJ. estabilidade e invasão necessário PDZ de ligação motivo, procurou-se identificar proteínas CTR-interagindo por triagem Y2H complementação. Após o rastreio 1×10

6 transformantes, foram identificados 11 clones que interagem, purificados e sequenciados (Tabela 1). Os clones positivos mais codificado proteínas de membrana de plasma e /ou as proteínas associadas com o sistema de adenilil ciclase. Como um novo achado, um clone codificava a proteína de junção apertado ZO-1, e este clone também fornecido o sinal mais forte no rastreio secundário. Desde CTR desestabilizado TJs apenas na presença do motivo de ligação PDZ, caracterizamos CTR-ZO-1 interacção ainda mais

CTR-C-tail interage com ZO-1:. Ensaio de Pull-down A.

CTR-C tail-ZO-1 interação foi examinada usando GST ensaios suspensos.