Abstract

Fundo

A quantificação de células tumorais circulantes (CTC) é valioso para a avaliação de câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC). A sensibilidade dos métodos actuais restringe a sua utilização para detectar CTC raras em fase precoce. Aqui podemos avaliar um novo método, orientada pelo ligando polimerase reação em cadeia (LT-PCR), que pode detectar CTCs raras em pacientes com NSCLC.

Métodos

CTCs foram enriquecidos pela depleção imunomagn�ica de leucócitos e então marcadas por um conjugado de um ligando específico do tumor e um oligonucleótido. Depois de se lavar fora conjugados livres, os conjugados ligados foram removidos do CTC e, em seguida, analisadas por qPCR. Para avaliar a utilidade clínica, amostras de sangue foram obtidas de 72 pacientes com NSCLC (33 inicialmente diagnosticado e 39 em quimioterapia), 20 pacientes benignos e 24 dadores saudáveis.

Resultados

As experiências com o sangue saudável enriquecida com células tumorais indicada a LT-PCR permite a detecção específica do CTC. O estudo clínico demonstrou que os pacientes inicialmente diagnosticados têm uma média de 20,8 unidades do CTC com doenças metastáticas, 11,8 unidades do CTC com doenças localizadas e 6.0 unidades do CTC com doenças benignas. Com o limite de 8,5 unidades CTC, o ensaio pode detectar 80% de fase I /II, de 67% da terceira fase, e 93% dos cancros do estádio IV. Com os pacientes benignos e doadores saudáveis ​​como grupo controle, o método pode detectar o câncer com uma sensibilidade de 81,8% e uma especificidade de 93,2%.

Conclusão

O LT-PCR permitiria quantificação de CTC em pacientes com NSCLC em um nível mais sensível, proporcionando uma ferramenta potencial para estratificar doenças pulmonares malignos, especialmente na fase inicial

Citation:. Lou J, Ben S, Yang G, Liang X, Wang X, Ni S , et ai. (2013) Quantificação dos raros circulantes Células Tumorais em Non-Small Cell Lung Cancer por PCR Ligand-alvejado. PLoS ONE 8 (12): e80458. doi: 10.1371 /journal.pone.0080458

Autor: John D. Minna, Univesity of Texas Southwestern Medical Center em Dallas, Estados Unidos da América

Recebido: 17 de julho de 2013; Aceito: 02 de outubro de 2013; Publicação: 06 de dezembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Lou et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Projeto chave de Xangai Comissão de Ciência e Tecnologia (Grand Nenhuma: 10411950600). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores declaram Dr.Guohua Yang é empregado por Genosaber Biotech. Ao mesmo tempo, ele prende opções pequenas imagens ( 5%). Durante o período da pesquisa, Dr. Yang só fornece suporte técnico a nós para completar a pesquisa clínica. Este apoio técnico inclui análise de dados e descrição técnica do método no manuscrito. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

circulantes células tumorais (CTC), conhecidos como “biópsia líquida”, é um prontamente marcador acessível para a progressão do câncer de monitorização, resposta ao tratamento e recorrência de doenças malignas. Especialmente, a CTC torna-se ainda mais importante quando a biópsia do tecido não é adequado para determinada população de pacientes. significado clínico da CTC em NSCLC tem sido amplamente divulgado em estudos recentes. elevado número de CTC detectados foram relatados para associar com mau prognóstico no câncer de pulmão metastático [1] – [5]. Detecção de certos ARNm ou multi-gene no CTC pode ser utilizado para o prognóstico do resultado de debulking cirurgia e radioterapia em pacientes com NSCLC [6] – [10]. Mais recentemente, a caracterização molecular de CTC no NCSLC foi mostrado para potencialmente orientar a terapia [1], [11]

Para avançar detecção de CTC para o próximo nível, surgiram várias tecnologias promissoras para o enriquecimento CTC:. 1) CTC foi positivamente, imunomagneticamente capturado por anti-EpCAM (molécula de adesão celular epitelial) de anticorpo esferas magnéticas revestidas com [7], [12], 2) CTC foi enriquecida por depleção imunomagnética de leucócitos com anti-CD45 anticorpo esferas magnéticas revestidas com [5], [13]. 3) CTC foi enriquecida por meio de dispositivos de filtração à base de tamanho [14], 4) CTC foi enriquecida por um dispositivo baseado em chip com assinatura microestrutura [15], e 5) o CTC foi enriquecida pela depleção simultânea de eritrócitos e de leucócitos usando a centrifugação em gradiente de densidade [16], [17]. Para posterior análise, quantitativa do CTC, a fracção enriquecida utilizando os métodos anteriormente mencionados foi marcado imunofluorescência e, em seguida, examinadas microscopicamente ou por meio de citometria de fluxo [12], [18] – [21]. Embora métodos de imunofluorescência com base exibiram elevada especificidade, a sensibilidade pode não ser suficiente para detectar células raras na fase precoce do cancro [4], [12], [22]. Reverso reacção em cadeia com transcriptase-polimerase (RT-PCR) foi também usado para a enumeração CTC com alta sensibilidade [8], [23], [24]. No entanto, a regulação pós-transcricional que desregula a expressão de genes foi encontrada em numerosas células de cancro [25] – [27]. Esta regulação altera a expressão do gene através de modificações de estabilidade do ARNm e /ou a eficiência da transcrição, e torna o conteúdo de proteína não se correlacionar com o nível de ARNm. LT-PCR, desenvolvido pela GenoSaber Biotech, mostrou-se promissor na detecção de CTC por meio de proteínas de superfície. Aqui pretende-se avaliar a capacidade do LT-PCR para examinar CTC em pacientes com NSCLC. Neste método, o CTC foi etiquetado com um conjugado de um ácido fólico ligando específico de tumores, ligado selectivamente a células de cancro de pulmão de células não-pequenas sobre-expressam o receptor de folato [28] – [31], e um oligonucleótido sintetizado (Figura 1) . O conjugado serve como uma molécula de adaptador para converter um detector CTC em moléculas “oligonucleótidos” que podem ser amplificados para análise quantitativa. É proposta deste estudo foi avaliar o valor clínico de detecção do receptor de folato CTC positivo em doentes com NSCLC.

Após o enriquecimento negativo por depleção imunomagnética de leucócitos, CTC foram marcados com um conjugado de um ligando específico do tumor e um oligonucleótido. Os CTC marcadas foram cuidadosamente lavados para remover os conjugados livres. Em seguida, os conjugados ligados foram retirados do CTC e analisadas por qPCR.

Materiais e Métodos

Os reagentes

O kit de células de câncer de pulmão que circula CytoploRare® foi fornecido por GenoSaber Biotech Co. Ltd. (Xangai, China). O kit compreende dois componentes: um é para o enriquecimento do CTC e o outro é para a detecção e quantificação do CTC. O componente de enriquecimento inclui tampão de lise de glóbulos vermelhos, tampão de incubação, anti-CD45 de depleção de leucócitos esferas magnéticas, tampão de lavagem, tampão de marcação, decapagem e tampão de tampão de neutralização. O componente de detecção e quantificação inclui tampão de PCR reacção, iniciadores, água desionizada, controlos de células positivas e negativas, controles e padrões de PCR. As sequências dos iniciadores foram listados como se segue. Iniciador de RT, 5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGGTTCTAA-3 ‘; iniciador directo, 5’- TATGATTATGAGGCATGA-3 ‘; Iniciador inverso, 5’-GGTGTCGTGGAGTCG-3 ‘; Taqman Probe, 5’-FAM-CAGTTGAGGGTTC-MGB-3 ‘.

Seguindo o manual de instruções do fabricante, o CTC foi enriquecida por lise de eritrócitos e exaustão imunomagn�ica de leucócitos a partir de 3 amostra de sangue mL. O CLA enriquecido foi etiquetado com um conjugado de um ligando de ácido fólico específico do tumor e um oligonucleótido sintetizado. Após a marcação, o CLA enriquecido foi lavado cuidadosamente para remover os conjugados não ligados. Em seguida, os conjugados ligados foram especificamente descascada da superfície do CTC e recolhidas para análise por PCR quantitativa (Figura 1). Antes de amplificação, o conjugado primeira recozido e estendido sobre a cartilha RT. Depois disso o conjugado foi amplificado estendida e analisadas utilizando uma sonda Taqman baseado método de PCR quantitativo. No método acima, as células de tumor circulantes foram identificadas como células positivas para receptor de folato marcado como por oligonucleótidos ligados em folato.

A linha celular

usado linha celular de cancro nasofaríngeo humano KB, que expressa folato um receptor (FR) na superfície da célula, para avaliar a percentagem de recuperação em ensaio celular cravado. As células KB foram cultivadas em folato deficiente em meio RPMI-1640 (Life Technologies) com soro bovino fetal a 10% (Life Technologies) a 37 ° C em atmosfera humidificada contendo 5% de CO

2.

Pacientes

Setenta e dois pacientes com NSCLC, 20 com doenças pulmonares benignos, e 24 gênero e dadores saudáveis ​​da mesma idade foram incluídos no estudo. Nos pacientes com NSCLC, 33 pacientes foram diagnosticados inicialmente, e 39 pacientes estavam em quimioterapia. as características dos pacientes com câncer estão presentes na Tabela 1. As características do grupo de pacientes de doenças benignas estão listadas na Tabela S1 S1 Arquivo. Três mililitros de sangue periférico foram retiradas para tubos contendo anticoagulante EDTA de indivíduos que participaram neste estudo. Todos os voluntários dos doentes e saudáveis ​​incluídos neste estudo assinaram termo de consentimento informado antes de doar sangue. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital de Shanghai Chest Hospital e Comitê de Ética da Affiliated Hospital da Universidade de Nantong.

A preparação da amostra

Para preparar as amostras de sangue para análise de PCR, foram CTCs enriquecida por lise de eritrócitos e subsequente depleção de leucócitos referentes com o protocolo do fabricante. Resumidamente, as amostras de sangue completo anti-coagulantes foram primeiro lisadas por tampão de lise de glóbulos vermelhos (v:v, 01:04) durante 15 min em gelo. As células foram então tratadas com 200 ul de anti-CD45 esferas magnéticas revestidas durante 30 min para esgotar os leucócitos. Depois disso, o CTC foi incubada com 10 ul de tampão de rotulagem (oligonucleótido ligado-folato) por 40 min a temperatura ambiente. As células foram então lavadas 3 vezes com 1 mL de tampão de lavagem a 500 g. Finalmente, as células foram tratadas com 120 ul de tampão de decapagem para remover os conjugados de ligando-oligonucleótido. O sobrenadante foram recolhidos por centrifugação e neutralizou-se por 24 ul de tampão de neutralização para posterior análise por PCR.

análise de PCR

em tempo real de reacção em cadeia da polimerase quantitativa foi realizada utilizando o kit de células de cancro do pulmão que circula na CytoploRare® sistema ABI StepOne ™ (Life Technologies). Duas e meia microlitros das amostras preparadas foram adicionados a um sistema reaccional de 25 ul de PCR seguindo o manual de instruções do fabricante. As condições da reacção PCR foram as seguintes: desnaturação a 95 ° C durante 2 min, emparelhamento a 40 ° C durante 30 s, extensão a 72 ° C durante 30 s, em seguida, arrefecimento a 8 ° C durante 5 min; 40 ciclos de desnaturação a 95 ° C durante 10 s, emparelhamento a 35 ° C durante 30 s e extensão a 72 ° C durante 10 s. Uma série de normas com oligonucleotídeos (10

-14 a 10

-9 M, correspondente a 2 a 2 × 10

5 unidades do CTC /3 ml de sangue) são utilizados para CTC quantificação. Todas as amostras dos doentes foram testados em duplicado com os padrões de 6 e 3 controlos de qualidade. Por protocolo do fabricante, a variação intra-ensaio média (a diferença máxima entre duplicados) deve ser ciclo de 0,5 limiar para os padrões e controles de qualidade, e . 1 ciclo de limiar para amostras testadas

Recuperação, linearidade e limite de estudos de quantificação

para estabelecer um sistema legítimo de avaliar a precisão e linearidade deste ensaio, amostras de sangue de doadores saudáveis ​​foram reunidas e alíquota em 3 amostras mL, que foram incrementadas com 5, 10, 20 , 40, e 200 células KB em cultura. O sangue não enriquecido, reunidas serviu como um controlo negativo (CN). Duas centenas de milhares de células KB em cultura serviu como uma referência positiva (PR). As experiências acima foram repetidas 3 vezes. As contagens de células foram observadas calculado pela equação abaixo:. A percentagem de recuperação foi determinada dividindo a quantidade da célula observada pela quantidade das células enriquecidas

Para determinar a linearidade do ensaio, foi analisada a observados e cravado CTC conta em todos os pontos de dados por meio de regressão linear. Nós removemos o variável de confusão da recuperação por cento usando o valor observado da amostra original dividido pelos factores de diluição para determinar os valores esperados para a série de diluição para cada amostra testada.

imunocoramento CTC enriquecido

Três amostras de sangue mililitro de dois pacientes não-pequenas células, cancro do pulmão de células foram enriquecidas usando o protocolo acima mencionado. As amostras CTC enriquecidos e células KB em cultura foram fixadas por meio de metanol durante 10 min a -20 ° C. Em seguida, as células foram marcadas com um anticorpo monoclonal pan-citoqueratina conjugados com ficoeritrina (SC-8018PE, Santa Cruz, diluída em 1:100) e uma conjugados fluorescentes de ácido fólico [19] (Wuxi AppTec, China, 10 nM) durante 1 hora. Depois disso, a amostra foi lavada três vezes com PBS, seguido por montagem com 4′-6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) contendo montagem (Life Technologies) meios de comunicação, e subsequentemente submetido a análise de imagem utilizando um microscópio confocal (Leica Microsystems, Alemanha).

as avaliações clínicas

Para avaliar a utilidade clínica, que temos realizado um estudo duplo-cego, em dois centros em pacientes com doenças pulmonares benignos e malignos. A fim de avaliar a diferença entre os grupos de teste, foi utilizado o teste t de Student com correção de Welch para variâncias desiguais com intervalo de confiança de 95%. Para determinar o limiar, a especificidade e a sensibilidade do método, os dados de pacientes com NSCLC inicialmente diagnosticado foram submetidos à análise receiver operating characteristic (ROC) por Prism (GraphPad Software). O critério para determinar o valor de corte ideal na análise ROC é maximizar o valor total de especificidade e sensibilidade.

Resultados

calibração PCR ea unidade CTC

Como um link externo curva de calibração, foram utilizados seis padrões contendo uma série de concentrações dos oligonucleótidos conjugados para calcular a quantidade de receptores de folato na CTC (Figura S1). Para extrapolar a quantidade de CTC a partir da quantidade de receptores de folato, usamos uma unidade arbitrariamente definido, denominado unidade CTC. Conforme determinado pela curva de calibração, a quantidade de número receptor de folato em 1 × 10

5 células KB é de 7,5 × 10

-14 mol, que é definida como 1 × 10

5 unidades do CTC. A gama detectável do ensaio é de 2 a 2 × 10

5 unidade CTC. Para os controlos de qualidade, o coeficiente intra-ensaio de variabilidade (CV) é de 2,6% para 3,8%, e inter-ensaio é CV de 3,3% para 5,3% (Tabela S2 em S1 do ficheiro).

Validação de o método de PCR alvo-ligando para quantificação CTC

a célula KB spiking estudo mostrou que 80% das células enriquecidas poderiam ser recuperados a cada concentração de (5, 10, 20, 40 e 200) (Figura 2A ). O rácio médio de recuperação CTC foi de 81% em 5 células incrementadas em 3 ml de sangue, e ainda maior em amostras inoculadas com maior concentração de células. Com os resultados do estudo de cravação, foram realizados os mínimos quadrados para ajustar comparação da quantidade observada e cravado em todas as séries de diluição (Figura 2B). A equação de regressão foi Y = 0,9455 × -0,831 com R

2 = 0,9946. O estudo indicou que mais de a concentração CTC testado a recuperação média, derivada da análise de regressão, é de 94,6%.

A) rácio de Recuperação de ensaio de células cravado. B) curva de regressão linear de ensaio de células cravado. C) Ensaio de especificidade do ensaio. células KB perfurantes foram tratadas com (

competiu

) ou sem (

controle

) 10 mM ácido fólico antes da rotulagem. amostras de sangue D) saudável dos doadores enriquecida com 20 KB células

(20 células)

ou sem células tumorais KB

(controle)

foram marcadas por 10 nM conjugado folato-oligonucleotídeo

(conjugado )

ou não conjugada-oligonucleotídeo

(oligonucleotídeo)

após enriquecimento. Os dados são apresentados com média ± SD de três ensaios independentes.

Para avaliar a variação intra-ensaio (imprecisão intra-ensaio), analisamos uma amostra de 100 células KB em 3 ml de sangue na mesma executado em triplicado, seguindo o protocolo acima. Em seguida, foi avaliada a variação inter-ensaio (imprecisão entre-run) pela análise de uma mesma amostra em triplicado em 6 ensaios separados em 6 dias diferentes. O CV intra-ensaio é de 11,2%, e inter-ensaio é CV 14,2% (Tabela S3 no ficheiro S1).

Para determinar a especificidade deste método foi realizado um estudo de competição utilizando 10 uM de ácido fólico como um ligando competidor de oligonucleótido ligado a folato. Os resultados da experiência mostrou que o ácido fólico 10 uM pode bloquear o conjugado de se ligar às células KB (Figura 2C). O bloqueio fornece a prova da especificidade do oligonucleótido ligado a folato ligado ao receptor de folato em células KB perfurantes.

Deve notar-se que existem sinais “de fundo” para amostras de sangue de doadores saudáveis. Para investigar a origem do sinal de “fundo”, nós rotulados amostras de sangue dos doadores saudáveis ​​enriquecida com 20 células KB ou sem células tumorais KB, usando conjugado 10 nM folato-oligonucleotídeo ou -oligonucleotide não conjugada (Figura 2D). As amostras de sangue inoculadas com células de tumor não se ligam ao oligonucleótido ligado a folato ou oligonucleótidos não conjugados indiscriminatively, tal como determinado por qPCR. Em contraste, as amostras inoculadas com células de tumor pode ser, obviamente, marcado por oligonucleótido-folato conjugado em vez do oligonucleótido não conjugada. Os resultados sugerem que os sinais de “fundo” foram causados ​​pela ligação dos oligonucleótidos para as células sanguíneas residuais nas amostras enriquecidas. Mais importante, o sinal de “fundo” causada por “efeito de ligação oligo” não comprometeria a detecção específica de rara CTC como demonstrado abaixo.

Para melhor avaliar a especificidade de expressão FR na CTC em NSCLC, três amostras de sangue mililitro de dois pacientes metastáticos que transportam FR CTC positiva foram enriquecidas usando o protocolo acima mencionado. Em seguida, as amostras CTC enriquecido e células KB em cultura foram fixadas por meio de metanol, e marcado por conjugados fluorescentes de ácido fólico, o anticorpo monoclonal para citoqueratinas e reagente de coloração nuclear, DAPI. Como mostrado na Figura 3, as células KB e as células de tumor circulantes foram especificamente rotulados por fluorescentes conjugados de folato (verde) e anticorpo citoqueratinas (vermelho). Em contraste, as pequenas leucócitos não pode ser marcado pelos conjugados fluorescentes folato e anticorpo citoqueratina (Figura 3 h e 3L). Além disso, no âmbito da observação ao microscópio, o CTC e células KB em cultura mostraram um nível de expressão semelhante do receptor de folato (Figura 3).

células KB (A-D) e CTC enriquecidas a partir de dois doentes com NSCLC metastáticas (sample1 CTC : e-H; amostra CTC 2: I-G) foram fixados por meio de metanol, e coradas para citoqueratina (a, e e I) e o receptor de folato (FR) (B, F e J). O núcleo da célula foi marcado por DAPI (C, G e K). As imagens fundidas mostrou citoqueratina e receptor de folato são expressos apenas em CTC (H e L) e as células KB (D), não em células hematológicas.

CTC prevalência em amostras clínicas

como mostrado na Tabela 1, um total de 72 pacientes com NSCLC foram inscritos no estudo. Como grupos de controlo, obteve-se sangue periférico de 20 pacientes com doenças pulmonares benignos e 24 dadores saudáveis.

Em primeiro lugar, nós comparamos os níveis CTC em pacientes com câncer no momento do diagnóstico inicial, os doentes com doenças benignas e indivíduos saudáveis. Como mostrado na Figura 4A, os níveis CTC no sangue de pacientes com localizada (fase I, II e III; significa 11,9 unidade CTC; gama 3,8-25,7 unidade CTC;

p

= 0,0011) ou metastático (estágio IV , média de 20,9 unidade CTC; gama 6,8-75,0 unidade CTC;

p

= 0,0055) doenças é significativamente maior do que os voluntários saudáveis ​​(média de 6,7; intervalo 3,0-11,4 unidade CTC) e pacientes com doença pulmonar benignas (média de 6,0; variam 1,6-8,7 unidade CTC). Os pacientes metastáticos têm mais CTC do que os pacientes localizadas (

p

= 0,045). Os resultados anteriores indicaram que os pacientes têm metastáticas localizadas e níveis distintos de CTC. Numa análise mais avançada, queremos investigar a sensibilidade do método para diferentes subtipos histológicos de NSCLC. Para os 16 pacientes de adenocarcinoma, os níveis CTC (média de 18,1, intervalo 3,8-75,0) não mostram diferença significativa dos pacientes 11 carcinoma de células escamosas (SCC) (média de 12,4, intervalo 4,3-20,8) e de outros subtipos histológicos (média de 15,1, gama 10,1-25,7) (Figura 4B). Este resultado sugeriu a expressão do receptor de folato pode ser semelhante em todos os subtipos histológicos em pacientes com NSCLC.

A) níveis CTC em doença localizada e metastático maligno do pulmão, doença pulmonar benigno e doadores saudáveis. B) Distribuição de níveis CTC em diferentes subtipos histológicos. ADC, adenocarcinoma; SCC, carcinoma de células escamosas. C) Receptor operando análise característica (ROC) entre o grupo de doenças pulmonares malignos e doença benigna e o grupo saudável.

Para analisar ainda mais a sensibilidade e especificidade do ensaio para as diferentes fases patológicas e subtipos histológicos em NSCLC, primeiro precisamos estabelecer o limite de corte por análise ROC. Figura 4C mostrou que o limite de corte entre o grupo controle (pacientes benignos e voluntários saudáveis) e grupo do cancro diagnosticado inicialmente foi de 8,5 unidade CTC, a sensibilidade é de 81,8%, e a especificidade é 93,2%. Obviamente, CTC foram detectados em amostras de sangue de 82% (27 de 32) dos pacientes com NSCLC inicialmente indicada, enquanto que os falsos positivos em 20 pacientes benignos doença (5%, 1 de 20) e 24 voluntários normais eram insignificantes (8%, 2 de 24 ). Como mostrado na Tabela 2, 80% (8 de 10) de fase I-II, 67% (6 de 9) da terceira fase, e 93% (13 de 14) de fase IV pacientes foram encontrados para ter mais do que 8,5 CTC unidade. Em subtipos histológicos, 69% (11 de 16) dos pacientes de adenocarcinoma foram CTC positivo, e 91% (10 de 11) dos pacientes SCC foram CTC positivo.

Os estudos publicados indicaram a quimioterapia pode comprometer a presença de CTC em circulação [1], [4], [5]. Foi realizado um estudo preliminar para comparar o número CTC em pacientes com NSCLC no momento do diagnóstico inicial e quimioterapia. Como mostrado na Figura 5, 16 pacientes localizadas em quimioterapia (média 5,8, intervalo 0,7-11,5) têm significativamente mais baixos do que os níveis CTC os pacientes diagnosticados inicialmente (

P

= 0,0006); Considerando que a diferença nos níveis de CTC em pacientes metastáticos com ou sem terapia não foi tão significativo como os pacientes localizados. Embora o nível CTC média em pacientes metastáticos no diagnóstico inicial foi de 20,9 unidade CTC, em comparação com 13,5 unidade CTC em pacientes em quimioterapia, o teste t não verificou que a diferença foi significativa em um

p valor de 0,05

. A análise estatística sugeriu que os pacientes com NSCLC localizadas podem ter um melhor prognóstico em comparação com os pacientes metastáticos quando colocado em quimioterapia

w /o quimio

, pacientes com NSCLC inicialmente diagnosticados.;

com quimio

, pacientes com NSCLC em quimioterapia.

Discussão

Nós avaliamos técnica de LT-PCR para quantificar CTC em amostras de sangue periférico de pacientes com NSCLC. A tecnologia é baseada em esgotamento negativo de leucócitos seguido de rotulagem dos CTC com oligonucleotídeo ligado ao folato e quantificação subsequente com qPCR. Estudos com amostras de sangue saudáveis ​​enriquecida com células tumorais demonstrar que o ensaio é específico, quantitativa e linear a partir de uma gama de 5-200 células por 3 mL de sangue analisadas. Avaliação de amostras de sangue de pacientes demonstra que o método é sensível o suficiente para estratificar pacientes com status diferente da doença (benigna, localizada e metastático).

As vantagens potenciais de LT-PCR para os oncologistas podem incluir 1) avaliação não invasiva da carga tumoral no sangue periférico, 2) análise de ultra-sensível que permite a estratificação avançado de doenças pulmonares, 3) tão baixa quanto 3 volume de amostragem mL que não iria agravar a anemia dos pacientes causada por efeitos colaterais citotóxicos, 4) monitorização longitudinal de tempo real estado da doença e resposta à terapia, e 5) plataforma padronizada que elimina viés análise artificial.

a maioria

in vitro

exames de sangue diagnóstico para câncer de NSCLC sofrem de potenciais resultados falsos negativos e /ou positivos. O uso de revestimento anti-EpCAM esferas magnéticas foi tentada para o enriquecimento da CTC em amostras de sangue NSCLC. No entanto, os estudos clínicos mostraram que a baixa sensibilidade do enriquecimento EpCAM com base na detecção de CTC para pacientes com NSCLC [12], [22]. Estudos publicados indicaram também que a célula que expressa não-EpCAM pode incluir a maioria dos CTC no sangue periférico NSCLC, e, portanto, com base EpCAM enriquecimento pode falhar na detecção rara CTC [22]. Detectamos a expressão do receptor de folato em EpCAM CTC positivos e negativos em doentes com NSCLC. Anti-EpCAM esferas magnéticas revestidas foram usadas para separar EpCAM-EpCAM positiva e negativa fracção do CTC. Encontramos o número CTC positiva FR foi muito maior na fração de EpCAM-negativos do que em fração EpCAM-positivo em todos os três pacientes com NSCLC (Figura S2). Os resultados indicaram que o EpCAM base de captura pode perder grande fracção dos CTC no cancro do pulmão. antígeno carcinoembrionário (CEA), uma glicoproteína envolvida no desenvolvimento do cancro do pulmão, também é encontrada em células doentes normais ou benignos divulgados em circulação [32]. A aplicabilidade de CYFRA21-1, que é um citoqueratina 19 fragmentos libertados no sangue, tem sido investigada em estudos no diagnóstico de NSCLC [33] – [35]. Embora CYFRA21-1 pode ser o marcador de tumor mais sensível em NSCLC avançado, a sensibilidade do CYFRA21-1 ainda é baixo para a doença em estágio inicial [33], [35].

Os dados publicados a partir de biópsia de tecido mostraram 72% do cancro do pulmão -83% sobre-expressar a FR na superfície da célula [28] – [31]. Relatórios recentes mostraram o positivo CTC FR foram encontradas em cancros do ovário [19]. Até o momento, nenhum estudo foi relatado para a prevalência de FR CTC positiva em NSCLC. Neste estudo, nós investigamos o valor clínico do receptor de folato CTC positiva em NSCLC. Os resultados indicaram a FR é um marcador de superfície de potencial na identificação de doentes com NSCLC CTC, mesmo na fase inicial. Estudos recentes mostraram que, na massa de tumor primária, FR expressão é muito menor do que no SCC no adenocarcinoma em cancro metastático [29]. No entanto, encontramos a expressão FR em CTCs é semelhante em todos os subtipos histológicos. Esta constatação contraditória pode ser explicado pela distribuição diferente de fases patológicas histológicas para subtipos individuais. Iwakiri

et ai.

Relatado que a menor expressão de receptor de folato foi encontrada na fase avançada em relação ao estágio inicial em NSCLC [36]. Nos pacientes inscritos em nosso estudo, 48% têm adenocarcinomas (estágio IV, 44%), 33% têm carcinomas de células escamosas (estágio IV, 27%) e 18% têm câncer de pulmão não especificado. A positividade FR menor em adenocarcinomas em nosso estudo poderia ser explicado pela alta porcentagem de pacientes em estágio final de inscritos em relação ao grupo SCC. Como assim, não existe outra possibilidade que CTC pode expressar FR diferente de massas tumorais primárias. literatura anterior indicou expressão gênica diferencial entre tumor primário e amostra CTC [37]. Um grande escala, estudo clínico bem desenhado seria necessário para lidar com a preocupação acima.

Embora receptor de folato tem sido identificada em tecidos normais, incluindo os rins, o baço e pulmão, etc [28]. No entanto, não existem células que expressam receptores de folato no sistema circulatório excepto CTC ou monócitos activados [19], [38]. Estudos preliminares verificou que esta subpopulação de monócitos activados é dificilmente detectável nas amostras de sangue de dadores saudáveis ​​ou de pacientes benignos [19], [39]. Em 9% dos casos em que “CTC” podem ser detectadas em amostras saudáveis, podem existir possibilidade de expressão ilegítima de monócitos. Mas a hipótese deve ser verificada num estudo mais aprofundado. a expressão do receptor de folato, também é encontrado em macrófagos activados tumorais [40]. A fim de examinar o efeito macrófagos neste sistema de detecção em pacientes com NSCLC, anti-CD14 esferas magnéticas revestidas foi usada para os macrófagos activados esgotam na amostra de sangue de doentes com NSCLC [41], após a depleção de leucócitos CD45-positivas. Encontramos as contagens CTC foram pouco mudou sob o tratamento “extra-CD14” em pacientes com NSCLC (Figura S3). Este resultado sugeriu que o mecanismo de esgotamento usando anti-CD45 esferas magnéticas é suficiente para eliminar o impacto de macrófagos associados a tumores no CTC conta.

Neste estudo, verificou-se um fundo de baixo “CTC” nível nos indivíduos saudáveis e pacientes com doenças benignas. Como demonstrado a partir do estudo de especificidade, o sinal de fundo pode resultar da ligação de oligonucleótido às células do sangue residuais. Embora a literatura anterior descreveu vários mecanismos para a ligação do oligonucleótido a células de mamífero [42], não há consenso para este processo biológico. No entanto, todos estes estudos demonstraram que a quantidade de ligação de oligonucleótido é significativamente mais baixa em comparação com os conjugados. Estamos confiantes de que o “fundo CTC” não irá interferir com a detecção do real “CTC” em pacientes com câncer de pulmão.

Finalmente, porque mais altas contagens CTC foram relatados para associar a um prognóstico ruim em cancros metastáticos [ ,,,0],2], [4], [43], LT-PCR seria potencialmente identificar o subgrupo de pacientes com mau prognóstico na fase precoce da doença e, por conseguinte, ajuda oncologistas para prescrever terapias mais eficazes. Numa análise mais avançada, o fenótipo de CTC proporcionaria evidência directa para os oncologistas para determinar o regime de tratamento óptimo. Com ligando de afinidade adequado (por exemplo, anticorpos, peptídeos, pequenas moléculas químicas, etc.), a LT-PCR pode ser mais explorada para fenotipagem rara CTC em um multiplex, moda de alto rendimento.

Informações de Apoio

Figura S1. curva

calibração de parâmetros qPCR e linearidade

doi:. 10.1371 /journal.pone.0080458.s001

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Figura S2. expressão do receptor de folato

em EpCAM CTCs positivos e negativos em pacientes com NSCLC. amostras CTC foram enriquecidas a partir de 3 ml de sangue de três pacientes com NSCLC positivos FR por lise de eritrócitos e exaustão imunomagn�ica de leucócitos. Em seguida, as amostras foram incubadas CTC enriquecidos com esferas anti-EpCAM magnéticos (Life technologies, Cat N ° 16203) durante 30 minutos. Após o isolamento imunomagnética durante 10 min, as células positivas para EpCAM foram capturados pelas esferas magnéticas. As células negativas para EpCAM foram recolhidas a partir do sobrenadante por centrifugação a 600 g durante 15 min. Depois disso, as duas fracções de amostra CTC foram marcadas e detectadas como o protocolo acima mencionado. Os dados são apresentados com média ± SD de três ensaios qPCR independentes

doi:. 10.1371 /journal.pone.0080458.s002

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Figura S3.

O impacto de macrófagos associados a tumores em pacientes com NSCLC positivos FR. amostras CTC foram enriquecidas a partir de 3 ml de sangue de três pacientes com NSCLC positivos FR por lise de eritrócitos e exaustão imunomagn�ica de leucócitos CD45-positivo. Tabela S1. Tabela S2. Tabela S3.