Abstract

Fundos

invasão Peritoneal no cancro do cólon é um importante fator prognóstico. invasão peritoneal pode ser objectivamente identificados como invasão periotoneal elástica laminal (ELI) usando mancha elastica, e o microambiente formado por cancro da invasão peritoneal (CMPI) também pode ser observada. Casos com ELI mostrar mais frequência metástases à distância e recorrência. Portanto, CMPI pode representar um meio particular, que facilita a progressão do tumor. patológica e biológicas em CMPI pode lançar luz sobre este microambiente do câncer, possivelmente distintivo.

Métodos

analisadas microarrays de tecido específico da área para determinar as características patológicas da CMPI, e propagadas subperitoneais fibroblastos (PESA ) e fibroblastos da submucosa (SMFs) a partir de tecido do cólon humano. Características biológicas e resultados de análises do perfil de expressão génica foram comparados a compreender melhor a invasão peritoneal de cancro do cólon e como esta pode formar um microambiente especial através da interacção com SPFs. tumores de xenoenxerto rato, obtidas por co-injeção de células cancerosas com tanto SPFs ou SMFs, foram estabelecidos para avaliar o seu papel activo na progressão de tumores e metástases.

Resultados

Nós achamos que a fibrose com alfa actina do músculo liso (α-SMA) expressão era uma característica patológica significativa de CMPI. As diferenças na proliferação e expressão de gene perfil análises sugeriu SPFs e SMF foram populações distintas, e que SPF foram caracterizados por uma baixa maior manifestação de matriz extracelular (ECM) -associated genes. Além disso, em comparação com SMFs, SPFs apresentou alteração mais variável na expressão dos genes após a estimulação médio de células de câncer condicionado. análise do gene ontologia revelou que os genes regulados positivamente específicos do SPF foram enriquecidos pela actina de ligação ou genes associados a contráteis incluindo α-SMA codificação ACTA2. tumores de xenoenxerto de murganho derivadas por co-injecção de células cancerosas com SPFs mostrou melhoria do crescimento do tumor, metástase, e a capacidade para a formação de tumor em comparação com os derivados de co-injecção com células cancerosas e SMF.

Conclusões

CMPI é um microambiente especial, e interação de SPFs e células cancerosas dentro de CMPI promover o crescimento de tumores e metástases

Citation:. Kojima M, Higuchi Y, Yokota M, Ishii G, Saito N, Aoyagi K, et ai. (2014) Human subperitoneal de fibroblastos e câncer de células Interação Cria Microenvironment que aumenta a progressão de tumores e metástases. PLoS ONE 9 (2): e88018. doi: 10.1371 /journal.pone.0088018

editor: Soroku Yagihashi, Hirosaki University Graduate School of Medicine, Japão

Recebido: 27 de setembro de 2013; Aceito: 02 de janeiro de 2014; Publicação: 04 de fevereiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Kojima et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por JSPS KAKENHI número de concessão 24590458, e uma concessão de uma estratégia global de 10 anos 3ª prazo de Controle do Câncer (23-a-3). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Embora o tamanho do tumor é um importante fator prognóstico em muitos tipos de câncer, o prognóstico no câncer gastrointestinal é estratificada não pelo tamanho do tumor, mas pela disseminação do tumor [1]. invasão peritoneal no cancro colorectal tem sido relatada como sendo um forte factor de prognóstico, mas este termo não foi bem definido, e métodos de detecção e diagnóstico têm sido questionada [2] – [4]. patológicos relatórios recentes demonstraram que a mancha elástica, o que evidencia a lâmina elástica peritoneal perto da superfície periotoneal, é útil para a detecção de invasão objectivo peritoneal. Nós e outros determinaram que a invasão peritoneal definido como invasão tumoral além da lâmina elástica peritoneal (elástica invasão laminal: ELI) é um forte fator de prognóstico que pode influenciar critérios futuros PT na União de Controle do Câncer Internacional (UICC) classificação TNM [5] – [7]. O peritônio é uma membrana muito fina, no prazo de 500 mm de espessura, e existe a lâmina elástica peritoneal dentro dessa membrana. A frequência de recorrência e metástase síncrono é aumentada por 2 a 4 vezes quando um tumor invade este espaço estreito [5]. Estes resultados podem sugerir que a progressão do tumor e metástases são facilitados por um microambiente formado por cancro da invasão peritoneal (CMPI). A extensão da CMPI pode ser identificado por meio da coloração com elastica, e características patológicas da CMPI também pode ser determinada.

Uma micromatriz de tecido facilita a avaliação da expressão da proteína por um grande número de blocos de tecido a partir de uma única amostra, e micromatrizes de tecidos específicos de área têm sido relatados como sendo úteis para o estudo de áreas específicas do tumor em grandes coortes [8]. Após a determinação da CMPI usando mancha elastica, um núcleo de tecido pode ser obtida a partir desta área e uma comparação com as características de outras áreas tumorais também pode ser realizada. Este processo pode permitir uma avaliação dos fenômenos biológicos importantes que ocorrem neste microambiente do câncer.

Os recentes avanços na pesquisa sobre o câncer estabeleceram o conceito de microambiente do câncer que promove a iniciação do tumor, invasão e metástase [9]. Embora o microambiente do cancro é composto por diversos tipos de células, a utilização de micromatrizes de tecidos específicos de área pode permitir uma focagem sobre os componentes celulares que caracterizam CMPI. Além disso, se esses componentes celulares podem ser cultivadas a partir do histologicamente região subperitoneal correspondente, um estudo biológico para elucidar esse microambiente-promoção do câncer putativo pode ser realizada.

O objetivo deste estudo foi o de explicar como o prognóstico do câncer colorretal é afectada pela invasão peritoneal. Construímos sistema tissue microarray de área específica para determinar os componentes celulares característicos da CMPI. Em seguida, nós cultivada subpopulações de fibroblastos específicos a partir da submucosa e camadas subperitoneais da parede do cólon humano. As características biológicas e perfis de genes de fibroblastos submucosos (SMFs) e fibroblastos subperitoneais (PESA) com ou sem meio-célula cancerosa condicionado (CCCM) estimulação foram comparados. Subsequentemente, foi elaborado de xenoenxerto de tumores por co-injecção de células de cancro, quer com SPFs ou SMF. Nosso estudo propõe um novo candidato para um microambiente de promoção de câncer em câncer de cólon e elucidado SPFs jogadores como cruciais para o reforço da progressão tumoral e metástase.

Pacientes e Métodos

Ética Declaração

Este estudo foi aprovado pelo Conselho Cancer Center Hospital Oriental de revisão Institucional Nacional (no: 19-021). Um consentimento geral escrito para usar materiais biológicos para a pesquisa foi obtido de cada participante antes da aquisição de tecidos. Experiências com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética animal do National Cancer Center Hospital Oriente (K11-032).

características do paciente e Detecção de ELI

Quatrocentos pacientes consecutivos com a classificação TNM (5

th edition) pT3 e pT4a cancro do cólon [10], submetidos a cirurgia entre 1996 e 2003 no National cancer Center Hospital Leste, foram inscritos. Usando mancha elastica, foram identificados 173 casos com ELI e examinou ainda mais esses utilizando microarrays de tecido específico da área [5], [8]. Dos 173 casos com ELI, 107 foram pT3 e 66 foram pT4a.

Construção de arrays de tecido da área de Específico

Para elucidar as características patológicas da CMPI no tecido do cancro do cólon, definimos o câncer microambiente do seguinte modo: (a) tem uma borda CMPI tumor com invasão peritoneal e (b) o microambiente formado por cancro da invasão submucosa (CMSI) tem uma borda submucosa invasivo do tumor (Figura 1A) [5]. A tissue microarray 2-ponto, em seguida, foi estabelecida como previamente descrito [8]. Cada área do tumor foi marcada com tinta no slide histológico; um único núcleo de tecido de 2 mm de diâmetro foi obtido a partir de cada um microambiente do cancro e transferida para um bloco receptor usa um tecido microarrayer (Azumaya, Tóquio, Japão). Em 24 casos, tecido de cancro insuficiente foi obtido a partir do CMPI. No entanto, o tecido suficiente foi obtido em 149 casos; estes foram analisados ​​histologicamente e imunohistoquímica (ver Materiais e Métodos S1, S1 e Tabela).

(A) Esquema do microambiente formado por cancro da invasão peritoneal (CMPI) e o microambiente formado por cancro da invasão submucosa (CMSI) definido como (a) frente invasiva com invasão peritoneal e (b) submucosa frente invasiva, respectivamente. (B) A distribuição de fibrose no tecido do cancro do cólon humano. barras cinzentas escuras mostram o número de casos com fibrose mais de 50% do núcleo de cada área do tumor, e iluminar barras cinzentas mostram o número de casos, sem fibrose extensiva. amostras de núcleo com CMPI mostrou uma frequência mais elevada de fibrose acentuada do que amostras de núcleo com CMSI (

P Art 0,01). (C) Distribuição de expressão α-SMA no tecido do cancro do cólon humano. CMPI mostrou expressões mais elevadas α-SMA do que as observadas em CMSI (

P

0,01). (D) Distribuição de células CD3-positivas em tecido de cancro do cólon humano. Número de células CD3-positivo não foram significativamente diferentes entre CMPI e CMSI. (E) Distribuição de células CD68-positivas em tecido de cancro do cólon humano. Número de células CD68-positivas não foram significativamente diferentes entre CMPI e CMSI. (F) Distribuição das embarcações CD31 positivo no tecido do cancro do cólon humano. Números dos vasos CD31-positivo não foram significativamente diferentes entre CMPI e CMSI. Resultados em (B) são apresentados por números de caso, e aqueles em (C-F) são apresentados como a média ± SD de 149 casos (**

P Art 0,01).

Antibodies, Regents, e imuno-histoquímica

os anticorpos, reagentes e os procedimentos de imuno-histoquímica utilizados estão descritos em Materiais e Métodos S1 eo S2 Table.

Avaliação de tissue microarray Área específica secções

imagens de diapositivos de alta resolução foram adquiridos a partir de todos os núcleos de tecido com hematoxilina-eosina (HE) e coloração imuno-histoquímica, utilizando NanoZoomer scanner de slides 2.0-HT (fotônica Hamamatsu, Hamamatsu, Japão). Todos os núcleos foram analisados ​​usando software de visualização (NDP vista: fotônica Hamamatsu, Hamamatsu, Japão). Quando a área de fibrose foi superior a 50% de um núcleo de tecido inteiro com um diâmetro de 2 mm por coloração H.E, que foi definida como positiva para a fibrose acentuada. Na coloração imuno-histoquímica, hot spots com CD3-, CD31- e CD68-positivas células ou vasos foram selecionados no software de visualização, em seguida, uma imagem de ampliação x20 (0,51 mm

2) foi tomada, e salva como um arquivo JPEG . As células positivas ou vasos foram contados em cada imagem utilizando o software de morfometria (WinRoof, Mitani Corporation, Fukui, Japão). Além disso, a área com maior alfa actina de músculo liso expressão (α-SMA) em fibroblastos foi selecionado, em seguida, uma ampliação x20 (0,51 mm

2) imagem foi tirada e salva como um arquivo JPEG. A proporção de área positiva o α-SMA em que a imagem foi calculado utilizando o software morfométrica, como descrito anteriormente [11]. A expressão α-SMA em tecido muscular normal, como determinado por comparação com uma lâmina de H.E de série, não foi avaliada. HE e os dados coloração imuno-histoquímica de CMPI foi comparada com a da CMSI para elucidar as características histológicas da CMPI.

Células e linhas de células primárias

tecido submucosa foi obtida a partir de tecido do cólon sigmóide mais de 5 cm a distância do tumor. de tecido do cólon foi dissecado a partir da camada muscular no lado luminal, e foram obtidos lâmina e tecidos camada mucosa. Em seguida, a lâmina foi esfregado distância para obter o tecido da submucosa. subperitoneal tecido foi obtido a partir do mesentério do cólon sigmóide em mais do que 5 cm de distância do tumor usando pinças operacionais e tesouras. Estes tecidos foram lavados com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e incubadas em 5% de tripsina durante 20 minutos, 3 vezes. O sobrenadante foi centrifugado, plaqueadas sobre um prato, e foram obtidos os fibroblastos da submucosa (SMFs) e fibroblastos subperitoneais (PESA) e, em seguida, cultivadas e mantidas em meio de MF-(Toyobo, Tóquio, Japão) [12]. Todas as experiências foram realizadas em células dentro de 8 passagens.

As linhas celulares de cancro colorrectal humano DLD-1 e Caco-2 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection e crescidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Sigma- Aldrich, Saint Louis, MO) contendo 100 U /mL de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), e soro fetal bovino a 10% (FBS;. Gibco, Palo Alto, CA):

Ensaio de Proliferação celular, imunocitoquímica de coloração, e análise de citometria de fluxo

ensaios de proliferação celular, de coloração imunocitoquímica, e citometria de fluxo foram realizadas análises tal como descrito em Materiais e Métodos S1.

a estimulação de fibroblastos por células do cancro do Médio

Inicialmente, 1,7 × 10

4 /cm

2 de fibroblastos e as células DLD-1 foram cultivadas separadamente em meio DMEM contendo 100 U /mL de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina, e 10% de FBS durante 48 horas, e em seguida foram deixados em jejum durante 24 horas. Em seguida, o meio foi removido dos fibroblastos, e a forma de as células DLD-1 em jejum foi adicionado aos fibroblastos durante 24 horas para estabelecer fibroblastos com meio de estimulação de células do cancro condicionado (CCCM). Como controle, fibroblastos foram fome de 48 horas (rendimento fibroblastos sem CCCM). SPFs SMF e com ou sem CCCM foram avaliadas usando análise imunocitoquímica ou a expressão do gene. Quanto à avaliação da expressão de α-SMA imunocitoquímico, a área com maior expressão α-SMA foi selecionado, em seguida, uma ampliação x20 (0,51 mm

2) imagem foi tirada e salva como um arquivo JPEG. A proporção de α-SMA área positiva na imagem foi calculado usando software de morfometria (WinRoof, Mitani Corporation, Fukui, Japão).

Análise

Gene Expression usando Microarray

Três conjuntos de SPFs e SMFs , com ou sem CCCM, obtido a partir de 3 pacientes diferentes, foram utilizados neste estudo. Usamos GeneChip Human Genome U133 mais 2,0 matrizes (Affymetrix, Santa Clara, CA). ADNc alvo foi gerado a partir de 100 ng de ARN total extraído de cada amostra, utilizando um Kit de 3 ‘IVT expresso (Affymetrix, Santa Clara, CA). Os procedimentos de hibridação alvo, lavagem e coloração para a amplificação do sinal foram realizadas de acordo com os protocolos do fornecedor. As matrizes foram digitalizadas com um scanner Gene Chip 3000 (Affymetrix, Santa Clara, CA) e a intensidade de cada característica da matriz foi calculado utilizando GeneChip Software operacional, versão 1.1.1 (Affymetrix, Santa Clara, CA). A intensidade média foi normalizada com a intensidade do alvo, que foi definida como igual a 1,000, para comparar diferentes matrizes de forma fiável. Os valores foram transformados de log médio e centrada. O GeneSpring programas (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) e Excel (Microsoft Corporation, Redmond, WA) foram utilizados para realizar análises numérica para a seleção genética.

heteróloga de Transplante e formação de tumor Ensaio

ou 1 × 10

6 células humanas de cancro colorectal de Caco-2 ou DLD-1 por si só, ou quer com 1 × 10

6 SPFs ou SMF, foram injectados por via subcutânea (sc) na parte traseira de ratinhos SCID (8 -12 semanas de idade, CLEA, Tóquio, Japão). Os volumes dos tumores foram calculados semanalmente como descrito anteriormente [13]. Os ratinhos injectados com células Caco-2 por si só ou com qualquer SPFs ou SMF foram mortos após 10 semanas, e os injectados com DLD-1 sozinha ou, quer com SPFs ou SMF foram mortos ao fim de 8 semanas, e os pesos dos tumores foram avaliados. Para a análise metastática distante, o tecido de pulmão e fígado foi removido e fixado em formalina a 10%, e para a análise de metástases linfáticas, pescoço e tecido adiposo inguinal também foi removida e fixada; todos os tecidos foram examinados histologicamente. Foram utilizados 8 ratos em cada grupo.

Para elucidar a capacidade dos fibroblastos para melhorar a formação de tumores, diluições em série de DLD-1 células cancerosas ou células Caco-2 foram igualmente co-injectados com 1 x 10

6 SMFs ou SPF. formação do tumor foi avaliado 4 semanas após a injecção. Nós usado 4 ratos para cada grupo.

Análise Estatística

X

2 de teste e

t

teste de Student foram utilizados na tissue microarray análise, o ensaio de proliferação de células, o transplante de xenoenxerto, e o ensaio de formação de tumores. A

P Art 0,05 foi definido como estatisticamente significativo. Na análise de microarray, os dados de expressão de genes foram analisados ​​utilizando GeneSpring GX12 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). dados de linha foram resumidas usando MAS5 e normalizado pela transformação logarítmica e mediana centralização de análises numéricas para a seleção genética. Para análise de componentes principais (PCA), foram utilizados conjuntos de sondas que foram medidos de forma confiável e variaram em 3 vezes acima da média global em pelo menos 2 amostras (aproximadamente 10%); As análises foram realizadas utilizando GeneSpring GX12. Os conjuntos de sondas diferencialmente expressos utilizados no agrupamento hierárquico supervisionado foram selecionados com base em

P Art 0,05 e dobre mudança (FC) 2.0.

valores P

foram calculados usando um ANOVA com Benjamini e Hochberg FDR correção de múltiplos testes. agrupamento hierárquico com cluster de ligação média em peso foi realizada utilizando os programas do Cluster e Treeview (Michael Eisen, da Universidade de Stanford, genome-www.stanford.edu). O agrupamento anotação funcional da análise Gene Ontology Enriquecimento foi realizada utilizando software DAVID, com o rigor de classificação definido para “High” e os clusters significativos foram selecionados com base em uma contagem de enriquecimento de 2,0 e

P Art 0.01 (teste exato de Fisher após Benjamini e Hochberg FDR correção de testes múltiplos) [14], [15].

Resultados

características histológicas de ELI

Não só as células tumorais, mas também variedades de células estromais constituem um microambiente cancro distinta, e alguns promover a metástase tumoral [9]. Primeiro, nós elucidado as características histológicas significativas de CMPI para lançar luz sobre os fenômenos que ocorrem neste meio, utilizando microarrays de tecido específico da área. As características clinicopatológicas dos 149 casos utilizados são apresentados na Tabela S1. Na coloração H.E, encontramos fibrose extensa (mais de 50%) mais frequentemente em CMPI do que foi visto em CMSI (Figura 1B). A proporção de área α-SMA positivos no CMPI foi também mais elevada do que a observada em CMSI (Figura 1C). As proporções de linfócitos T, macrófagos, ou microvasos avaliadas usando CD3, CD68, ou CD31, respectivamente, não foram significativamente diferentes entre CMPI e CMSI (Figura 1D-F). Tanto na CMPI e CMSI, fibroblastos em forma de fuso gordas eram fonte principal de expressão α-SMA, e a proporção foi analisado utilizando o software morfométrica (Figura 2A-D). Considerando os nossos resultados anteriores, que indicaram que a invasão peritoneal definido pelo ELI foi intimamente associada com metástases à distância, temos a hipótese de que os fibroblastos na camada subperitoneal poderia estar implicada não só na fibrose proeminente e ativação, mas também na progressão e metástase do tumor. Decidimos então para isolar fibroblastos da camada subperitoneal que histologicamente correspondeu à invasão peritoneal. Fibroblastos da camada submucosa foram utilizados como controle.

(A) características histológicas de componente estromal da CMPI. Tanto na CMPI eo microambiente do câncer formado por submucosa invasão (CMSI), fibroblastos fusiformes rechonchudas eram as principais fontes de estroma. (B) Marcado expressão α-SMA foi encontrado em fibroblastos. (C) Maior ampliação revelou mais claramente fibroblastos fusiformes gordas. (D) A utilização de software de morfometria, foram detectados com sucesso e analisados ​​expressão-SMA α.

Isolamento e Caracterização de cultivadas SPFs Humanos e SMFs

Na primeira, avaliou-se a morfológica e biológica características de SPFs e SMFs em um estado normal. Ambos SPFs e SMFs humanas cultivadas apresentaram características morfológicas semelhantes fusiformes (Figura S1A-B). SPFs SMF e a partir de 3 pacientes poderiam ser cultivadas ao longo de 10 passagens, excepto para um caso SPF (dados não mostrados). A imunocitoquímica e citometria de fluxo revelou os SPF e SMF obtidos foram consistentes com os fibroblastos (Figura S1C-D). Encontramos fraca expressão α-SMA em poucos SPFs e SMFs. O tempo de duplicação para SPFs e SMFs era de 79,9 horas e 36,3 horas, respectivamente, e o crescimento de SMFs foi mais rápido do que o de SPF (

P Art 0,05), que sugeriu uma diferença biológica entre SPFs e SMFs ( Figura S1E).

gene Expression Profiling comparação entre SPFs e SMFs

Para avaliar as diferenças fenotípicas entre SPFs e SMFs, os perfis de fibroblastos com ou sem estimulação CCCM expressão gênica foram comparados. APC revelou 4 conjuntos distintos, dependendo da sua origem e CCCM estimulação, o que superou a variação individual (Figura 3A e B). análise de agrupamento supervisionado também revelou 4 conjuntos distintos (Figura 3C). Isto indicou a diferença fenotípica em fibroblastos dentro da parede do cólon. E esta diferença depende da localização histoanatomical. Além disso, a reação ao estímulo CCCM também foi diferente.

(A) Red é o perfil de microarray em SMFs com estimulação CCCM, o azul é SMFs sem estimulação CCCM, o verde é SPFs com estimulação CCCM, e prata é SPFs sem estimulação CCCM. Representação tridimensional de análise de componentes principais (PCA) componente 1, 2, e 3. (B) representação bidimensional de componentes PCA 1 e 2 (em cima), e componentes de PCA 1 e 3 (inferior). Os fibroblastos formado aglomerados independentes, dependendo do local de histoanatomical e a presença de estimulação CCCM. (C) análise de agrupamento supervisionado em fibroblastos também revelou agrupamentos distintos dependendo do local histoanatomical e a presença de estimulação CCCM. análise (D) Gene ontologia de genes regulados positivamente em SPFs comparação com SMFs. análise (E) Gene ontologia de genes regulados positivamente em SPFs com estimulação CCCM, em comparação com SMFs com estimulação CCCM. A maioria dos genes com o aumento em expressões SPF foram retidos após a estimulação CCCM; no entanto, houve algumas diferenças, ea ordem de clusters de anotação foram alteradas após a estimulação CCCM.

A seguir, comparação de perfis de expressão gênica nesses fibroblastos com e sem estimulação CCCM, separadamente (Figura 3D-E ). Os dados de SPFs sem estimulação CCCM foram enriquecidos pela ontologia gênica (GO) termos “matriz extracelular” e “matriz extracelular proteica”, que formou conjunto anotação 1. Matriz major expracellular (ECM) componentes de colágenos (COL1A1, COL4A1, COL4A2, COL5A1 e COL16A1), laminina ou fibronectina foram incluídos neste cluster. Além disso, a expressão do gene relacionado com componentes que se ligam ao ECM também foi regulada positivamente em SPFs e formado anotação agrupamento 2. aglomerado anotação 3 foi enriquecida em termos GO associados com “ou” grânulos “vesículas” (Figura 3D e Tabela S3). Este resultado sugeriu que o perfil de expressão do gene associado com a função de base em fibroblastos é diferente entre SPFs SMF e dentro da parede do cólon. Os 20 melhores genes altamente expressos em SPFs também incluiu vários componentes da MEC. Genes associados com fibrog�ese ou a diferenciação miofibroblástica de FLI1 e Nox4 também foram encontrados no top 20 genes (Tabela S4). Entre outros genes altamente expressos em SPFs sem estimulação CCCM, encontramos posn, SPARC, ou COL4A1, que são conhecidos por serem altamente expressa no estroma do cancro; e muitos deles são factores de prognóstico [11], [16], [17]

A maioria dos genes com o aumento em expressões SPFs sem estimulação CCCM também foram retidos na presença de estimulação CCCM.; no entanto, houve algumas diferenças (Figura 3D-E, Tabela S5-6). Na análise GO de SPFs com estimulação CCCM, a ordem dos grupos de anotações foram alteradas em relação ao observado em SPFs sem estimulação CCCM. Entre os 20 melhores genes, 13 genes foram conservados e 7 genes foram substituídos. Estes resultados sugerem uma diferença na reacção entre a estimulação CCCM SPFs e SMF. A existência de genes PESA-específicas que são upregulated após a estimulação CCCM foi estimado.

Em seguida, analisamos esses genes para estabelecer as características biológicas de SPFs após a exposição ao CCCM. Um diagrama de Venn revelou 193 genes regulados positivamente em SPFs e 59 em SMFs após a estimulação CCCM. Destes, 51 eram comumente regulada tanto no SPF e SMFs, 142 foram SPFs específico, e apenas 8 eram SMFs específicas (Figura 4A). então nós também se concentrou em genes reprimidos, e descobriu 215 em SPFs e 146 em SMFs. Destes, 138 foram geralmente regulada negativamente em ambos SPFs e SMF, 77 foram SPFs específico, e apenas 8 foram SMF específica (Figura 4B). Estes resultados sugeriram que SPFs mostrou alteração mais variável na expressão do gene após a estimulação CCCM. GO análise termo de genes específicos SPF-regulada negativamente após estimulação CCCM não revelou qualquer anotação aglomerado sobre a pontuação de 3,0 enriquecimento (dados não mostrados). Em contraste, GO análise termo de genes-PESA específicas upregulated após a estimulação CCCM revelou que termos como “actina vinculativo”, “fibra contrátil” “proteína de ligação do citoesqueleto”, “domínio LIM”, “parte de fibra de contração”, “sarcomere” e “miofibrila” aglomerado formado anotação 1-3 (Figura 4C). A maioria destes genes eram conhecidos por estar relacionado com a contracção celular. Entre os 20 melhores genes eram muitos genes do citoesqueleto ou contratilidade associados. Surpreendentemente, ACTA2 que codifica α-SMA foi regulada especificamente no SPF após a estimulação CCCM (Figura 4D). Este resultado foi confirmado por imunocitoquímica (Figura 4E-F). A análise morfométrica na expressão imunocitoquímica revelou que a expressão α-SMA foi regulada positivamente de forma significativa e especificamente em SPFs após estimulação CCCM no nível de proteína (Figura S2,

P

0,05). upregulation variável e desativação de genes após a estimulação CCCM era uma característica importante no SPF. ACTA2 codificação α-SMA foi incluída neste conjunto de genes upregulated SPFs específicas do. Câncer associado fibroblastos (FAC) incluem miofibroblastos activados α-SMA positivos. Juntamente com o resultado de microarrays de tecido específico da área, marcada expressão α-SMA na CMPI é dependia do carácter sensível do SPF que podem associados com a diferença de microambiente do câncer.

Genes (A) regulada pela estimulação CCCM . (B) Os genes regulados negativamente por estimulação CCCM. (C) Top 3 clusters de anotação na análise de ontologia gênica de genes-PESA específicos regulados positivamente pela estimulação CCCM. (D) Top 20 genes regulados positivamente especificamente no SPF após a estimulação CCCM. (E) imunocitoquímica α-SMA expressão em SMFs após a estimulação CCCM. expressão (F) imunocitoquímica α-SMA na SPFs após a estimulação CCCM. expressão α-SMA foi regulada especificamente no SPF após a estimulação CCCM (ver também figura S2).

SPFs realçar o crescimento do tumor, metástase e Tumor Formação Capacidade mais fortemente do que os SMFs

Para elucidar as diferenças funcionais de fibroblastos na parede do cólon, que injectado linhas celulares de cancro colorrectal humano Caco-2 ou DLD-1 pb, sozinho, ou juntamente com qualquer um ou SPFs SMF, em ratinhos SCID. Aos 7 semanas após a injecção, todos os ratinhos demonstrou a formação de tumores. O crescimento de tumores que surgem de células cancerosas injectadas juntamente com SPFs cresceram mais rapidamente do que o resultante da injecção de células cancerosas sozinho ou co-injecção com SMF (Figura 5A). Os pesos finais dos tumores resultantes de células cancerosas co-injectados com SPFs também foram maiores do que os resultantes da injeção de células de câncer isoladamente ou de co-injecção com SMFs (Figura 5B). Embora a diferença não foi estatisticamente significativa, os tumores resultantes da co-injecção de células DLD-1 com SPFs mais frequentemente resultou em linfonodo metástases do que os que são formados a partir da co-injecção de células DLD-1 com SMF (Figura 5C).

(a, à esquerda) o crescimento do tumor de xenoenxerto em ratos injetados com DLD-1 células cancerosas colorectal humanos sozinho (linha azul, 840.7 ± 112,6 milímetros

3 em sete semanas), co-injectados com DLD-1 células e fibroblastos submucosos (SMFs; linha vermelha, 1178.0 ± 177,6 milímetros

3 em 7 semanas), e co-injectados com células DLD-1 e fibroblastos subperitoneais (PESA; linha verde, 1672.8 ± 214,7 milímetros

3 em 7 semanas). As diferenças de volume de tumor entre as células DLD-1 sozinho e células DLD-1 com SPF, e entre as células DLD-1 sozinho e células DLD-1 com SMFs foram estatisticamente significativas (

P Art 0,05). (A, direita) crescimento do tumor xenoenxerto em ratos injetados com Caco-2 células de câncer colorretal humano sozinho (linha azul, 308,6 ± 127,7 milímetros

3 em 9 semanas), co-injectados com Caco 2-células e SMFs (linha vermelha , 1363.1 ± 284,3 milímetros

3 em 9 semanas), e co-injectados com Caco-2 e SPF (linha verde, 2595.1 ± 349,5 milímetros

3 em 9 semanas). As diferenças de volume do tumor entre Caco-2 células sozinho e células Caco-2 com SPF (

P Art 0,01), e entre Caco 2-células com SMFs e células Caco-2 com SPF (

P

0,05) foram estatisticamente significativas. tumores de xenoenxerto derivados de co-injecção de células cancerosas e SPFs cresceram mais rapidamente do que aqueles derivados a partir da injecção das células cancerosas sozinha, ou a co-injecção de células cancerosas e SMF. (B, esquerda) o peso do tumor de xenoenxerto em ratinhos injectados com células DLD-1 por si só foi de 0,71 ± 0,11 g, co-injectados com células DLD-1 e SMF foi de 1,27 ± 0,19 g, e co-injectados com DLD-1 células e SPFs era 1,82 ± 0,28 g em 8 semanas. As diferenças de peso do tumor entre as células DLD-1 células sozinho e DLD-1 com SPF (

P Art 0,01), e entre DLD-1 células sozinhas e células DLD-1 com SMFs (

P

0,05) foram estatisticamente significativas. (B, direita) Xenoenxerto peso do tumor em ratinhos injectados com células Caco-2 sozinho foi de 0,53 ± 0,24 g, co-injectados com células Caco-2 e SMF foi 1,91 ± 0,34 g, e co-injectados com Caco 2-células e SPFs era 3,66 ± 0,45 g em 10 semanas. As diferenças de peso do tumor entre as células DLD-1 células sozinha e DLD-1 com SPFs (

P

0,01), entre DLD-1 sozinho e células células DLD-1 com SMF (

P

0,05), e DLD-1 entre células com SPFs e células DLD-1 com SMF (

P

0,05) foram estatisticamente significativas. Os pesos de tumores de xenoenxerto de derivados de co-injecção de células cancerosas com SPFs foram maiores do que os dos tumores derivados da injecção de células cancerosas sozinho, ou a co-injecção de células cancerosas e SMF (esquerda: DLD-1, direita: Caco-2) . (C) Embora o valor não atingiu significância estatística, tumores de xenoenxerto derivados de co-injeção de DLD-1 células e SPFs mostrou o dobro da frequência de metástase ganglionar (n = 4) em comparação com os decorrentes de co-injeção de DLD- 1 e células SMF (n = 2).