Abstract

O nosso estudo anterior mostrou que mesothelin (MSLN) é um alvo potencial imunoterapêutico para câncer de pâncreas. Aqui, nós estudamos ainda mais a imunogenicidade de murino quimérico partículas-MSLN-vírus como (mMSLN-VLP), a sua capacidade para quebrar a tolerância ao mMSLN, um auto-antigénio, e decifrado o mecanismo de respostas imunitárias induzidas por imunização mMSLN-VLP utilizando um câncer (PC) modelo de pâncreas mouse. Além de que nós encontramos com xenog�ico humana MSLN-VLP (hMSLN-VLP), mMSLN-VLP imunização foi capaz de quebrar a tolerância ao MSLN intrínseca e montagem específicas de mMSLN, citotóxico CD8

+ células T que levou a uma redução significativa no volume do tumor e sobrevivência prolongada em um modelo de camundongo ortotópico PC. Além disso, CD4

+ Foxp3

+ células T reguladoras (Tregs) foram progressivamente diminuiu em ambos os baço e tumorais tecidos após a imunização mMSLN-VLP e esta foi, pelo menos, em parte devido aos níveis elevados de produção de IL-6 de plasmocitóides activada células dendríticas (pDC) -como células após mMSLN-VLP imunização. Além disso, o tratamento mMSLN-VLP reduzida, principalmente, a frequência do CD4

+ Foxp3

+ ICOS

– Treg subconjunto. No entanto, mMSLN-VLP induziu a produção de IL-6 também aumentou a expressão ICOSL em células PDC-como que apoiaram a proliferação de imunossupressora CD4

+ Foxp3

+ ICOS

+ células Treg. Este estudo revela que mMSLN-VLP de imunização é capaz de controlar a progressão do PC através da montagem de forma eficaz uma resposta imune contra mMSLN, um tumor auto-antigénio, e alterar o microambiente do tumor imunossupressor através da activação de células pdCs-like e redução na frequência de células CD4

+ Foxp3

+ ICOS

– células Treg. No entanto, terapias de combinação, provavelmente, precisam ser usados ​​a fim de orientar residual CD4

+ Foxp3

+ ICOS

+ células Treg

Citation:. Zhang S, Yong LK, Li D, Cubas R, Chen C, Yao Q (2013) mesothelin partícula semelhante a vírus Imunização controla o crescimento do cancro do pâncreas através de CD8

+ T indução celular e redução na frequência de células CD4

+ Foxp3

+ ICOS

– As células T reguladoras. PLoS ONE 8 (7): e68303. doi: 10.1371 /journal.pone.0068303

editor: Hiroshi Shiku, Mie University Graduate School of Medicine, Japão

Recebido: 11 de julho de 2012; Aceito: 04 de junho de 2013; Publicação: 09 de julho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Zhang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte por Dan L Cancer Center Duncan subvenção piloto do BCM e do National Institutes of Health CA140828 subvenção para Q. Yao e AI053831 para S. Zhang. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Sem financiamento externo adicional recebida para este estudo

Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O câncer de pâncreas continua a ser uma doença devastadora, altamente letal. mesmo com os avanços científicos atuais. Esta doença representa um enorme desafio para os médicos e cientistas, porque é naturalmente resistente a várias formas de tratamentos [1]. Portanto, há uma necessidade urgente de desenvolver novas terapias para o câncer de pâncreas. Entre as mais recentes abordagens terapêuticas, vacinas contra o câncer têm mostrado alguns resultados promissores para o controle da doença [2]. Muitos foram relatados para ser promissor na indução

in vivo

tumor regressão [XPATH ERROR:. Desconhecido variável “start2”], [4]. No entanto, o mecanismo de como vacinas tumorais pode controlar com sucesso a progressão do tumor ainda é incerto.

de linfócitos T citotóxicos específicos de tumor (CTL) de indução tem sido demonstrado ser essencial para a erradicação de células cancerosas por anti-tumoral eficaz 5,6 vacinas uma vez que os CTL podem ser específicos para um determinado antigénio expresso por células tumorais. Além disso, o papel das células T reguladoras (Tregs) na imunidade anti-tumoral tem sido grandemente estudada e elucidada [7]. células Treg identificados como CD4

+ CD25

+ Foxp3

+ representam a principal população de linfócitos inibitória [8], [9]. A remoção de células por Treg

In vivo

administração de um anticorpo anti-CD25 tem sido demonstrado que a supressão imune revogam, limitar o crescimento tumoral e promover a rejeição de tumor em ratos [10]. A molécula co-estimuladora ICOS é uma das proteínas reguladoras expressas em células CD4

+ CD25

+ Foxp3

+ Tregs [11]. A expansão de Tregs pode ser ligada a sinalização de ICOS, o que também participa no desenvolvimento de Tregs específicas de antigénio [12]. Um relatório recente mostrou que Foxp3

+ Tregs tem dois subconjuntos distintos, com funções biológicas diferentes com base na expressão de ICOS. Um destes subconjuntos, CD4

+ Foxp3

+ ICOS

+ Tregs, segrega IL-10 e TGF-β que suprime células dendríticas (DC) e células T CD4

+ T auxiliares. O outro subconjunto, CD4

+ Foxp3

+ ICOS

– Tregs, só produzem TGF-β [13]. Um estudo mostrou também que Tregs murino contêm subconjuntos hiperproliferativas e morte propensas com expressão ICOS diferencial [14]. No entanto, a resposta destes dois subconjuntos Treg para vacinação imunoterapêutico do tumor não foi investigada.

A indução e geração de Foxp3

+ Tregs está associada com a função DC [15]. Embora ambos os DCs convencionais (CDCs, mielóide DC) e DCs plasmocitóides (PDCs) podem interagir com Foxp3

+ células Treg, única pDCs são relatados para ter uma capacidade de primeiro-CD4

+ Foxp3

+ ICOS

+ Tregs [13]. pDCs são conhecidos como um subconjunto DC primária em respostas imunes anti-virais [16]. Após a activação e maturação, que segregam elevados níveis de interferões do tipo I que activam outras células imunitárias inatas como células CDC e NK e células imunitárias adaptativas ponte, como as células T e células B [17]. pDCs não só tem a capacidade de apresentar epítopos de MHC-II, a fim de ativar CD4

+ células T, mas também pode cross-presentes epítopos MHC-I para expandir CD8 células

+ T [18]. A indução de CD4

+ Foxp3

+ ICOS

+ Tregs por pDCs, mas não CDC, é acoplado a expressão do ligando ICOS em pDCs [13].

A eficácia do câncer abordagens de imunoterapia baseia-se fortemente na imunogenicidade do antigénio associado ao tumor alvo. Mesothelin (MSLN), é uma glicoproteína de membrana, normalmente expresso em células mesoteliais, mas é sobre-expresso em cancros mais pancreáticas [19] – [21]. O nível reduzido de expressão em células normais MSLN o torna um alvo terapêutico apropriado para vacinas contra o cancro [22]. Entre as várias abordagens de vacina que transportam e apresentam antigénios tumorais para o hospedeiro, as partículas semelhantes a vírus (VLPs) podem ser a mais adequada para a indução de respostas imunes humoral e celular. Como um análogo de vírus, partículas VLP quiméricas podem ser considerados vírus incompetentes, que têm a estrutura completa do vírus e componentes proteicos virais para estimular fortes respostas celulares sem ácidos nucleicos virais. As VLPs podem induzir imunidade preventiva ou terapêutica não apenas contra a infecção pelo vírus relacionado com o tumor que pode levar a tumorigénese [23], [24], mas que também podem inibir o crescimento tumoral por antigénios associados a tumores que visam especificamente [25]. Nós temos mostrado previamente que quiméricos hMSLN-VLP pode efetivamente diminuir o crescimento do tumor através de uma redução na freqüência de CD4

+ Foxp3

+ Tregs em um modelo do rato do cancro pancreático ortotópico [21]. Neste estudo, foram ainda avaliadas mMSLN se auto-antigénio incorporadas em VLP pode quebrar a tolerância ao mMSLN, montar respostas imunitárias adaptativas e controlar a progressão do tumor. Para entender melhor o mecanismo de ação pelo qual a imunização VLP pode alcançar a regressão do tumor, nós também explorado propriedades de indução DC por mMSLN-VLP e citocinas envolvidas na supressão de CD4

+ Foxp3

+ células Treg.

resultados

Crescimento Cancer

mMSLN-VLP imunização Inibe pâncreas e promove a sobrevivência em ratos portadores de tumores

no nosso relatório anterior, foi demonstrado que a imunização com humano MSLN-VLP podem efetivamente controlar tumor crescimento em um modelo de ratinho que levou ao aumento de respostas imunitárias citotóxicas contra células de cancro do pâncreas através de uma redução da frequência de células Treg [21]. Desde humana e MSLN rato tem apenas cerca de 60% de homologia, o forte resposta imune pode resultar de uma resposta xenogénica ao MSLN humano. No entanto, se a imunização com mMSLN-VLP pode quebrar a tolerância e induzir respostas imunitárias a mMSLN, um auto-antigénio, no contexto de uma apresentação de VLP, e se mMSLN-VLP tem um efeito semelhante na indução de uma resposta anti-tumor, através da modulação Tregs não tem sido explorado. Para avaliar a eficácia da imunização imunoterapêutico mMSLN-VLP, os animais foram imunizados com mMSLN-VLP ou a SIV VLP como um controlo para a VLP “espinha dorsal” ou PBS em ratinhos portadores de tumor. Como mostrado na Fig. 1A, mMSLN-VLP imunização de volume reduzido significativamente tumor (0,92 ± 0,39) em comparação com os dois grupos de controle (2,49 ± 0,43 no SIV-VLP e 3,18 ± 0,38 no grupo controle PBS) (

p Art 0,05) . Não houve diferença estatística na carga tumoral entre o PBS e grupos de imunização SIV-VLP. Além disso, verificou-se que todos os ratinhos tratados com PBS ou SIV-VLP tinham 1 ml a 4 ml de ascites ou ensanguentadas ascite na cavidade abdominal. Houve menos fluido ( 1 ml) no grupo vacinado mMSLN-VLP. Além disso, como mostrado na Fig. 1B, com SIV-VLP imunização, houve uma sobrevida ligeiramente prolongada ainda não estatisticamente significativo quando comparado ao grupo controle PBS (

p

= 0,1947). Pelo contrário, a imunização mMSLN-VLP prolongou significativamente a sobrevivência de ratinhos portadores de tumor quando comparados com os grupos de PBS e SIV-VLP (

p = 0,0012 e

P

= 0,0198, respectivamente) . Além disso, mais do que 50% dos ratinhos imunizados mMSLN-VLP ainda estavam vivos no dia 30.

Panc02 células (7 × 10

5) foram implantadas ortotopicamente na pâncreas de 8-semanas de idade C57BL /6 ratinhos no dia 0. Três imunizações nos dias 3, 13, e 21 foram aplicadas por IP rota com diferentes VLP. Os ratinhos foram divididos em três grupos que imunizados com 100 ul de PBS, ou 100 ug /100 ul da SIV-VLP, ou 100 ug /100 ul de MSLN-VLP. UMA). carga de tumor reduzida em mMSLN-VLP grupos imunizados. O tamanho do tumor entre cada grupo foi estatisticamente comparadas pelo teste t de Student. *

p Art 0,05. B). sobrevivência prolongada de mMSLN-VLP imunizados grupos de ratos Kaplan-Meier Análise de Sobrevivência.

valores

P foram calculados e listada na figura. Estes foram dados representativos selecionados a partir de quatro experimentos independentes com: a) cinco ou B), pelo menos, 9 ratos por grupo.

mMSLN-VLP Imunização Activa CD8

+ células T e gera MSLN-Specific Funcional As células CD8

+ T

Nossos relatórios anteriores mostraram que as VLP têm uma elevada capacidade para activar respostas imunes celulares orientados Th1 e gerar linfócitos T citotóxicos específicos em camundongos vacinados [26], [27]. Como mostrado na Fig. 2A, houve um aumento na frequência de CD8

+ CD62L

– células T após o tratamento mMSLN-VLP (46,5% vs. 19,6% em PBS), sugerindo que mMSLN-VLP pode estimular geral CD8

+ activação de células T.

17

° dia após a implantação do tumor e após a vacinação de VLP uma vez no dia 3, os ratinhos foram sacrificados para análise da resposta imunitária. FACSCalibur foi usada para adquirir e software FlowJo foi usado para analisar os dados. UMA). Geral CD8

+ activação das células T no grupo de controlo de PBS e as VLPs imunizados grupos de ratos. As células foram fechado em células CD8

+ T, a activação de células T a expressão do marcador CD62L foram mostrados no histograma. B). tetrâmero MSLN específicos de

+ CD8

+ T células de indução. Os esplenócitos foram coradas com PE marcado tetrâmero específicos de MSLN. C). MSLN específicos de IFN-γ produzir CD8

+ indução de células T. Os esplenócitos foram re-estimuladas com péptido MSLN durante 6 h na presença do composto de bloqueio de Golgi

In vitro

. Após a fixação e permeabilização, os esplenócitos pré-tratadas foram coradas por PE anticorpo marcado com anti-IFN γ. D). indução MSLN específicos de CTL contra células Panc02. As células de baço foram re-estimuladas

In vitro

durante 6 dias na presença de IL-2. Os esplenócitos pré-tratadas foram contadas e usadas como células efectoras. Panc células 02 foram usadas como células alvo. células efectoras e células alvo foram misturados com vários razão E: T e incubou-se durante 4 h. foi calculada a percentagem de lise como:% de citotoxicidade = [(Experimental – effecter espontânea – Alvo espontânea) /(Target máxima – Target espontânea)] × 100. Mostrado foram dados representativos selecionados a partir de dois experimentos independentes com cinco ratos por grupo. (Significados estatisticamente são mostrados, * indica

p Art 0,05).

Para avaliar a geração de mMSLN específicas de CD8

+ T células em esplenócitos murinos após a imunização. , um MHC-I: tetrâmero MSLN péptido foi usado para determinar a percentagem de mMSLN-specific CD8

+ células T. Como mostrado na Fig. 2B, a percentagem de

+ células T CD8 + do tetrero em grupos imunizados mMSLN-VLP foi de aproximadamente 3-pregas mais elevado do que no grupo de controlo de PBS (3,21% contra 1,18%). SIV-VLP imunização não nomeadamente aumentar a frequência de

+ células específicas-mMSLN CD8 T (1,35%). Portanto, mMSLN-VLP imunização pode induzir + células específicas-mMSLN CD8

T

efectoras activadas CD8

+ células T podem ser divididos em dois grupos diferentes:. Citocina secretoras CD8

+ T células e linfócitos T citotóxicos [28]. Após a estimulação de péptidos específicos do MSLN, MSLN-specific CD8

+ células T que segregam IFN-γ foram detectadas por coloração de citocinas intracelulares. Como representado na Fig. 2C, a percentagem de MSLN-específico que segregam IFN-γ efectora CD8

+ células T no grupo imunizado mMSLN-VLP foi aproximadamente 2 dobras maiores do que no grupo de PBS (2,55% contra 1,42%). No entanto, não houve aumento na frequência destas células a seguir à imunização com SIV VLP (1,77%). Para avaliar a capacidade de CTL induzidos por VLP para matar directamente células tumorais, um

In vitro

ensaio de morte tumoral foi efectuada utilizando células Panc02 como células-alvo que foi mostrado para sobre-expressar MSLN [21]. Como mostrado na Fig. 2D, a eficiência citolítica de CTL para Panc02 células também mostrou ser a mais alta nos grupos de vacinados mMSLN-VLP numa proporção de 120:1. Estes resultados sugerem que

+ células efetoras específicas CD8 T induzidas por imunização mMSLN-VLP podem desempenhar um papel importante no controle diretamente a regressão do tumor.

mMSLN-VLP Imunização suprime tanto sistêmica e infiltrado no tumor CD3e

+ CD4

+ Foxp3

+ Tregs

Embora tenhamos mostrado que a imunização VLP pode reduzir o número de CD4

+ Foxp3

+ células Tregs no baço murino e em tumor tecido, o fenótipo e a biologia destas células ainda remainslargely desconhecido [21]. Como mostrado na Fig. 3, quase todo o Foxp3

+ células em camundongos portadores de tumor estavam presentes no CD3e

+ CD4

+ T população de células desde CD3e

+ CD8a

+ Foxp3

+ e CD3e

+ CD4

-CD8a

-foxp3

+ subconjuntos estavam abaixo de 0,5%. A percentagem de CD3e

+ CD4

+ Foxp3

+ Tregs após imunização mMSLN-VLP (12,9 ± 1,83%) foi mais baixa do que no grupo de PBS de controlo (17,81 ± 1,26%) (P 0,05). SIV-VLP imunização também levou a um decréscimo na população de Tregs, ainda que, para uma extensão menor (14,4 ± 2,19%) (P 0,05). Portanto, o Foxp3 diminuiu

+ células em camundongos portadores de tumor pertencia ao CD3e convencional

+ CD4

+ Foxp3 grupo

+ de células Treg, uma vez que as VLP não induziu ou afetar CD4

– Foxp3

+ células Treg no baço murino. Portanto, VLP imunização pode reduzir a população sistémica de CD3e

+ CD4

+ Foxp3

+ Tregs em camundongos portadores de tumor.

A). Aos 12

° dia após a implantação do tumor e após a vacinação de VLP uma vez no dia 3, os ratinhos foram sacrificados para análise da resposta imunitária. Cerca de 10

6 esplenócitos foram incubados com os anticorpos fluorescentes conjugado apropriadamente diluído incluindo CD3e, CD4, CD8, e Foxp3. Foxp3

+ células foram analisados ​​em três subgrupos de células T: CD4

+ CD8

-, CD4

-CD8

+ e CD4

-CD8

-. Estes foram dados representativos de três experiências independentes com, pelo menos, três murganhos por grupo. B). CD4

+ células T Foxp3

+ isoladas de esplenócitos portadores de tumor suprimido Tresp a proliferação das células. Co-cultura de CD4

+ CD25

+ Tregs e CD4

+ CD25

– Tresps (CFSE manchada) em diferentes proporções 1:8, 1:4 e 1:2. CFSE marcado Tresps proliferação foi analisada por FACS. Números sobre o CFSE

pico elevado indicam por cento das células não divididas. C). A atividade supressora de CD4

+ CD25

+ Tregs em CD4

+ CD25

– a proliferação de células Tresp em diferentes Treg: rácios Tresps (eixo-x). Eixo Y indica a percentagem de supressão da actividade de proliferação de células Tresp.

Para demonstrar que células CD4

+ Foxp3

+ células T isoladas a partir de esplenócitos de murganhos portadores de tumores possuem actividade supressora, nós realizado um ensaio de supressão de Treg baseado no CFSE. Para a obtenção de células vivas para este ensaio de co-cultura de 5 dias, usamos marcadores CD4 e de superfície CD25 para isolar CD4

+ CD25

+ Tregs. Foi realizada coloração intracelular do marcador Foxp3 para confirmar que a maioria dos isolados CD4

+ CD25

+ Tregs foram também CD4

+ Foxp3

células + T. Como demonstrado na Fig. S1, com delimitação de CD4

+ CD25

+ células, cerca de 87% das células coradas positivo para Foxp3

+. O ensaio de supressão Treg baseada CFSE foi realizada por co-cultura de células CD4

+ CD25

+ Tregs e CD4

+ CD25

– respondedor células T (Tresps) (CFSE manchada) isolado dos baços de PC ratinhos portadores de tumor. Como mostrado na Fig. 3B, quando não há células Treg foram adicionados, a maioria das células foi submetido Tresp proliferação e apenas 36,5% permaneceu indivisa. À medida que a proporção de células T reguladoras para células Tresp aumento na co-cultura, observou-se a supressão da proliferação de células Tresp. A percentagem de células não divididas Tresp aumentou de 36.5% (sem Treg adicionado) para 50,7%, 62,2%, e 84,5% em Treg: Tresp proporções de 1:08, 1:04, e 1:02, respectivamente. Como representado na Fig. 3C, a actividade supressora de células CD4

+ CD25

+ Tregs em CD4

+ CD25

– a proliferação de células Tresp foi de 22%, quando 12,5% Tregs estavam presentes na co-cultura, e aumentou a 40% e 76%, quando 25% e 50% de Tregs estavam presentes, respectivamente. Estes dados apoia fortemente a noção de que CD4

+ Foxp3

células + T em esplenócitos portadores de tumor possuem actividade supressora.

Para determinar o fenótipo de Foxp3

+ Tregs em tecidos tumorais, imunofluorescência coloração foi realizada. Em tecidos de tumor de ratinhos que não receberam VLP mMSLN-imunização, verificou-se que a maioria dos Foxp3

+ Tregs foram infiltradas no tecido do tumor a partir dos vasos sanguíneos e localizado perto da vasculatura do tumor (Fig. S2A). Além disso Foxp3

+ Tregs no tecido tumoral foram do fenótipo CD4

+ CD8a

–

+ células T (Fig. S2B), e uma grande parcela de CD8a (células marcadas verde) foram localizados ao lado de Foxp3

células + T (glóbulos vermelhos manchado) (Fig. S2C). Comparando o número de Foxp3

+ número de células entre os grupos imunizados e não imunizados, Foxp3

+ células são reduzidos em tecidos tumorais imunizado-VLP (Fig. S2D). Esta observação implica que Foxp3

+ Tregs pode contar com interação direta com

+ células CD8a T para exercer o seu efeito supressor sobre CD8 função

+ T anti-tumor de células no grupo do mouse não-imunizados, ao passo que, VLP imunização reduz o Foxp3

+ população Treg e, assim, a supressão exercida por Foxp3

+ Tregs no tecido tumoral pode ser aliviado.

elevados níveis de indução de IL-6 por mMSLN-VLP é parcialmente responsável pela Treg Down-regulação

IL-6 foi relatado para inibir Foxp3 natural que ocorre

+ Tregs. Para avaliar se mMSLN-VLP imunização poderia induzir a produção de IL-6, foram utilizados dois esplenócitos e células JAWSII para a estimulação

in vitro

com mMSLN-VLP. Como mostrado na Fig. 4A, houve um aumento significativo nos níveis de IL-6 que segregam DCs no grupo mMSLN-VLP tratado, em comparação com o grupo de controlo de PBS (22,8% contra 3,21%). Além disso, o reforço da secreção de IL-6 a partir de esplenócitos de murinos também foi detectada mediante a estimulação mMSLN-VLP. Houve um aumento de 100 vezes nos níveis de IL-6 a partir de esplenócitos secretadas no grupo mMSLN-VLP tratados quando comparados com o grupo de controlo de PBS. Isto sugere que mMSLN-VLP tem a capacidade de estimular os linfócitos, especialmente DCs, e induzem a sua secreção de níveis elevados de IL-6.

A). O aumento da produção de IL-6 de células JAWSII e níveis elevados de IL-6 no meio de cultura de linfócitos após tratamento mMSLN-VLP. As células foram estimuladas com JAWSII MSLN-VLP (5 ug /ml) durante 12 h e intracelular de IL-6 de coloração foi realizada. Os linfócitos do baço foram preparadas a partir de ratinhos B6 naive. Após incubação com MSLN-VLP durante 24 h, o sobrenadante foi recolhido para determinar as concentrações de IL-6 pela Bio-Plex. B). salvamento parcial do efeito supressivo da estimulação mMSLN-VLP sobre Foxp3

+ Treg células por IL-6 de neutralização. MSLN-VLP com ou sem IL-6 Ab neutralizante ou Ab de controlo de isotipo foram adicionados a cultura de linfócitos durante 3 dias. O Foxp3

+ células foram coradas usando kit de coloração intracelular Foxp3. Os dados foram adquiridos por citometria de fluxo com delimitação de CD3

+ e CD4

células + T. Mostrado foram dados representativos de três a cinco experimentos independentes. (Significados estatisticamente são mostrados, ** indicam

p

. 0,01).

Para abordar se a redução Foxp3

+ Tregs por tratamento mMSLN-VLP foi mediada por IL-6, foi aplicado anticorpo neutralizante de IL-6 durante a estimulação de VLP e um anticorpo de controlo de isotipo foi utilizado como um controlo. Como mostrado na Fig. 4B, a percentagem de Foxp3

+ Tregs foi de 12,7% em CD3

+ CD4

+ células fechadas a partir de ratinhos B6 ingênuos frescos após 3 dias de incubação. No entanto, a percentagem de Foxp3

+ Tregs foi reduzido por tratamento mMSLN-VLP com ou sem anticorpo de controlo de isotipo (6,51% e 6,18%). Por conseguinte, o anticorpo neutralizante de IL-6 foi capaz de resgatar parcialmente a redução da frequência de Foxp3

+ Treg células por cerca de 32% (8,16% em comparação com 6,18% em mMSLN-VLP único tratamento). Estes dados indicam que a IL-6 pode desempenhar um papel na redução de Foxp3

+ Tregs por imunização mMSLN-VLP.

mMSLN-VLP de imunização pode suprimir selectivamente um subconjunto de células CD4

+ Foxp3

+ ICOS

– Tregs

moléculas funcionais, tais como CTLA-4, CD25 e CD44 expresso sobre a superfície de Foxp3

+ Tregs são essenciais em ditar a direcção, função e sobrevivência capacidade destas células. Para aprofundar como VLP afetar Foxp3

+ Treg biologia, várias moléculas funcionais importantes foram coradas. Comparado com o grupo PBS, não houve diferenças óbvias nas frequências de CD4

+ Foxp3

+ CTLA-4

+ Tregs (Fig. 5A), CD4

+ Foxp3

+ CD25

+ Tregs (Fig. 5B), CD4

+ Foxp3

+ CD44

oi Tregs (Fig. 5C) após a imunização VLP. A molécula inibidora de DP-1 e com a molécula co-estimuladora CD40L tinha um nível de expressão baixo em Foxp3

+ Tregs (Fig. 5D). A percentagem e IFM para CD4

+ Foxp3

+ PD-1

+ e CD4

+ Foxp3

+ CD40L

+ Tregs nos grupos VLP foram muito semelhantes a esses valores em o grupo de controlo de PBS. No entanto, em comparação com os tratamentos PBS (35,7%), a percentagem de CD4

+ Foxp3

+ ICOS

+ Tregs em grupos VLP tratado foi aumentado. O maior percentual de CD4

+ Foxp3

+ ICOS

+ Treg subconjunto foi observada após mMSLN-VLP imunização (59,8%). A percentagem dos ratos tratados com SIV VLP foi de 54,0% (Fig. 5F). Ao correlacionar os dados acima para a diminuição do número absoluto de Foxp3

+ células e o aumento da percentagem de ICOS

+ células na Foxp3

+ grupo Treg, estes dados sugerem que a redução na Foxp3

+ Tregs corresponde à população de CD4

+ Foxp3

+ ICOS

– Tregs mas não para o CD4

+ Foxp3

+ ICOS

+ Tregs. ICOS pode, por conseguinte, desempenham um papel crucial na função supressora de tumor exercida por Tregs em ratinhos portadores de tumor. Estes resultados sugerem que, embora mMSLN-VLP vacinação pode reduzir a frequência global de células Treg estes são principalmente do CD4

+ Foxp3

+ ICOS

– subconjunto de células Treg, mas essas Tregs pertencentes ao CD4

+ Foxp3

+ ICOS

+ subconjunto parecem ser mantida.

aos 12

º dia após a implantação do tumor e após a vacinação VLP uma vez no dia 3, os ratos foram sacrificados para imunológico análise da resposta. Cerca de 10

6 esplenócitos foram incubados com os anticorpos fluorescentes conjugado apropriadamente diluídas, incluindo CD4, Foxp3, CTLA-4, CD25, CD44, PD-1, CD40L, e ICOS. FACSCalibur foi usada para adquirir e software FlowJo foi usado para analisar os dados. As células foram delimitação de CD4

+ Foxp3

+ população e histograma de diferente expressão de moléculas em diferentes grupos experimentais foram apresentados em A). CTLA-4; B). CD25; C). CD44; D). PD-1; E). CD40L; F). ICOS. Mostrado foram dados representativos de três experiências com, pelo menos, três murganhos por grupo. (Significados estatisticamente são mostrados, ** indicam

p

. 0,01).

Para determinar a presença de ambos os subconjuntos de células Treg em pacientes com câncer pancreático, amostras de tecidos foram analisados ​​por imunofluorescência. Como mostrado na Fig. S3A, houve uma alta densidade de CD3

+ Foxp3

+ Tregs em tecidos tumorais pancreáticas e mais da metade dessas Foxp3

+ Tregs foram ICOS

+ (Fig. S3B). Estes dados sugerem que Foxp3

+ Tregs desempenhar um papel importante na patogênese do câncer de pâncreas, e ambos Foxp3

+ ICOS

+ e Foxp3

+ ICOS

– subpopulações Tregs estão envolvidos em imunológico supressão em tecidos tumorais.

mMSLN-VLP Tratamento Ativa pDCs e regula positivamente ICOSL sobre pDCs através de IL-6 para manter CD4

+ Foxp3

+ ICOS

+ células Treg mas não CD4

+ Foxp3

+ ICOS

– as células Treg

relatórios anteriores mostraram que pDCs expressar alto nível de ICOSL, ea interação entre ICOS e ICOSL é importante para a homeostase de CD4

+ Foxp3

+ ICOS

+ células Treg [13], [29]. Desde mMSLN-VLP imunização afeta a frequência de CD4

+ Foxp3

+ ICOS

– células Treg, mas não CD4

+ Foxp3

+ ICOS

+ células Treg, um dos possíveis explicações para esta manutenção preferencial de CD4

+ Foxp3

+ ICOS

+ células Treg pode ser devido a mMSLN-VLP regulação positiva mediada de ICOSL em pDCs. Para estudar se mMSLN-VLP pode activar pDCs, uma linha celular de rato DC, JAWSII, foi usado. LPS foi utilizada como um controlo para a estimulação DC. Como mostrado na Fig. 6A, a estimulação com LPS aumentou significativamente a expressão de CD11b em comparação com o tratamento com PBS (84,6% versus 28,0%). No entanto, diminuiu mMSLN-VLP em grande parte, a expressão de CD11b (9,14%). Em contraste, a expressão de B220 e Gr-1 foi significativamente regulada para cima a seguir ao tratamento mMSLN-VLP (95,5% e 86,4%). B220 e Gr-1, foram identificados como marcadores primários de pDCs. Houve apenas baixos níveis de B220 e Gr-1 e expressão seguinte PBS LPS tratamentos (10,3% e 10,4% em PBS, 19,7% e 17,5% em tratamento com LPS). Estes dados indicam que mMSLN-VLP pode promover células-pDCs como LPS, enquanto tem uma preferência por activação de células CDC-like.

Cerca de 10

7 JAWSII células foram estimuladas quer com PBS, LPS (1 ug /ml), ou MSLN-VLP (5 ug /ml) em meio alfa completo com 5 ng /ml de rmGM-CSF. Após 24 h de incubação, marcadores de superfície celular foram coradas e adquiridas por FACSCalibur. UMA). Expressão de CD11b, B220, e Gr-1 mediante um tratamento diferente dos PBS, LPS, ou mMSLN-VLP em células JAWSII. B). Expressão de ICOSL em PBS, mMSLN-VLP ou IL-6 induzida pDCs. C). Expressão de ICOS em CD4

+ Foxp3

+ Tregs. D). Percentagem de Ki-67 células de coloração, tanto CD4

+ Foxp3

+ ICOS

+ Tregs e CD4

+ Foxp3

+ ICOS

– Tregs. Múltiplos marcadores de superfície celular foram manchas e análise de fenótipos subpopulação foi feito utilizando o software FACSCalibur e FlowJo. Mostrado foram dados representativos de três a seis experimentos independentes. (Significados estatisticamente são mostrados, ** indicam

p

. 0,01).

Para determinar se as células mMSLN-VLP activada pDCs-like expressa elevada ICOSL, ou se mMSLN- VLP induzida por IL-6 pode regular positivamente ICOSL em pDCs, PBS, mMSLN-VLP (10 ug /ml) ou IL-6 (20 ng /ml) foram usadas para estimular esplenócitos e mancha para ICOSL superfície em pDCs fechado. Como mostrado na Fig. 6B, a percentagem de células que expressam ICOSL em pDCs activados mMSLN-VLP ou a IL-6 pDCs activadas foram de 12,4% e 12,3%, respectivamente, que foram significativamente aumentados em comparação com PBS DCs activadas (4,95%). Estes dados sugerem que as células mMSLN-VLP ou a IL-6 activado pDCs-se como expressam altos níveis de ICOSL.

têm mostrado que a vacinação mMSLN-VLP induziu níveis elevados de produção de IL-6, que é parcialmente responsável pela a redução da frequência de células Treg, mas o efeito de IL-6 tem na CD4

+ Foxp3

+ ICOS

+ Tregs subpopulação ainda precisa ser determinado. Nós, portanto, avaliar se mMSLN-VLP ou IL-6 também pode reduzir total de CD4

+ Foxp3

+ Tregs, mantendo uma elevada percentagem de CD4

+ Foxp3

+ ICOS

+ Tregs

in vitro

. esplenócitos de rato foram estimuladas com PBS, mMSLN-VLP (10 ug /mL), ou IL-6 (20 ng /ml). Embora fez observar significativa CD4

+ Foxp3

+ Treg downregulation tanto no IL-6 grupos de tratamento mMSLN-VLP e, curiosamente, observamos que a IL-6 teve um efeito semelhante como tratamento mMSLN-VLP que também levou a um aumento da frequência de CD4

+ Foxp3

+ ICOS

+ células Tregs (Fig. 6C). Para examinar ainda mais a propriedade desta subpopulação de células Treg e para determinar se a expressão ICOS está relacionada com a proliferação das células CD4

+ Foxp3

+ ICOS

+ Treg subpopulação, Ki-67 foi utilizado para determinar o ciclo das células. Como mostrado na Fig. 6D, encontramos uma proporção significativa de células positivas Ki-67 dentro do ICOS

+ Tregs vs. ICOS- Tregs (47,8 ± 8,4% vs 12,3 ± 3,8%, p 0,001). Isto indica que, embora mMSLN-VLP induzida por IL-6 reduz a frequência total de células T reguladoras também podem ser responsáveis ​​pelo aumento da proporção do restante CD4

+ Foxp3

+ ICOS

+ Treg subconjunto através de proliferação melhorada de ICOS

+ células apresentando uma faca de dois gumes.

Discussão

O rápido desenvolvimento de vacinas contra o câncer fornece uma grande promessa para a prevenção e terapêutica tumor [4]. Ao contrário de outras terapias tumorais, as vacinas têm muitas vantagens, tais como o desenvolvimento de uma resposta de memória, direccionamento específico das células cancerosas e menos efeitos secundários, entre outros. Neste estudo, foi demonstrado que mMSLN-VLP de imunização pode quebrar a tolerância para auto mMSLN e montar uma resposta imunitária forte contra mMSLN, e, portanto, de forma eficaz a reduzir o tamanho do tumor e, nomeadamente, prolongar a sobrevivência de ratinhos portadores de tumor em um modelo de cancro pancreático ortotópico . MSLN-CD8 específicas,

+ células T pode ser induzida por tratamento eficaz mMSLN-VLP e foram encontrados para contribuir para a supressão do crescimento do tumor. B). C). D). B).