Sumário
O anticorpo monoclonal IgM PAT-SM6 derivado de tumores humanos induz apoptose em células tumorais e é considerado como um potencial agente anti-cancro. Um alvo principal para PAT-SM6 é o regulador de resposta proteína desdobrada GRP78, sobre-expresso externamente na superfície celular de células de tumor. Pequeno ângulo de dispersão de raios-X (SAXS) estudos de GRP78 humano mostraram um monómero em forma de haltere de dois domínios, ao passo que a análise de SAXS de PAT-SM6 revelou uma estrutura em forma de pires acomoda simetria cinco vezes, consistente com estudos anteriores de proteínas relacionadas. Sedimentação análise de velocidade de misturas GRP78 e PAT-SM6 indicou a formação do complexo fraco caracterizada por constantes de dissociação na gama alta concentração micromolar. Em contraste, os ensaios imunossorventes ligados a enzima (ELISA) mostraram interacções fortes e específicas entre PAT-SM6 e imobilizada GRP78. A constante de ligação aparente estimado a partir de uma curva de saturação PAT-SM6 fortemente correlacionada com a concentração de GRP78 utilizado para revestir o tabuleiro de microtitulação. Experiências usando anticorpos IgG policlonais antiGRP78 ou um derivado de IgG monoclonal de PAT-SM6 não mostram uma dependência semelhante. As experiências de competição com GRP78 solúvel indicado inibição mais eficaz da PAT-SM6 obrigatório em baixas concentrações de revestimento GRP78. Estas observações sugerem um mecanismo de ligação à base de avidez que depende da ligação multi-ponto de PAT-SM6 para GRP78 agrupado na superfície do tabuleiro. Análise de dados de ELISA a concentrações de revestimento de alto GRP78 produziram uma constante de dissociação aparente de cerca de 4 nM. Propomos que a acção biológica de PAT-SM6 na apoptose de células de tumor pode depender da natureza multivalente de PAT-SM6 e a avidez elevada da sua interacção com múltiplas moléculas de GRP78 agrupados na superfície da célula tumoral
citação.: Rosenes Z, Mulhern TD, Hatters DM, Ilag LL, Poder BE, Hosking C, et al. (2012) O Anti-Cancer IgM anticorpo monoclonal PAT-SM6 se liga com alta avidez à proteína Unfolded Response Regulador GRP78. PLoS ONE 7 (9): e44927. doi: 10.1371 /journal.pone.0044927
editor: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, Estados Unidos da América
Recebido: 21 de junho de 2012; Aceito: 09 de agosto de 2012; Publicação: 19 de setembro de 2012
Direitos de autor: © Rosenes et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiada pelo Conselho australiano de Investigação (LP100100392) com apoio adicional fornecido pelo Patrys Ltd. os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.
Conflito de interesses Este trabalho é parcialmente suportado pelo Patrys Ltd, uma empresa atualmente conduzindo testes clínicos de PAT-SM6 como um potencial tratamento anti-câncer
anticorpos
Natural IgM Introdução
desempenhar um papel importante na. resposta imune inata em que eles estão envolvidos na detecção precoce de partículas estranhas, bem como a detecção de auto-estruturas modificadas incluindo proteínas quimicamente modificadas e fibrilas amilóides [1], [2], [3]. anticorpos IgM também participam no reconhecimento e na remoção de células transformadas como uma importante defesa contra o cancro [4]. O desenvolvimento recente da tecnologia de hibridoma humano [5] levou ao isolamento de um grande número de anticorpos monoclonais da classe de IgM a partir de tumores de pacientes com cancro [6]. Um número destes anticorpos especificamente matar células malignas, induzindo vias apoptóticas [7], destacando a utilização potencial de anticorpos IgM monoclonais no desenvolvimento de novos tratamentos anti-cancro.
O anticorpo monoclonal IgM humano, PAT-SM6 , induz a morte das células tumorais através de uma via apoptótica acompanhada pela acumulação intracelular de lípidos [8]. PAT-SM6 como alvo células de tumor, por ligação à proteína GRP78 que é sobre-expresso externamente na superfície celular de células de tumor [9]. GRP78, também conhecido como (proteína de ligação de imunoglobulina de cadeia pesada) BiP, é um membro da proteína de choque térmico 70 (HSP70) de família que previne a apoptose induzida pelo stress. PAT-SM6 também se liga a lipoproteína de baixa densidade (LDL), e LDL oxidada [8] que conduz a um modelo de trabalho para a actividade apoptótica específico de tumor de PAT-SM6 qual PAT-SM6 proporciona o excesso de lípidos, sob a forma de LDL ligada ou LDL oxidada em tumores através da ligação a GRP78 modificado presente na superfície das células tumorais [8].
(a) GRP78 foi expressa e purificada a partir de
células de E. coli e submetido a espectroscopia de dicroísmo circular. Um espectro representativo para 0,15 mg /mL de GRP78 purificada a 25 ° C (círculos abertos) e o ajuste do Dichroweb sp175 utilizando conjunto de filtros (linha sólida) está mostrado. análise de velocidade (B) Sedimentação de GRP78 foi realizada por centrifugação de 0,4 mg /mL de GRP78 a 28000 rpm numa ultracentrífuga analítica. Os limites de absorvância sedimentação resultantes foram monitorizados a 280 nm e os dados representativos mostrados como círculos a branco. Serve para os dados experimentais utilizando um modelo de sedimentação C (S) são mostrados como linhas contínuas. Para maior clareza, apenas a cada varredura 10º é mostrado. (C) parcelas distribuição de tamanho de 1,2 mg /mL de GRP78 (linha sólida) ou 0,6 mg /mL de GRP78 (linha tracejada) calculado a partir de dados de montagem representados na (B) para ac (S) modelo de sedimentação.
modelos pré-clínicos de cancro mostram PAT-SM6 inibição do crescimento do tumor humano [8], sugerindo uma potencial terapia para tratar o câncer. A segurança e tolerabilidade do PAT-SM6 como um anticorpo anti-cancro para o tratamento de melanoma tem sido estabelecido em uma Fase I de ensaios clínicos recentes [10]. O desenvolvimento do PAT-SM6 como um agente eficaz anti-câncer será assistido por informações mais detalhadas sobre a base estrutural e força das interações de PAT-SM6 com antigénios alvo. Este conhecimento é essencial para a predição informado dos efeitos secundários indesejáveis associados com o uso terapêutico de PAT-SM6 sozinho, ou em terapias de combinação com outros agentes. No presente estudo, foi investigado a estrutura e interacções de Purificou-PAT-SM6 com GRP78 recombinante humana expressa e purificada a partir de bactérias. Utilizando a análise de velocidade de sedimentação e os ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISA) que mostram que, enquanto PAT-SM6 tem uma afinidade relativamente baixa para moléculas GRP78 individuais, a interacção de PAT-SM6 com moléculas GRP78 agrupado na superfície de uma placa de microtitulação é muito mais mais forte e caracterizada por constantes avidez aparentes na gama baixa concentração nanomolar.
Materiais e Métodos
o humana anticorpo monoclonal PAT-SM6 e um derivado hexamérica modificado, PAT-SM6-hex, falta um juntando cadeia J, foram expressos e purificados a partir de culturas em suspensão estável de uma linha de células humanas em meio isento de soro [11], [12]. Procedimentos semelhantes foram utilizados para expressar e purificar um derivado de IgG (PAT-SM6 IgG) composto por pesadas e leves de sequências de cadeia PAT-SM6. controlo do isotipo IgM foi obtido a partir de Jackson ImmunoResearch Labs, Inc., West Grove, PA. A sequência de codificação para o comprimento completo, gene GRP78 humano maduro foi inserida num vector de indução de calor pPOW, resultando numa construção com uma sequência de secreção pelB N-terminal e C-terminal 6xHis-tag [13]. A proteína foi expressa em
E. coli
células BL21 (DE3) e, em seguida, purificada a partir da porção solúvel do ligado celular por cromatografia de afinidade de níquel usando 5 ml de uma coluna His-trap (GE Healthcare), de acordo com o protocolo do fabricante. isomerase de glicose foi obtido a partir de Hampton Research, Aliso Viejo, CA.
Dicroísmo Circular (CD) Medidas
espectros CD de GRP78 (0,15 mg /ml) e PAT-SM6 (0,15 mg /ml) em solução salina de fosfato tamponada (PBS, fosfato de sódio 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7,4) foram adquiridas utilizando um Aviv modelo 62 DS CD espectrómetro (Aviv Biomedical, Inc., Lakewood, New Jersey) a 25 ° C com um 1 milímetro cuvete de quartzo de comprimento da trajectória, uma largura de banda espectral de 1 nm, um tempo médio de sinal de 2 s e um intervalo de dados de 0,5 nm. Ellipticities em millidegrees foram corrigidos para as medições de sozinho tampão e convertido para significar ellipticities resíduos (MRE) usando a fórmula MRE = elipticidade × MRW /(10 × c × l), onde MRW é o peso médio resíduo em g /mol, c a concentração em mg /mL, e L o comprimento do caminho em centímetros. CD espectros foram analisados para obter estimativas de estrutura secundária utilizando Dichroweb [14].
(A) Os dados de SAXS matérias são mostradas como círculos que representam intensidade média
I
(
q
) como uma função de transferência do momento
q
. As barras de erro indicam ± 1 desvio padrão (σ). símbolos negros:
I
(
q
) ≥ símbolos σ e cinza:
I
(
q
) σ. (B) enredo Guinier para esses dados de SAXS para q.Rg 1.3. (C) Kratky trama dos dados de SAXS. (D E) parcelas Porod-Debye em função do
q
3 e
q
4, respectivamente. (F) O derivado de SAXS-
ab initio
reconstrução forma (média filtrados de forma reconstruções 10) é mostrado sobreposto sobre o arranjo de domínio RMN-refinado das estruturas cristalográficas dos domínios N- e C-terminais da homologue GRP78 bacteriana DnaK [26].
pequeno ângulo de raios-x Scattering (SAXS)
SAXS dados foram coletados no /WAXS beamline Australian Synchrotron SAXS em conjunto com in- cromatografia de filtração em gel de linha, como descrito por Gunn e colaboradores [15]. As concentrações de carga para a coluna de filtração de gel em linha foi de 5 mg /mL para SM6 e 5 mg /mL para GRP78. imagens detector foram analisados como médias de dez sequenciais 2 s exposições usando o software SAXS15ID (Synchrotron australiano), que foram então convertidos para indivíduo
I
(
q
) perfis de SAXS.
I
(
Q
) é a intensidade de raios X dispersos, como uma função da grandeza do vector de transferência de momento
Q =
(4πsinθ) /λ, onde o ângulo de espalhamento é 2θ e o comprimento de onda de raios-X é λ (1,0332 Â). O
q
faixa sobre a qual intensidades foram coletadas foi 0,0047-0,2807 A
-1. perfis de SAXS foram analisados utilizando o ATSAS (versão 2.4) conjunto de programas [16]. A análise foi realizada utilizando Guinier AUTORG. A intensidade no ângulo de zero
I
(0) e a dimensão máxima (
D
max
) de partículas de dispersão foram estimadas a partir
P
(
r
) funções de distribuição vector par distância usando AUTOGNOM. Os volumes das respectivas partículas de espalhamento foram calculadas a partir da área sob parcelas Kratky (
q
2
I
(q) /
I
(0) vs .
q
) como descrito por Svergun e Fegin [17]; segundo o qual, parcelas Kratky foram extrapolados em baixa
q
(
q Art
q
min) usando a aproximação Guinier e extrapolou a alta
q
(
q
onde
I
(
q
)
/I
(0) 0,01) utilizando a aproximação Porod [18].
Ab initio
forma reconstruções a partir de dados de dispersão foram realizadas utilizando DAMMIF [19] e média formas filtrados calculados a partir de conjuntos de 10 reconstruções utilizando a suíte DAMAVER de programas [20]. refinamento de corpo rígido com a adição de segmentos em falta foi realizada utilizando CORAL [21] para vários modelos de cadeia. perfis de espalhamento teóricas de modelos estruturais foram gerados e comparados com os dados experimentais utilizando SAXS CRYSOL [22]. Os modelos estruturais e de forma envelopes onde optimamente sobrepostas utilizando SUPCOMB [23]. Comparações estatísticas da qualidade do ajuste dos perfis de espalhamento teóricos de modelos estruturais aos dados experimentais de SAXS foram realizadas pelo cálculo do
F
-statistic de pares de acessos e integrando o apropriado
F
-Distribuição [ ,,,0],24].
velocidade de Sedimentação Análise
de sedimentação experiências de velocidade foram conduzidos usando uma ultracentrífuga analítica XL-I (Beckman Coulter, Fullerton, CA) equipado com um rotor Ti An-60 a 20 ° C . As amostras de proteína foram adicionados a peças centrais cheios de EPON-sector duplo com fosfato de sódio 20 mM, pH 7,0, NaCl 100 mM, arginina 55 mM no compartimento de referência. os dados de absorvância radiais foram adquiridas a uma velocidade de rotor de 28000 rpm, utilizando um comprimento de onda de 280 nm, e com incrementos radiais de 0,003 cm no modo de varrimento contínuo. Os limites de sedimentação foram ajustados a um modelo assumindo uma distribuição de coeficientes de sedimentação para as espécies não interactuantes, C (S), utilizando o programa SEDFIT [25]. Os dados foram ajustados utilizando um parâmetro de regularização de p = 0,95 e o rácio de atrito flutuante.
(A) 0,15 mg /mL de PAT-SM6 foi sujeito a espectroscopia de dicroísmo circular. Um espectro representativo a 25 ° C (círculos abertos) e o ajuste do Dichroweb sp175 utilizando conjunto de filtros (linha sólida) está mostrado. (B) análise de velocidade de sedimentação de PAT-SM6 foi realizada por centrifugação de 0,4 mg /mL de PAT-SM6 a 28000 rpm numa ultracentrífuga analítica. Os limites de absorvância sedimentação resultantes foram monitorizados a 280 nm e os dados representativos mostrados como círculos a branco. Serve para os dados experimentais utilizando um modelo de sedimentação C (S) são mostrados como linhas contínuas. Para maior clareza, apenas cada terceira varredura é mostrada. (C) parcelas de distribuição de tamanho para pentam�ica PAT-SM6 (linha sólida) e hexamérica PAT-SM6 (linha tracejada) calculado a partir de dados de montagem representados na (B) para ac (S) modelo de sedimentação.
ligado a enzima Ensaio Imunossorvente (ELISA)
Os antigénios foram revestidas sobre tabuleiros de microtítulo de 96 cavidades (Nunc Maxisorp) por incubação durante a noite a 4 ° C. As placas foram então lavadas 3 vezes em PBS, 3 vezes em PBS + 0,1% de Tween 20, 3 vezes em PBS e bloqueadas com 5% (w /v) de BSA em PBS durante 1 hora à temperatura ambiente, depois lavou-se novamente como acima. Todas as preparações de anticorpos foram feitas em 5% (w /v) de BSA em PBS. Para as experiências de ELISA indirecto, os anticorpos foram aplicados directamente para a placa e incubou-se durante 1 hora. Para os testes ELISA competitivos, os anticorpos foram incubados em solução com diferentes quantidades de antigénio, antes da aplicação à placa de microtitulação. Depois de se lavar outra vez como anteriormente, peroxidase conjugada com o anticorpo secundário (IgG de cabra anti-coelho (Calbiochem), de coelho anti-IgG humana (Calbiochem), ou de coelho anti-IgM humana (Dako), depende da fonte do anticorpo primário e classe) foi aplicada sobre a placa e incubou-se durante 1 hora de acordo com as instruções do fabricante. Após uma lavagem final, a ligação foi determinada utilizando 100 uL por poço de 3,3 ‘, 5,5’-tetrametilbenzidina solução de substrato (Sigma) e medição da alteração de cor a 655 nm anticorpo. O curso de tempo para o desenvolvimento da cor foi essencialmente linear na faixa de densidade óptica 0-3. As medições foram feitas 15 minutos depois da adição de substrato. Em experiências de controlo, que envolve o revestimento directo das placas com PAT-SM6, no intervalo de concentração de 0-2,5 ng /ml, um aumento sistemático foi observada no sinal de ELISA com o aumento da concentração de revestimento, o que implica uma correlação directa entre o sinal de ELISA eo quantidade de anticorpo ligado à placa. dados de ELISA para a titulação de anticorpo primário de ligação ao GRP78 imobilizada foi analisada assumindo uma isotérmica de ligação de Langmuir simples descrita por a relação Y = K
A /(1-K
a) em que Y é a magnitude do sinal de ELISA e K
a é a constante de ligação aparente assumindo uma única classe de sítios de ligação.
(a) os dados de SAXS matérias são mostradas como círculos que representam intensidade média
I
(
q
) em função do momento de transferência
q
. As barras de erro indicam ± 1 desvio padrão (σ). símbolos negros:
I
(
q
) ≥ símbolos σ e cinza:
I
(
q
) σ. (B) Guinier enredo para esses dados de SAXS para
q
R
g
. 1.3. (C) Kratky trama dos dados de SAXS. (D E) parcelas Porod-Debye em função do
q
3 e
q
4, respectivamente. (F) O
ab initio
reconstrução forma (média filtrada forma a partir de 10 reconstruções com simetria P5 explícito) é mostrado sobreposto ao corpo rígido refinado modelo de SAXS, gerado utilizando fragmentos Fab e Fc unidas por uma 8-resíduo flexível ligante poli-Gli. A orientação dos quatro domínios constantes de Ig de cada fragmentos Fc foi modelada na estrutura cristalina da IgE e o Fc orientação relativa foi restringido por restrições de distância aplicação ligações dissulfureto intercadeias [33].
resultados
Caracterização da purificada GRP78
GRP78 Humana, ligado a uma extensão de pelB N-terminal e His-Tag [11] foi expressa e purificada a partir de
e.
coli. A espectrometria de massa do produto purificado deu uma massa de 73270,7 Da comparado com um valor teórico a partir da composição de 73269,9 Da. CD espectrofotometria indicou uma estrutura dobrada com um espectros de CD caracterizado por um duplo mínimos em cerca de 208 e 221 nm (Figura 1). A análise dos espectros produziram estimativas de 22,1% e 29,1% para A e A -Estrutura, respectivamente. Estes valores podem ser comparados com estimativas de 36% de A-hélice e 27% de A-folha para a estrutura secundária determinada a partir da estrutura tridimensional do homólogo de HSP70 bacteriano, DnaK [26]. Evidência adicional para o enrolamento correcto de GRP78 humana purificada foi obtida por ensaio da actividade de ATPase residual. O uso de um ensaio de cinase piruvato acoplado lactato-desidrogenase [27] indicada uma actividade específica de cerca de 4 nmol de ATP hidrolisado por segundo por mole de GRP78.
. 0,4 mg /mL de PAT-SM6 e 0,4 mg /mL de GRP78 foram incubados em conjunto e centrifugados a 28000 rpm. Os limites de absorvância sedimentação resultantes foram monitorizados a 280 nm e os dados representativos mostrados como círculos a branco. Serve para os dados experimentais utilizando um modelo de sedimentação C (S) são mostrados como linhas contínuas. B. Correspondente C (S) parcelas distribuição de tamanhos para os dados apresentados em (A) para PAT-SM6 (linha tracejada preta), GRP78 (cinzento linha a tracejado) e a mistura das duas proteínas (linha a cheio). C. distribuições radiais obtido após centrifugação a 28000 rpm durante 72 min para PAT-SM6 (0,4 uM; círculos cinzentos), GRP78 (10 uM; círculos pretos) e mistura de PAT-SM6 (0,4 uM) e GRP78 (10 uM, sólido linha). A linha cinza sólida é a soma das distribuições radiais obtidos para PAT-SM6 e GRP78 sozinho, assumindo que não há interação.
dados de velocidade de sedimentação para GRP78 purificado mostrou uma única grande fronteira de sedimentação (Figura 1). A análise deste assumindo uma distribuição de tamanho contínuo de espécies não interagindo dados indicaram uma espécie dominante, caracterizada por um coeficiente de sedimentação, o coeficiente de atrito e massa molecular consistente com a presença de monómero GRP78 (Tabela 1). Além desta espécie principal, os dados identificado um dependentes da concentração de espécies maiores (S20, de aproximadamente 7,2 W S) atribuídos à presença de um dímero em equilíbrio lento, com as espécies monoméricas predominantes.
Os dados de SAXS para o GRP78 são mostrados na Figura 2A. A trama Guinier a partir destes dados (Figura 2B) foi linear em baixa
q
(onde
q
Rg
. 1,3) eo raio de rotação (
R
) obtida a partir do declive foi de 45,5 ± 2,2 Å. A massa do monómero GRP78 foi estimada a partir da área sob a trama Kratky (Figura 2C) para ser de 89,5 kDa, que é 22% mais elevado do que o valor teórico de 73,2 kDa. Dado que a linha em cromatografia de filtração em gel permitiu-nos eliminar a contribuição de dispersão de qualquer dímero, esta análise proporciona uma densidade de proteína monomérica de 0,85 g.cm
-1, o que é indicativo da densidade electrónica de um difusa altamente flexível molécula [28]. Inspecção das parcelas Porod-Debye (Figura 2D 2E) mostrou os dados de SAXS GRP78 não planalto como
I
(
q
)
q
. 4 vs.
q
4, mas fez planalto como
I
(
q
).
q
3 vs.
q
3, que suporta ainda a sugestão de que GRP78 é altamente flexível, mas contém estrutura dobrada significativa [28]. Como um controlo, a análise semelhante foi realizado com os dados de SAXS registados a partir de uma proteína globular compacta, isomerase de glucose. Estas análises mostraram um planalto em ambos
I
(
q
).
q
3 vs.
q
3 e
I
(
q
).
q
4 vs.
q
4 parcelas e deu uma densidade de 1,32 g.cm
-1, o que está em excelente concordância com estudos anteriores desta molécula [28].
a concentração de GRP78 utilizado para revestir os poços era 30 ug /mL. A: Os anticorpos primários utilizados foram PAT-SM6 (pistas 1 e 3), anti-GRP78 (pista 2) e de controlo do isotipo IgM (pista 4). Na pista 3 o passo inicial de revestimento com GRP78 foi omitido. B: O anticorpo primário utilizado foi PAT-SM6. As incubações foram realizadas em tampão fosfato de sódio 20 mM, com NaCl adicionado sem (pista 5), NaCl a 140 mM (pista 6) e NaCl 500 mM (pista 7). C: O anticorpo primário utilizado foi PAT-SM6. As incubações foram realizadas em tampão fosfato de sódio 20 mM, NaCl 140 mM, a valores de 6 (pista 8), 7,4 (pista 9) e 8 (pista 10).
Ab initio
forma de modelagem de GRP78 foi realizada seguindo estimativa da função de distribuição de distância de partículas vector
P
(
r
) por transformação Fourier indireta. A dimensão máxima (
D
max
) a partir de
P
(
r
) análise foi estimada em 134 a. A Figura 2F mostra o volume filtrado modelo SAXS média resultante sobreposta sobre a estrutura de RMN refinado comprimento completo de DnaK [26]. A forma global e a orientação relativa média do domínio N e domínio C do GRP78 é consistente com os dados de RMN para a DnaK, estabelecendo ainda mais a natureza predominantemente monomérico e dobragem correctas do produto GRP78 humano expresso bacteriana.
Caracterização da purificada PAT-SM6
A estrutura eo comportamento solução de purificado PAT-SM6 foi também caracterizada. Os espectros de CD de PAT-SM6 revelou uma única mínimo a cerca de 215 nm, o que sugere uma estrutura secundária predominante β folhas (Figura 3). Os resultados comparam-se favoravelmente com os estudos anteriores CD sobre a estrutura secundária de anticorpos IgM [29]. A análise dos dados de CD para PAT-SM6 indicado estrutura secundária composta de aproximadamente 3,8% ao hélices, 51% ao-costas, 7,7% voltas e 35,8% estrutura desordenada. dados de velocidade de sedimentação para PAT-SM6 mostrou uma única grande fronteira (Figura 3). A análise dos dados, assumindo um coeficiente de sedimentação de distribuição contínua de espécies não-interacção, revelou a presença de uma grande e uma pequena população caracterizado por coeficientes médios de sedimentação de 17 S e 24 S, respectivamente (Tabela 1). Estes resultados são consistentes com a presença de espécies diméricas IgM monoméricos e [30]. O valor de melhor ajustamento obtido para a relação de atrito, f /fo, foi usado para analisar a forma global do monómero PAT-SM6. Os dados indicam uma forma assimétrica correspondente a um elíptico com os parâmetros listados na Tabela 1. Dados de velocidade de sedimentação também foi obtido por um derivado PAT-SM6 hexamérica, PAT-SM6-hex, carecendo de uma cadeia J [11]. A análise do tamanho-distribuição dos dados indicam uma espécie principal sedimentação caracterizadas por s20, w e f /fo valores de 17,6 S e 1,95, respectivamente
Os anticorpos primários utilizados foram:. A. PAT-SM6; B. anti-GRP78 policlonal; C. PAT-SM6-hex e D. PAT-SM6 IgG. As concentrações de revestimento GRP78 foram de 30 ug /ml (círculos fechados), 15 ug /ml (triângulos abertos invertidos), 7,5 ug /mL (quadrados a cheio), 3,75 ug /ml (losangos em branco), 1,88 ^ g /ml (triângulos fechados) , 0 ug /ml (círculos abertos). As linhas sólidas são as linhas de melhor ajuste calculados para uma isotérmica de ligação simples.
A. Binding constantes para PAT-SM6 (círculos fechados) e PAT-SM6-hex (círculos abertos). B. constantes de ligação para PAT-SM6 IgG (círculos fechados) e anti-GRP78 (círculos abertos).
Os dados de SAXS para PAT-SM6 são apresentados na Figura 4A. A trama Guinier (Figura 4B) é linear em baixa
q
(
q
R
g
. 1,3) e a
R
g
obtida a partir do declive era 122,0 ± 1,4 Å. O
D
max
foi estimada a partir da análise
P
(
r
) para ser ~4.2 nm ea massa molecular derivada da área sob a trama Kratky ( Figura 4C) foi de 1,06 × 10
6 Da. Estas estimativas de massa,
R
g
e
D
valores
máximo para PAT-SM6 estão em boa concordância com os de estudos de SAXS anteriores de IgM [31]. Mais uma vez, a presença de um platô na trama de
I
(
q
).
q
3 vs.
q
3 (Figura 4D) e falta de um platô no
I
(
q
).
q
4 vs.
q
4 plot (Figura 4E) indicou uma estrutura dobrada com uma flexibilidade significativa [28].
Ab initio
modelagem forma de PAT-SM6 não convergem em uma forma física realista, sem a imposição de restrições de simetria explícitas. Em vez de impor arbitrariamente simetria cinco vezes, a qualidade do ajuste dos perfis teóricos SAXS dos modelos com diferentes simetrias (P2, P3, P4, P5 e P6) para os dados de SAXS foram comparadas [24]. Cinco vezes simetria rendeu o melhor ajuste, que foi significativamente melhor do que os ajustes com quatro vezes ou simetria de seis vezes (
P
(
F
) valores de 0,036 e 0,004, respectivamente) . O modelo de média SAXS forma do monómero PAT-SM6 com simetria cinco vezes concordou muito bem com as características gerais caracterizado por microscopia electrónica anterior, SAXS e modelação de homologia estudos de IgM [31], [32], [33]. Multi-cadeia refinamento de corpo rígido contra os dados de SAXS foi realizada utilizando fragmentos Fab flexivelmente ligados a fragmentos Fc baseadas sobre a IgE [34], como por modelagem EM recente [33]. P5 simetria foi imposta e a orientação relativa dos fragmentos Fc foi limitado por restrições de distância correspondentes aos inter-subunidades ligações dissulfeto [35]. O SAXS
ab initio
modelo forma é mostrado sobreposto ao corpo rígido refinado modelo de SAXS (Figura 4F). Ambos os modelos de SAXS sugerem assimetria no posicionamento relativo dos dois fragmentos Fab dentro de cada um dos cinco pares de cadeia pesada-cadeia leve, o que é consistente com as reconstruções forma EM [35]. Estes estudos estruturais confirmar a relativa homogeneidade da preparação PAT-SM6 e da adequação para estudos solução no interações com antígenos específicos.
A. A concentração de GRP78 utilizado para revestir os poços era de 7,5 ug /mL. Os anticorpos primários utilizados foram PAT-SM6 (5 ug /mL, os círculos fechados) e policlonais anti-GRP78 (círculos abertos). Os resultados também são apresentados para experiências de controlo, omitindo revestimento GRP78 utilizando anticorpos primários como PAT-SM6 (5 mg /ml, triângulos fechados) ou anti-GRP78 (quadrados abertos). B: A ligação de PAT-SM6 (5 ug /ml) para GRP78 imobilizada em diferentes concentrações de revestimento GRP78 na ausência (barras pretas) ou na presença (barras cinzentas) do GRP78 solúvel (4 mg /ml). C: inibição induzida GRP78 solúvel de PAT-SM6 ligação a GRP78 imobilizada em diferentes concentrações de revestimento de GRP78. As concentrações de PAT-SM6 e GRP78 solúvel utilizados foram de 5 ug /ml e 4 mg /ml, respectivamente.
A Interação da PAT-SM6 com GRP78 no Solution
análise de velocidade de sedimentação foi utilizado para investigar a interacção de PAT-SM6 e de GRP78. As varreduras radiais na Figura 5A, obtidos por uma mistura de PAT-SM6 (0,4 uM) e GRP78 (10 uM), mostram uma lenta e um limites de movimento rápido correspondentes aproximadamente às velocidades de contorno obtidos para amostras separadas de GRP78 e PAT-SM6 , respectivamente (Figuras 2 e 4). análise da distribuição de tamanho contínua dos dados obtidos para a mistura PAT-SM6-GRP78 confirmou duas populações principais caracterizadas por coeficientes médios de sedimentação semelhantes aos valores médios para GRP78 e PAT-SM6. A análise da área sob a população correspondente a PAT-SM6 indicou uma pequena diminuição na área de cerca de 10%, consistente com a perda de material. Esta perda foi atribuída à formação e rápido esgotamento de grandes complexos de anticorpo-antigénio. Mais evidências para a perda de material devido à formação de complexo é fornecido por uma comparação das verificações radiais tomadas a um único ponto de tempo para PAT-SM6 sozinho, GRP78 sozinho e a mistura de PAT-SM6 e de GRP78. Os resultados mostram que o valor de patamar para a mistura-PAT-SM6 GRP78 é mais baixa do que os varrimentos de densidade óptica agrupados para os componentes separados, indicativas da formação do complexo. Uma dificuldade na análise de dados para complexos reversíveis fraco é a natureza dinâmica das interacções e a complexidade do ajustamento dos dados a modelos específicos [36]. No entanto, os dados na figura 5C indicam a perda de apenas uma pequena quantidade de PAT-SM6 como grandes complexos, o que corresponde a aproximadamente 10% de PAT-SM6. Uma vez que a concentração total de PAT-SM6 e GRP78 usado nestas experiências foi de 0,4 uM e 10 uM, respectivamente, esta estimativa para a proporção de rendimento de complexo para uma estimativa da constante de dissociação, assumindo um complexo de 01:01, de cerca de 90 uM. Esta afinidade de ligação relativamente baixo é típico de interacções IgM antígeno-em comparação com as interações entre a afinidade maturados anticorpos IgG e seus antígenos cognatos [37].
Análise ELISA da interação entre PAT-SM6 e GRP78
A interacção de PAT-SM6 com GRP78 imobilizado numa placa de microtitulação foi analisada utilizando um ensaio ELISA. Os resultados na Figura 6 mostram um forte sinal positivo usando PAT-SM6 ou anti-GRP78 como anticorpo primário. As experiências de controlo omitindo o procedimento de revestimento GRP78 inicial ou usando um anticorpo de controlo do isotipo IgM deu um sinal de que estava perto de fundo. A grandeza do sinal positivo para a interacção de PAT-SM6 com GRP78 imobilizada foi semelhante para as amostras incubadas em tampão de fosfato de sódio 20 mM, pH 7,4 em comparação com amostras de PAT-SM6 em PBS, enquanto o sinal foi significativamente reduzida quando a concentração de NaCl foi aumentada 500 mM. A ligação do PAT-SM6 para GRP78 imobilizada foi semelhante para as incubações realizadas a valores de 6, 7,4 e 8.
pH
Em vista do sinal relativamente forte observado para a interacção do PAT-SM6 com GRP78 em ensaios ELISA (Figura 6) em relação à interacção relativamente fraca deduzida a partir de estudos de velocidade de sedimentação (Figura 5B e C) foram realizadas experiências adicionais para determinar a força das interacções observadas sob condições de ELISA. Os resultados na Figura 7A mostra o sinal de ELISA determinado como uma função de concentração PAT-SM6 para diferentes concentrações de revestimento de GRP78. Os resultados mostram as curvas típicas saturações em que a magnitude do sinal na ELISA saturação aumenta sistematicamente como a concentração de revestimento de GRP78 PAT-SM6 é aumentada. Também são mostrados na Figura 7 são experiências de controlo utilizando diferentes concentrações de anti-GRP78, PAT-SM6-hex e IgG PAT-SM6. Em cada caso, existe um aumento sistemático na magnitude das curvas de saturação com o aumento da concentração de revestimento GRP78.