Abstract

O câncer colorretal (CRC) ainda é o terceiro a maioria de cancro comum ea segunda causa mais comum de morte relacionada ao câncer em todo o mundo. A metformina, uma biguanida, que é amplamente utilizado no tratamento da diabetes mellitus, recentemente tem sido demonstrado ter um efeito supressor sobre a mortalidade e o risco de CRC, mas nem todos os estudos laboratoriais sugerem que a metformina tem actividade antineoplásica. Aqui, nós investigamos o efeito de metformina e activador de AMPK AICAR em CRC proliferação das células. Como resultado, a metformina não inibiu a proliferação celular ou induzir a apoptose em linhas celulares de CRC in vitro e in vivo. Diferente de metformina, a AICAR emergiu actividade antitumoral e anticancro efeito sensibilizado de 5-FU sobre as células de CRC in vitro e in vivo. Em análises posteriores, que mostram que a activação da AMPK pode ser um mecanismo molecular essencial para o efeito aditivo de AICAR. Tomados em conjunto, os nossos resultados sugerem que a metformina não tem actividade anti-neoplásica para as células CRC como um único agente, mas AMPK ativador AICAR pode induzir a apoptose e aumentar o efeito citotóxico de 5-FU através da ativação da AMPK

Citation:. Sui X, Xu Y, Yang J, fang Y, Lou H, Han W, et al. (2014) O uso de metformina em monoterapia não está associado com a sobrevivência Outcomes de celulares de cancro colorrectal, mas AMPK Activator AICAR sensibiliza Anticancer efeito do 5-fluorouracil através AMPK Activation. PLoS ONE 9 (5): e97781. doi: 10.1371 /journal.pone.0097781

editor: Demetrios Vavvas, Massachusetts Eye Ear Infirmary, Harvard Medical School, Estados Unidos da América

Recebido: 16 de fevereiro de 2014; Aceito: 23 de abril de 2014; Publicado em: 21 de maio de 2014

Direitos de autor: © 2014 Sui et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo é apoiado por subsídios da National Science Foundation Natural da China (concessão No. 81301891 e 81272593) e Zhejiang Provincial Natural Science Foundation da China (Grant No. LQ13H160008). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal (CRC) é ainda uma das principais causas de morbidade relacionada ao câncer e mortalidade em todo o mundo, embora muito progresso tem sido feito no tratamento da CRC ao longo dos últimos anos [1], [2 ]. Estudos epidemiológicos mostraram que a diabetes mellitus (DM) aumenta a incidência e a mortalidade de cancros, especialmente malignidade gastrointestinal [3], [4]. Existem evidências crescentes de ligando diabetes mellitus com um risco aumentado de cancro colo-rectal [5], [6]. No entanto, outros estudos não apoiaram este ponto de vista. A multi-center, double-blind, placebo-controlado, randomizado e controlado mostrou que não houve diferença estatisticamente significativa na sobrevivência específica cólon-câncer nas pessoas que com diabetes [7]. Assim, a relação entre o DM e o risco de CRC permanece controverso.

Metformina (cloridrato de 1,1-dimetilbiguanida), um derivado de biguanida, que é amplamente utilizado no tratamento da diabetes mellitus, tem demonstrado exercer efeitos antineoplásicos potencialmente importantes [ ,,,0],8], [9], mas outros não apoiou esta posição [10], [11]. Os mecanismos envolvidos nos efeitos antineoplásicos de metformina são provavelmente muito diversificada, incluindo a activação da adenosina monofosfato-quinase (AMPK) mutação [12], fosfatidilinositol-3-quinase (PI3K) [13], deficiência de p53 [14], e assim por diante. Entre esses mecanismos, o alvo de mamífero AMPK- eixo de rapamicina (mTOR) desempenha um papel central para os efeitos antineoplásicos de metformina. Ambos metformina e 5-amino-imidazol-4-carboxamida-1-b-4-ribofuranósido (AICAR) pode ativar a AMPK via. AMPK é uma serina-treonina quinase /e um sensor de combustível via celular sensível ao aumento da relação de AMP /ATP, que tenha sido ligado a vários supressores de tumores humanos [15]. Os efeitos da metformina são explicadas principalmente pela activação de AMPK, que inibe a síntese proteica e gluconeogénese durante o stress celular [16].

Até agora, 5-fluorouracilo (5-FU) continua a ser um fármaco quimioterapêutico largamente utilizado na tratamento de carcinoma colorrectal. Recentemente, a metformina é relatado como tendo um efeito sinergístico em combinação com alguns agentes quimioterapêuticos [17], [18]. No entanto, não fica claro se a metformina ou AICAR pode ser utilizado em combinação com 5-FU para aumentar o efeito anti-cancro, uma vez que não existe nenhum estudo sobre a correlação entre a AICAR e 5-FU tratamento com metformina /in vitro e in vivo.

Nós investigamos o impacto de metformina e AMPK ativador AICAR na proliferação de células CRC. Aqui demonstramos que o uso de metformina isoladamente não está associado com os resultados de sobrevivência de células de cancro colorectal, mas AICAR podem induzir a apoptose e aumentar o efeito citotóxico de 5-FU, através da activação da AMPK, que deve ser considerado nos ensaios clínicos em curso em que a metformina são utilizados em o tratamento do cancro colorectal.

Resultados

a metformina não Inibir colorectal cancer Cell Growth

a fim de examinar se a metformina afeta a proliferação de células de câncer colorretal humano investigamos o efeito de a droga em linhas celulares de cancro três: HCT116, RKO e HT29 células. As células foram cultivadas em 10% de soro fetal de bovino (FBS), tratado com metformina (1 e 5 mM) e de AICAR (5 mM) como controlo. AICAR é conhecido por induzir a apoptose. O ensaio de viabilidade MTT foi realizado depois da adição dos agentes durante 24 h. Como resultado, a AICAR reduziu a viabilidade celular por 50-70%, em três linhas celulares, mas pequena diminuição da viabilidade celular foi encontrada nas três linhas de células tratadas com metformina (Figura 1A), indicando a metformina pode ter nenhum efeito sobre células de cancro colo-rectal crescimento. Para determinar se a metformina inibe o crescimento independente de ancoragem, foi realizado um ensaio de agar suave formação de colónias na ausência ou na presença de 5 mM de metformina renovadas diariamente. Após 2 semanas, as células foram contadas sob um microscópio. De acordo com os resultados do ensaio MTT de viabilidade, a metformina não diminua o número e o tamanho das colónias (Figura 1B). Estes resultados sugerem que a metformina não possuem actividade inibidora do crescimento em células de cancro colorrectal.

(A) HCT116, RKO e HT29 foram semeadas em placas de 96 poços. Após 24 h, a metformina (1 e 5 mM) e de AICAR (5 mM) foram adicionados ao meio de cultura. 24 h após a adição dos agentes, o efeito da metformina sobre a sobrevivência de células do cancro colo-rectal foi realizado um ensaio de viabilidade celular (MTT). (B) fotografia de colónias de agar mole de HCT116, RKO e células HT29 2 semanas após o tratamento com metformina e 5 mM de AICAR 5 mm. (3) linhas celulares de cancro foram tratadas com diferentes concentrações de metformina (1, 5 e 10 mM) durante diversos períodos e, em seguida, a expressão de caspase-3 activa e LC3-II rácio /I foi avaliada por Western blotting.

a metformina não induzir a apoptose, autofagia e Ciclo celular detenção

Para investigar se a metformina induzir a apoptose e autofagia, três linhas celulares de cancro foram tratadas com diferentes concentrações de metformina (1, 5 e 10 mM ) durante diversos períodos e, em seguida, a expressão de caspase-3 activa e LC3-II /I rácio foi avaliada por western blotting. Como mostrado na Figura 1C, a apoptose e autofagia não foram activadas de um modo dose e dependente do tempo, quando as células foram tratadas com metformina. Para posterior confirmação, todos estas células tratadas foram analisadas por microscopia electrónica e citometria de fluxo. Estes três células exibido células apoptóticas extensas (Figura 2A) e um aumento da população sub-G1 (Figura 2B) após o tratamento AICAR. Em contraste, muito poucas apoptose foram vistos em células tratadas de metformina. Em seguida, perguntou se a metformina afeta ciclo celular. Como pode ser visto na Figura 2B, observou-se a mesma percentagem de células em G0 /G1, S G2and fase em células de metformina tratados em comparação com os respectivos controlos. Tomados em conjunto, os nossos dados demonstram que a metformina não induziu apoptose, autofagia e paragem do ciclo celular.

(a) 24 h após a adição de metformina 5 mM e 5 mM de AICAR, o efeito da metformina sobre células de cancro colo-rectal observou-se a sobrevivência. celular Representante alterações morfológicas detectadas por microscopia de luz; Foram observadas características morfológicas características da apoptose, incluindo desprendimento e encolhimento celular. (B) As fracções de células da sub-G1, G0 /G1, S ou G2 /M fases do ciclo celular é investigada após o tratamento com metformina e AICAR.

AICAR potenciada anti-cancro efeito do 5-FU in vitro e in vivo

tem sido reconhecido que 5-FU é normalmente utilizado em combinação com outros fármacos quimioterapêuticos para melhorar a sua eficácia terapêutica para pacientes de CRC. De modo a examinar se a AICAR pode sensibilizar efeito anticancerígeno de 5-FU, foi avaliado o efeito de AICAR em apoptose induzida por 5-FU. Verificou-se que a viabilidade das células tratadas por AICAR em combinação com 5-FU foi significativamente inferior ao dos controlos (Figura 3A). A citometria de fluxo mostrou que a percentagem de células apoptóticas foi significativamente mais elevada em células tratadas por AICAR em combinação com 5-FU em comparação com controlos (Figura 3B). Estes resultados sugerem que a AICAR-intensifica a apoptose induzida por 5-FU em células de cancro colorrectal.

(A) HCT116, RKO e HT29 foram semeadas em placas de 96 poços. Após 24 h, a metformina (5 mM), de AICAR (5 mM), 5-FU (20 uM) e AICAR, mais 5-FU foram adicionados ao meio de cultura. 24 h após a adição dos agentes, o efeito de metformina e AICAR na sobrevivência de células de cancro colo-rectal foi realizado um ensaio de viabilidade celular (MTT). (B) Os resultados representativos de anexina V-FITC coloração /PI e análise quantitativa; os valores são média ± DP de três experiências independentes; * P . 0,05

Para examinar se metformina e AICAR pode afetar o crescimento do tumor in vivo, em seguida, injetaram em ratos nus por via subcutânea com células HT29. Os ratinhos com xenoenxertos de tumor atingir 100 mm

3 foram divididos aleatoriamente em 5 grupos experimentais: grupo de controlo, metformina 200 mg /ml /D (em água potável, o que corresponde a 15 mg /kg), grupo, AICAR 400 mg /grupo kg /dia 2, 5-FU, 40 mg /kg /2 dias grupo e AICAR mais grupo 5-FU durante 5 semanas. O tratamento foi administrado por meio de injecção intra-tumoral. Todos os ratinhos toleraram este tratamento bem sem toxicidade significativa e apresentaram pesos corporais estáveis. Em primeiro lugar, os níveis de metformina foram ensaiados (3 h e 15 h após a injecção de metformina) por cromatografia líquida de alto desempenho e os níveis de metformina em soros de ratinhos foram, em média, 1,15 (± 0,31) ng /ml para o pico que igualou cerca de níveis de pico humanos para 500 mg po (Via oral) por dia. As experiências foram realizadas em triplicado e os resultados mostraram que os níveis de metformina no plasma de ratinhos nus do sexo feminino foram geralmente realizados nos seres humanos. Em seguida, os tamanhos dos tumores dos xenoenxertos foram medidos. Como resultado, o tamanho do tumor de xenoenxertos do grupo AICAR não grupo metformina foi menor em comparação ao grupo controle. Além disso, os tamanhos de AICAR mais grupo 5-FU foram significativamente menor em comparação com AICAR sozinho ou grupo 5-FU, sugerindo que a AICAR podem potenciar os efeitos anticancro induzida por 5-FU de HT29 (Figura 4A).

( A) curva de crescimento de tumores de xenoenxertos tratados com fármacos indicados. (B) O efeito do AICAR na ativação da AMPK. A expressão da caspase-3 ativa, p-AMPK e p-mTOR foram analisados ​​por Western blot.

AICAR, talvez aumente Anticancer de 5-FU através AMPK Activation

Tem sido reconhecido que os efeitos de AICAR são explicadas principalmente pela activação de AMPK, que regula o metabolismo da energia celular. Para investigar se a activação da AMPK pode estar associada com o efeito aditivo de AICAR, a fosforilação da AMPK e mTOR foram avaliadas por transferência de Western utilizando anticorpos específicos. Verificou-se que P-AMPK induzida por 5-FU foram reforçados por AICAR, em conjunto com diminuição de p-mTOR e aumento da caspase-3 (Figura 4B), indicando que a activação de AMPK por AICAR potenciou a apoptose 5-FU-induzida.

Discussão

Apesar de cada vez mais evidências suportam a ideia de que a hiperinsulinemia e hiperglicemia promover a carcinogênese em pacientes com diabetes mellitus [19], [20], permanece controverso se o risco de câncer colorretal também está associada com diabetes mellitus e tratamento com metformina pode reduzir o risco de CRC [10].

metformina, um derivado de biguanida, é um fármaco amplamente utilizados e bem tolerado para o tratamento de diabetes mellitus tipo 2. A eficácia da metformina como uma droga antidiabética é explicada pela sua capacidade para diminuir a gluconeogénese hepática e estimular a captação de glucose no músculo, o que resulta em concentrações de glucose em circulação reduzidos [21]. níveis de metformina em humanos estão em níveis molares micro mas gut pode ou não ver os níveis de mili-molar. Dados recentes sugerem que a metformina poderia proteger contra o câncer, incluindo efeitos anti-tumorais CRC e tem em xenoenxertos rato [22], [23]. Curiosamente, existe um relatório conflitantes sobre o papel potencial de metformina e cancro. Bodmer e seus colegas descobriram que o uso de metformina não foi associada a uma diminuição do risco de câncer colorretal e metformina também não alterou o risco de câncer de pulmão [10], [24]. Também é relatado que não houve associação estatisticamente significativa entre a exposição metformina e cancro colorectal disseminada no momento do diagnóstico [25]. Metfromin pode não funcionar em células tumorais regulares, mas trabalhar com células-tronco. Tem sido mostrado que a metformina poderia atingir selectivamente as células estaminais do cancro [26], e agir em conjunto com a quimioterapia para bloquear o crescimento do tumor e prolongar a remissão em vários tipos de células do cancro [26], [27]. A metformina pode também inibir a resposta inflamatória associada com a transformação celular e o crescimento de células estaminais do cancro [28]. Além disso, a metformina pode acelerar o crescimento de melanoma BRAF V600E-impulsionado por upregulating VEGF-A [29] e promover o fenótipo angiogénico no modelo ERalpha negativo MDA-MB-435 do cancro da mama [30]. Em geral, a metformina pode ter apenas efeitos na prevenção da iniciação do tumor mas depois o cancro tenha sido estabelecido que não pode ter um efeito. Os nossos dados também mostraram que a exposição a metformina não inibiu o crescimento de células de cancro colo-rectal, induzir apoptose ou autofagia e paragem do ciclo celular. De acordo com o in vitro, in vivo estudo revelou que a metformina não suprimiu o crescimento de tumores, mas activador de AMPK AICAR emergiu actividade antitumoral. Portanto, a metformina pode ter nenhuma actividade antineoplásica para células de CRC como um agente único.

Os efeitos anticancerígenos de AICAR são mediados pela activação de AMPK e redução de mTOR sinalização [31]. AMPK activação pode suprimir a via mTOR para inibir o crescimento e proliferação celular. AICAR têm sido relatados para aumentar a eficácia dos agentes quimioterapêuticos convencionais no tratamento do carcinoma da nasofaringe local e metastático (NPC) [32]. activadores de AMPK, tais como AICAR fornecer uma estratégia terapêutica para doenças malignas hematológicas [33], [34]. Em primeiro lugar, a AICAR pode induzir apoptose em células de células B de leucemia linfocítica crónica [35] e matar células de leucemia mielóide crónica (CML) por meio de indução dependente de PKC de morte celular autophagic [36]. Em segundo lugar, AICAR tem efeitos antileucêmicas em células BCR-ABL-expressando [37] e células de infância leucemia linfoblástica aguda (ALL) [38]. Em terceiro lugar, AICAR pode induzir G (1) /S prisão e Nanog downregulation via p53 e melhorar a diferenciação eritróide [39]. Finalmente, a AICAR, também pode induzir apoptose independente de p53 por meio de AMPK e a sobre-regulação do BH3 somente proteínas e BIM noxa em células de leucemia linfocítica crónica [40]. Além NPC e leucemia, AICAR está envolvida na supressão do crescimento de células estaminais neurais e paragem do ciclo celular por regulação negativa da proteína do retinoblastoma e fosfo-ciclina D [41]. AICAR pode inibir o crescimento de retinoblastoma, diminuindo a angiogénese e induzindo a apoptose [42] ou de activação da AMPK [43]. AICAR é também demonstrada para inibir a proliferação de EGFRvIII glioblastoma expressando através AMPK via [44]. Além disso, a AICAR pode ser utilizado em ensaios clínicos como um cardioprotector sob condições de ATP-empobrecido e foi demonstrado ser um mimético de exercício em animais [45]. De acordo com estes resultados, informamos que AICAR pode induzir a apoptose a surgir actividade antineoplásica. Além disso, AICAR aumentou o efeito citotóxico de 5-FU através da ativação da AMPK.

Em conclusão, nosso estudo revelou que o uso de metformina por si só não está associada a resultados de sobrevivência de células de câncer colorretal, mas AMPK ativador AICAR pode induzir a apoptose e emergem actividade antineoplásica. Além disso, a ativação da AMPK pode ser uma causa fundamental que AICAR pode aumentar o efeito citotóxico da 5-FU em células de cancro colorrectal.

Materiais e Métodos

Cultura de Células

A humana colorectal linhas de células de carcinoma HCT116, RKO e HT29 foram adquiridos da ATCC (LGC Standards SLU, Barcelona, ​​Espanha). As linhas de células foram mantidas em 5A de McCoy, ou meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Gibco BRL, Rockville, MD, EUA) com soro de bovino fetal a 10% (FBS), 100 unidades /mL de penicilina, 100 ug /mL de estreptomicina (Invitrogen), e 2 mmol /l de L-glutamina, a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 95% de ar e 5% de CO

2.

Materiais

5-FU foi comprado de Jinyao Aminoácido Co., Ltd. (Tianjin, China). AICAR metformina e foram adquiridos da Sigma-Aldrich. Anti-fosfo-eIF2α e fósforo-AMPK foram adquiridos a partir de Cell Signaling.

medição da viabilidade celular e apoptose

A viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de MTT. As células foram semeadas em placas de 96 poços de microtitulação de fundo plano a uma densidade de 1 × 10

4 células por poço. Os agentes foram adicionados às concentrações indicadas, durante 24 h. A absorvância foi medida num leitor de microplacas (Synergy HT, Bio-Tek, EUA) a 570 nm.

Kit apoptose Ddtection Phartmingen anexina V-FITC I (BD, EUA) foi utilizado para detectar a apoptose e a estimativa procedimento foi realizado de acordo com as instruções do fabricante. 2 × 10

6 as células foram semeadas em um disco de 6 cm. Após fixação durante a noite, as células foram lavadas duas vezes com PBS e o meio foi substituído com meio de metformina 5 mM ou 20 ug /mL de 5-FU. Todas as células, incluindo as células flutuantes no meio de cultura foram colhidos. As células foram ressuspensas em tampão de ligação gelado 1 × a uma concentração de 1 × 10

6 células /ml. 100 ul de cada suspensão de células foram misturados com 5 ul FITC anexina V e 5 ul PI. A mistura foi incubada durante 15 min à temperatura ambiente no escuro e então analisadas por citómetro de fluxo FACSCalibur (BD Biosystems, Heidelberg, Alemanha).

Soft-ágar de ensaio de formação de colónias

500 células eram suspensas em meio contendo 0,3% de agarose de baixa fusão, semeadas numa placa de seis poços, que foi revestida com 0,5% de agarose de baixa fusão, e deixou-se crescer durante 2 semanas a 37 ° C em 5% de CO

2. As colónias contendo mais do que 50 células foram contadas sob um microscópio. Três cavidades foram analisadas para cada experimento.

-ciclo celular Análise

As células foram tratadas com tripsina, lavadas duas vezes em PBS gelado e ressuspensas em 200 ul de tampão de citrato (250 mM de sacarose, 40 mM citrato de tri-sódio, 5% de dimetil sul f óxido (DMSO), ajustada a pH 7,6 com 40 mM de ácido acético). iodeto de propídio (40 ug /ml) foi adicionada às células e incubada durante 45 min no escuro a 4 ° C antes da análise.

Análise Western Blot

As células foram colhidas a partir de cultura pratos e foram lisadas num tampão de lise [Tris-HCl 20 mM pH 7,6, EDTA 1 mM, NaCl 140 mM, 1% de NP-40, 1% de aprotinina, 1 mM de fluoreto de phenylemethylsulfonyl (PMSF), vanadato de sódio 1 mM]. A concentração de proteína foi determinada utilizando um kit de ensaio de proteína BCA (Pierce). Os lisados ​​celulares (40 ug de proteína /linha) foram separadas em 5 a 20% de Tris-Tricina Pronto gel de SDS-PAGE (Bio-Rad) para blotting membrana de nitrocelulose. As membranas manchadas foram bloqueados com leite desnatado a 5% durante 1 h e foram incubadas com anticorpos primários. As bandas imunorreactivas foram visualizadas por quimioluminiscência aumentada utilizando anticorpos secundários de rábano IgG-Perox-Idase conjugado. densidade de banda foi medida por densitometria, quantificada utilizando gel plotagem macros imagem NIH 1,62, e normalizada de a uma amostra indicada na membrana idêntica.

In vivo subcutânea Modelo de Tumor

Todo o in vivo protocolos experimentais foram aprovados pelo comitê de cuidados com os animais de Sir Run Run Shaw Hospital, Universidade de Zhejiang. células HCT116 viáveis ​​(1 × 10

7cells em fosfato 0,1 ml de tampão salino) foram injectados subcutaneamente no flanco dorsal direito de ratos fêmea de 6 semanas de idade BALB /c nu (seis ratinhos por grupo). O volume do tumor foi avaliada a cada 2 dias, durante 4 semanas. O volume do tumor foi calculado pela fórmula seguinte: (diâmetro curto)

2 × (diâmetro de comprimento) /2

Análises Estatísticas

Os resultados são expressos como valores da média ± desvio padrão (. SD). A análise estatística foi realizada usando SPSS 11.0 para Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA). Eu executei o teste t pareado (bicaudal) análise estatística, a significância estatística foi estabelecido em p . 0,05