Abstract

Plasma, o quarto estado da matéria, é definido como um gás parcialmente ou completamente ionizado que inclui uma mistura de electrões e iões. Os avanços na física de plasma tornaram possível a utilização de plasma a pressão atmosférica não-térmico (NTP) na pesquisa do câncer. No entanto, estudos anteriores têm-se centrado principalmente sobre a morte de células cancerosas por apoptose mediada pela NTP como uma terapia potencial cancro. Neste estudo, investigou o efeito de NTP na invasão ou metástase, assim como o mecanismo pelo qual o plasma induz propriedades anti-migração e anti-invasão em linhas celulares de cancro humano papilares da tiróide (BHP10-3 e TPC1). cicatrização de feridas, suspenso, e os ensaios de Transwell demonstrou que NTP reduzida migração e invasão celular. Além disso, NTP induziu alterações morfológicas e rearranjos do citoesqueleto, como detectado por microscopia eletrônica de varredura e imunocitoquímica. Examinámos também metaloproteinase de matriz (MMP) -2 /-9 e de tipo urocinase do activador de plasminogénio (uPA) atividade usando zimografia de gelatina, ensaios de uPA e RT-PCR. FAK, Src e paxilina expressão foi detectada usando análises Western blot e imunohistoquímica. NTP diminuiu de FAK, Src, e paxilina expressão, bem como a actividade das MMP /uPA. Em conclusão, NTP inibiu a invasão e metástase de células BHP10-3 e TPC1 diminuindo actividades de MMP-2 /-9 e uPA e reorganizando o citoesqueleto, que é regulada pelo complexo FAK /Src. Estas descobertas sugerem novas ações para NTP e pode ajudar no desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para o câncer localmente invasivos e metastáticos

Citation:. Chang JW, Kang SU, Shin YS, Kim KI, Seo SJ, Yang SS, et ai. Cancer Cell (2014) não-térmica Pressão atmosférica Inibe plasma de tireóide papilar Invasion via Citoesqueletal Modulation, Altered MMP-2 /-9 /uPA Atividade. PLoS ONE 9 (3): e92198. doi: 10.1371 /journal.pone.0092198

editor: Jian Cao, Stony Brook University, Estados Unidos da América

Recebido: 13 de novembro de 2013; Aceito: 19 de fevereiro de 2014; Publicação: 25 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Chang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi suportada pela Bio Programa de Desenvolvimento de Tecnologia Médica da NRF financiado pelo governo coreano (2012M3A9B2052870). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:. Keunho Lee é o diretor executivo da PSM America Inc., dedicado como consulta técnica no dispositivo, e isso não altera a nossa adesão a PLOS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

carcinoma papilar de tireóide é uma das neoplasias mais comuns em todo o mundo e, geralmente, mostra o personagem indolente [ ,,,0],1]. No entanto, às vezes pode ser agressivo, com disseminação extracapsular, músculo correia, nervo laríngeo recorrente e invasão traqueal, bem como metástase para os linfonodos. Em casos raros, o cancro papilar da tireóide pode metástases para pulmão ou osso [2], [3]. A presença de metástases locais ou distantes afeta recorrência do tumor, as taxas de sobrevivência de pacientes e qualidade de vida, levando a mau prognóstico [4]. Portanto, é necessário descobrir novas maneiras de prevenir as características agressivas de invasão e metástase no câncer papilar de tireóide.

medicina Plasma é um campo de rápido crescimento que envolve uma nova modalidade de tratamento [5], [6]. Diferentes fontes de plasma e dispositivos de plasma são utilizados para várias indicações, incluindo a desinfecção [7], cicatrização de feridas [8], a coagulação do sangue [9], e morte de células de cancro [10]. Além disso, os avanços tecnológicos têm permitido a geração de plasmas à temperatura ambiente e à pressão atmosférica (de plasma à pressão atmosférica não-térmico, NTP) [10] – [12]. NTPs foram referidos como tendo actividades anti-cancro em vários tecidos, incluindo cancro do pulmão [5], cancro colorrectal [10] – [12], e melanoma [13], sugerindo um novo anti-tumoral modalidade terapêutica. Além disso, nosso grupo já mostrou que NTP induziu uma parada do crescimento e invasão tumoral retardado em células de cancro colorrectal [10], [11]. No entanto, o mecanismo anti-cancro de NTP tem-se concentrado principalmente nos mecanismos relacionados com a apoptose com espécies de oxigénio reactivo aumento ou desequilíbrios redox [14].

A invasão tumoral para tecidos adjacentes ou metástases para órgãos distantes, é a causa predominante de a mortalidade em pacientes com câncer [15]. Portanto, a ênfase tem sido colocada na inibição da invasão e metástases de cancro. Muitas linhas de evidência demonstrar que um complexo processo de passos interdependentes, incluindo a migração celular, invasão, a aderência de superfície, e a degradação da matriz extracelular (ECM), está estreitamente relacionada com a invasão do tumor e /ou metástase e é regulada por mecanismos extremamente complicados [ ,,,0],16]. Anteriormente, sugeriu que o tratamento NTP diminuiu a migração celular e invasão de células de cancro colorrectal [10]. No entanto, os mecanismos envolvidos na inibição induzida por plasma de migração celular e invasão não são completamente compreendidos.

O objectivo deste estudo foi o de explorar os efeitos inibidores da NTP sobre a migração e a invasão de células de cancro da tiróide humana linhas. Para o melhor de nosso conhecimento, este é o primeiro estudo que avaliou o efeito anti-câncer do NTP sobre a migração e invasão celular associada com a modulação do citoesqueleto e as mudanças de metaloproteinases de matriz (MMP) -2 /-9 /-tipo uroquinase ativador do plasminogênio (uPA ) atividades.

Materiais e Métodos

as linhas celulares e reagentes

as linhas de células de carcinoma papilar da tiróide humana BHP10-3 e TPC1 foram comprados na American Type Culture Collection (Manassas , VA, EUA). A linha de células da tireóide normais Nthy-ori 3-1 foi gentilmente apresentado pelo prof. Minho Song (Universidade Nacional de Chungnam, Coréia). BHP10-3 e Nthy-ori 3-1 células foram mantidas em meio RPMI 1640 (Gibco, Carlsbad, CA, EUA), enquanto as células TPC1 foram mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco mistura nutriente /Ham F-12 (DMEM /F12; Gibco ), suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 100 U /ml de penicilina-estreptomicina (Gibco). As células foram mantidas a 37 ° C com 5% de CO

2 em condições humidificadas.

especificações do sistema experimentais

Tal como descrito anteriormente [11], nós concebido e fabricado um tipo de pulverização sistema de NTP com um prato livre de arco e antiestático recém-projetado que fornece um jato de plasma uniforme para aplicações de investigação biomédica. Este sistema apresenta alta eficiência para a modificação da superfície das amostras biológicas a baixas temperaturas, o que é fundamental para experimentos biológicos.

As especificações técnicas do sistema de plasma ( “tocha com spray-type”) são mostrados nas Figuras . 1A e B. As especificações da fonte de alimentação para este sistema são de 2 mínimos kV, 13 kV máximo, e uma frequência média de 20-30 kHz; estas especificações podem variar de acordo com o tipo ea quantidade de gás utilizado. Neste estudo, hélio (He) e de oxigénio (O

2) foram utilizados como gases transportadores pois encontramos anteriormente de que a adição de O

2 para um plasma Ele melhora a eficiência da inibição de células de cancro [10]. O espectro de emissão de plasma de acordo com a potência utilizada neste estudo (2 ou 4 kV) é mostrado na Fig. 1B.

(B) o espectro de emissão óptica do He e O

2 mistura do gás de plasma de acordo com a intensidade eléctrica (2 ou 4 kV) na gama de 280-920 nm. (C) Imagem da “tocha com o tipo de spray” jato de plasma com Ele e O

2. O plasma visível tinha um comprimento de cerca de 2,5 cm, que variou de acordo com o fluxo de gás e de tensão.

Microscopia

eletrônica de varredura (SEM)

Para SEM, as células foram cultivadas em lamelas de vidro e fixo durante 1 h à temperatura ambiente em paraformaldeído a 4% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) (pH 7,2). As lamelas foram processados ​​tal como descrito anteriormente [17]. As células foram examinadas usando um microscópio eletrônico de varredura. (S-4800; Hitachi, Tóquio, Japão) operando a 10 ou 15 kV

citoesqueleto coloração

As células foram colhidas e re-semeadas em fibronectina lamelas -Revestido. Após 24 h, as células foram fixadas durante 20 minutos em 3,7% de formaldeído e re-hidratadas em PBS com 0,1% de Triton X-100. Após o bloqueio durante 45 min com PBS contendo BSA a 5%, as lâminas foram incubadas com faloidina Texas-Red-conjugado (Molecular Probes, Eugene, OR, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Hoechst 33258 foi adicionada a contracoloração os núcleos. As lâminas foram analisadas utilizando microscopia de fluorescência (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanha).

pull-down ensaios (RhoA, Rac1 e Cdc42 GTPase ensaios de activação)

Para determinar o efeito do NTP em alterações morfológicas que afectam a migração de células, um kit de RhoA /Rac1 /Cdc42 Activação Ensaio Combinado Biochem (Cytoskeleton Inc., York, Reino Unido) foi utilizada de acordo com as instruções do fabricante, com 600 ug de proteína total. Em resumo, contas de afinidade de domínio efetor rhotekin-RBD foram usadas para vincular RhoA activa e contas de afinidade domínio PAK-PBD efetoras foram usadas para vincular Cdc42 ativo e Rac1. Após incubação durante 2 h, as proteínas foram eluídas com tampão de Laemmli e separados em 12% de acrilamida /bis-acrilamida gels. Os controlos negativos e positivos foram realizados de acordo com as instruções do fabricante. Para confirmar a presença de GTPases nos extractos de proteína celular, controles de entrada 5% também foram corridos em géis. Os géis foram transferidos para membranas de nitrocelulose, que foram incubadas durante a noite com anticorpos contra Cdc42, Rac1, e RhoA (incluído no estojo), com agitação suave. As proteínas foram detectadas utilizando um kit de quimioluminescência aumentada Western blotting.

Wound ensaios

Para os ensaios de migração celular, as células foram plaqueadas em placas de cultura de 12 poços de cura a uma densidade de aproximadamente 1 x 10

5 /poço e cultivadas até à confluência. Os ensaios de cicatrização de feridas foram realizadas como descrito anteriormente [10]. Em resumo, a monocamada foi riscada com uma ponta de pipeta estéril, seguido de uma lavagem exaustiva para remover os restos celulares. As células foram então expostas ao gás (Ele ou O

2 apenas), 2 ou 4 kV de NTP, respectivamente, de 1 s. rácios de cicatrização de feridas foram documentadas em fotografia após 24 h desde os tempos de duplicação para BHP10-3 e TPC1 foram 30,0 ± 1,2 h e 29,7 ± 0,8 h, respectivamente. Os tempos de duplicação foram calculados a partir da curva de crescimento celular ao longo de três dias como se segue: (T

2: tempo final, t

1: tempo inicial, q

2: número de células final, Q

1 : número de células inicial)

análises Western blot

As células foram lisadas em tampão de lise contendo NaCl 150 mM, 1,0% de NP-40, 0,5% de desoxicolato de sódio, 0,1% de SDS, Tris a 50 mM ( pH 8,0), e cocktail inibidor de protease (pH 7,4; Roche Applied Science, Viena, Áustria), tal como descrito anteriormente [18]. Os anticorpos seguintes foram utilizados para a transferência de Western: anti-quinase de adesão focal (FAK), -Src, -Paxillin, -extracellular quinase regulada por sinal (ERK), -Akt, e -α-tubulina (1:1000; Cell Signaling Technology , Danvers, MA, EUA).

Imunocitoqu�ica

As células foram cultivadas em lamelas de microscópio (Thermo Fisher Scientific, Rochester, NY, EUA) e tratada com gás (He + O

2 ) somente, 2, ou 4 kV de NTP, respectivamente. Após 24 h, as lâminas foram lavadas com PBS, fixadas durante 20 min em 3,7% de formaldeído, e re-hidratadas em PBS. Após o bloqueio durante 45 minutos em BSA (5% em PBS), as lâminas foram incubadas durante 1 h com anticorpo policlonal de coelho anti-anticorpos P-FAK e-paxilina (1:50; Cell Signaling Technology), lavadas com PBS, e incubou-se durante 45 min com anticorpos anti-coelho de cabra Alexa-488 marcado (1:250; Molecular Probes). Após lavagem em PBS, a Hoechst 33258 foi adicionada durante 15 min a contracoloração os núcleos. As lâminas foram lavadas com PBS e montadas com Vectashield (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, EUA), em seguida, analisadas através de microscopia de fluorescência (Cari Zeiss).

Invasion ensaios (Transwell)

Transwell (24 poços) câmaras (Costar, Cambridge, MA, EUA) foram utilizados para avaliar a invasão de células de acordo com o tratamento de NTP, como descrito anteriormente [10]. Inicialmente, a fibronectina (2 ug /filtro) foi dissolvido em 100 ul de MEM e verteu-se sobre a parte superior do filtro de polietileno (diâmetro dos poros, 8 uM) .Os poços foram revestidas durante a noite numa câmara de fluxo laminar.

em seguida, 10

5 células (em 100 ul de meio de crescimento) foram adicionados à parte superior do filtro no poço superior. A câmara foi incubada durante 24 h em 5% de CO

2 a 37 ° C. Finalmente, as células aderentes na secção inferior foram corados com H . E, e contados utilizando microscopia de luz

transcrição reversa-reacção em cadeia da polimerase (RT-PCR)

O ARN total foi extraído a partir de homogeneizado as células utilizando o reagente TRIzol (Gibco-BRL, Grand Island, NY, EUA). ReverTraAce qPCR RT master mix (Toyobo Co., Ltd., Osaka, Japão) foi usada para reverter ARN-transcrever. O ARN total (1 ug) foi misturada com 10 ug da mistura. A transcrição reversa foi realizada e o ADNc foi sintetizado. O ADNc foi adicionado a uma mistura de Taq Breve HS DyeMix (Toyobo Co., Ltd.) e iniciadores específicos, e amplificado utilizando um T100 ™ Thermal Cycler (Bio-Rad, Waltham, MA, EUA). A metaloproteinase de matriz (MMP) -2 e MMP-9 sequências iniciadoras foram: MMP-2-F, 5′-ACC TGG ATG CCG TCG TGG AC-3 ‘; MMP-2-R, 5’-TGT ACC AGC GGC CGC AGG GC-3 ‘; MMP-9-F, 5’-GGG GAA GAT GCT GCT GTT CA-3 ‘; e MMP-9-R, 5′-GGT CCC AGT GGG GAT TTA CA-3’.After desnaturação durante 3 minutos a 94 ° C, as amostras foram amplificadas durante 35 ciclos de 30 s a 94 ° C, 60 ° C, e 72 ° C, com uma extensão de 5 min a 72 ° C. Os produtos foram separados por electroforese em géis de agarose a 1,5% e detectado utilizando luz ultravioleta (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA).

zimografia

MMP-2 /-9 actividade foi ensaiada usando zimografia de gelatina, tal como descrito anteriormente [19]. células BHP10-3 TPC1 e foram tratados com gás (He + O2) somente, 2, ou 4 kV de NTP para 1 s, e incubou-se durante um adicional de 24 h. O sobrenadante (100 ul) de cada amostra foi misturada com 1 ul de mM de acetato de 4-aminof 100, e as amostras foram activadas durante 1 h a 37 ° C. Em seguida, cada amostra foi colocado em tampão de amostra durante 10 minutos e submetidas a electroforese em géis de poliacrilamida a 125 V durante 120 min a 4 ° C utilizando um sistema Novex Xcell II (Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA). Os géis foram incubados em tampão de renaturação durante 60 min à temperatura ambiente, seguido de incubação durante 18 horas em 100 ml de tampão de desenvolvimento a 37 ° C com agitação leve. Os géis foram então coradas durante 3 h com azul brilhante de Coomassie. Após descoloração em 400 ml de metanol, 100 ml de ácido acético, e 500 ml de água destilada, as imagens foram feitas usando um analisador de imagem.

-tipo urocinase do activador do plasminogénio (uPA) ensaios

BHP10-3 e TPC1cells (3000 células /poço) foram adicionados a placas de 96 cavidades em meio completo contendo 10% de FBS. Após incubação durante a noite, as células foram tratadas com gás (Ele + O

2) somente, 2, ou 4 kV de NTP, respectivamente. As placas foram então incubadas durante mais 24 h. As células foram então processados ​​como descrito previamente [19]. Resumidamente, as células foram lavadas com DMEM sem vermelho de fenol e colocados em 200 ul de tampão de reacção contendo 50% (v /v) de 0,05 L /plasminogénio ml em DMEM (sem vermelho de fenol), 40% (v /v) de 50 mM de tampão Tris (pH 8,2), e 10% (v /v) de 2,25 mm cromozima PL em glicina 100 mM. As misturas foram incubadas durante 3 h a 37 ° C em 5% de CO

2. A absorvância a 405 nm foi medida utilizando um leitor de placas espectrofotométrico automatizado.

Análise estatística

Uma forma de análise de variância (ANOVA) seguinte teste hoc Tukey post de foram realizadas usando SPSS 20.0 software estatístico ( SPSS, Chicago, IL, EUA). Os parâmetros dos dados de três experiências independentes são expressos como a média ± S.D. A

P Art 0,05 foi considerado estatisticamente significativo (*

P Art 0,05; **

P Art 0,01; ***

P

. 0.001)

Resultados

NTP induz mudanças na morfologia celular em células de câncer papilar de tireóide humanos

as células sobreviventes que aderiram à superfície após o tratamento NTP exibiram um morfologia diferente (Fig. 2A e B). células papilares tiróide crescem normalmente num padrão achatada, caracterizada por diversos projecções citoplasmáticas (lamellipodia e filopodia) [20]. Após o tratamento de NTP, as células apresentaram uma morfologia muito diferente que foi caracterizado por um aparecimento menor e contraído, e diminuiu microspikes citoplasmáticas na célula resultantes restrito espalhamento (Fig. 2A).

(A) após o tratamento com gás ( ele + O

2) somente, 2 ou 4 kV de NTP para 1 s, respectivamente, as células foram incubadas durante 24 h. A morfologia de ambas as linhas de células foi então examinada por microscopia de luz. Nos grupos tratados com apenas controlam e gás, as células foram plano e alongado, com lamellipodia (asterisco) e filopódios (seta) que estabeleceu contatos célula-célula lateralmente. Em contraste, as células tratadas com NTP mostrou alterações morfológicas caracterizadas por um citoplasma contraído, inibiu o contacto célula-a-célula, e revogada projecções citoplasmáticas (lamellipodia e filopodia). Imagens (B) SEM confirmaram o efeito da NTP sobre a morfologia celular. O citoplasma das células tratadas com NTP apresentaram encolhimento e uma perda de polarização horizontal e saliências citoplasmáticos. Além disso, a superfície das células tratadas com o plasma foi mais áspera do que a das células tratadas com apenas um controlo e gás. (C) Ensaios de imunof luorescência utilizando faloidina Texas-Red-conjugado foi realizada para visualizar o citoesqueleto (F-actina); Hoechst 33258 foi utilizado para marcar os núcleos das células. No controle e gás plasma, as células tratadas, feixes contrátil actina (fibras de estresse) e uma malha de filamentos de actina diagonal foram formados. No entanto, nos grupos tratados com NTP, os filamentos de actina foram distribuídos no citoplasma contraído destruindo a arquitectura do citoesqueleto, e sem formação de fibras de stress acentuado foi observado. Barra de escala = 50 mm. Cada figura foi representativos de três experiências com triplicados.

microscopia eletrônica de varredura de ambas as linhas celulares confirmou as conclusões anteriores que controlam e gás células tratadas só mostrou características mesenquimais-like com muitas projeções citoplasmáticas. Em contraste, as células tratadas com NTP tinha corpos celulares mais compactas e superfícies de células em bruto, em que os processos citoplasmáticos protuberantes foram aparentemente diminuiu (Fig. 2B).

NTP induz uma arquitectura do citoesqueleto desregulada em células de cancro papilar da tiróide humana

imunocitoquímica usado contra os filamentos de actina intracelulares com corante conjugado-faloidina e verificou que a estrutura do citoesqueleto de actina das células tratadas com plasma foi modificado. No controle e células tratadas com gás, feixes contráteis de actina (fibras de estresse) e uma malha de filamentos de actina diagonal foram anotados. No entanto, os filamentos de actina foram distribuídos no citoplasma contraído, destruindo, assim, a arquitectura do citoesqueleto, e sem formação de fibras de stress acentuado foi observado em células tratadas com NTP (Fig. 2C).

NTP inibe a actividade de Rho GTPases (RhoA, Rac1 e Cdc42)

A família Rho de GTPases é bem conhecida por seu envolvimento nas funções celulares, tais como a polaridade celular, formação de lamellipodia ou filopódios e migração celular. Por isso, investigamos o efeito da NTP sobre a família Rho actividade (RhoA, Rac1 e Cdc42). Como mostrado na Fig. 3, o tratamento NTP diminuiu significativamente as formas ativas de RhoA e Rac1.

família Rho (Rho, Rac1 e Cdc42) a atividade foi avaliada utilizando kits de detecção de pull-down após a exposição ao gás (He + O

2) somente, 2 ou 4 kV de NTP para 1 s. tratamento de células de NTP BHP10-3 TPC1 e reduziu significativamente a expressão de GTP-RhoA e GTP-Rac1 (as formas activas destas proteínas). Cada figura foi representativos de três experiências com triplicados.

NTP inibe a migração celular através do complexo FAK /Src em células de câncer papilar da tiróide humana

Para investigar se NTP reduz a migração de células tumorais, Os ensaios de encerramento de feridas zero foram realizados. Como mostrado na Fig. 4A e B, os nossos resultados demonstram que o tratamento de plasma suprimiu significativamente a migração de BHP10-3 (

P

0,01) e TPC1 (

P

0,001) em toda a zona células desnudadas. A percentagem de inibição da migração celular foi de 48,2 e 55,4% em BHP10-3 células e 63,6 e 84,1% em TPC1 células após 24 h de incubação com 2 e 4 kV de NTP, respectivamente, em comparação com células de controlo. Gás único tratamento não afectou significativamente a migração celular em ambas as linhas.

e células BHP10-3 TPC1 (A) foram plaqueadas em placas de 12 poços, cultivadas até à confluência, e a monocamada foi ferida com uma ponta de pipeta. cicatrização de feridas foi documentado através de fotografia após 24 h de incubação. Barra de escala = 200 pm. (B) Quantificação da migração celular. O NTP inibiu significativamente a migração de BHP10-3 (

P Art 0,001) e TPC1 (

P Art 0,001) células em toda a zona desnudada. Os dados representam a média ± S.D. de três experiências independentes. NS, não significativo; **

P Art 0,01, ***

P

. 0,001

Para melhor avaliar o efeito da NTP sobre a migração celular, foi avaliada a proteína os lisados ​​para a fosforilação de FAK, Src, e paxilina, que são conhecidos por sua íntima associação com a migração celular, invasão, e o rearranjo do citoesqueleto através da quinase FAK /Src complexo [21]. Após o tratamento de NTP, observou-se a inibição da fosforilação de FAK e uma redução consistente no fosforilação de paxilina e Src, que estão a jusante da FAK (Fig. 5A).

(A) transferência de Western para o p-FAK, p-Src, e p-paxilina. ensaio para imunocitoquímica (B) p-FAK e (C) p-paxilina. No controle e gás plasma, as células tratadas, FAK foi localizada em estruturas de adesão pequenas na periferia da célula. Após o tratamento de NTP, acumulação focal de FAK foi significativamente diminuído em ambas as linhas celulares. Além disso, a coloração de P-paxilina foi co-localizada com coloração de P-FAK. tratamento NTP também a diminuição da expressão de p-paxilina. Barra de escala = 50 mm. Cada figura foi representativos de três experiências com triplicados.

Foram também analisadas a distribuição intracelular de fosforilada (p) FAK e fosforilada (p) paxilina. No controlo de gás e células tratadas com apenas p-FAK acumulada em zonas bem definidas, incluindo a periferia da célula, ao passo que após o tratamento NTP, p-FAK coloração foi significativamente diminuída (Fig. 5B). Co-localização dos sinais para a p-paxilina e p-FAK foi observada (Fig. 5B e C).

NTP inibe a invasão celular através da diminuição de MMP-2 /-9 e actividade de uPA, e Akt e ERK sinalização em células de cancro papilar da tiróide humana

estudos anteriores demonstraram que FAK regula a invasão de células, bem como migração, sobrevivência e metástases em uma variedade de tipos de células, incluindo cancro da tiróide [22], [23]. Para investigar se a NTP reduz invasão tumoral, ensaios de invasão foram realizadas utilizando câmaras Transwell e Matrigel. A invasão tumoral requer a degradação da membrana basal e de ECM, extensão citoplasmática, e a migração celular. Transwell ensaios imitar este ambiente para a invasão tumoral. As células ligadas na secção inferior passado através do filtro da câmara, indicando as células invasivas. Como mostrado na Fig. 6A, com H E células coradas estavam presentes na superfície inferior da membrana 24 h após a incubação. No entanto, o tratamento por plasma inibiu significativamente o número de células invasoras em comparação com células não tratadas (

P

0,001). (Fig. 6B)

e células BHP10-3 TPC1 (A) foram semeadas em filtros (tamanho de poro, 8 mm) revestidas com Matrigel no compartimento superior e expostos a Ele + o

2 gás só, 2 ou 4 kV de NTP para 1 s. Após 24 h, as células nos poros ou células ligadas à superfície inferior da membrana foram contados, e essas células ligadas à secção inferior foram corados com H E e contados utilizando microscopia de luz (200 ×). Barra de escala = 100 pm. (B) Quantificação dos dados de ensaio de invasão. tratamento NTP reduziu significativamente o número de BHP10-3 (

P Art 0,001) e TPC1 (

P Art 0,001) células que penetrou a membrana. Os dados representam a média ± S.D. de três experiências independentes. *

P Art 0,05, **

P Art 0,01, ***

P

. 0,001

Para entender o mecanismo pelo qual a invasão tumoral impactos NTP

in vitro

, foram realizadas zimografia de gelatina para a MMP-2 /-9 actividade. Os nossos resultados revelaram uma notável redução na atividade de MMP-2 /-9 quando as células BHP10-3 e TPC1 foram tratados com NTP para 1 s (Fig. 7A). Para melhor identificar a influência da NTP sobre MMPs, RT-PCR foi utilizado para avaliar a expressão de ARNm de MMP-2 /-9. Como mostrado na Fig. 7B, o tratamento NTP inibiu marcadamente a MMP-2 /-9 expressão de ARNm. Estas descobertas sugerem que a NTP inibiu a invasão de células através da diminuição da transcrição de MMP-2 /-9 e inibindo a actividade do enzima existente. A NTP também inibiu a atividade uPA como demonstrado pela UPA ensaios (Fig. 7C).

(A) Gelatina zimografia para MMP-2 /-9. NTP atenuada actividade enzimática da MMP-2 /-9 em ambas as linhas celulares. (B) RT-PCR para a MMP-2 /-9. Os níveis de ARNm de MMP-2 /-9 diminuiu depois do tratamento de NTP em ambas as células. Cada figura é representativa de três experiências com triplicados. ensaios (C) uPA. tratamento NTP diminuiu significativamente a actividade de uPA. Os dados representam a média ± S.D. de três experiências independentes. NS, não significativo, **

P Art 0,01, ***

P Art 0,001. (D) Western blotting. expressão de ERK e Akt foi significativamente reduzida após tratamento NTP em uma maneira dependente da intensidade. Cada figura foi representativos de três experiências com triplicados.

Finalmente, a expressão das proteínas Akt e ERK foi examinada utilizando Western blot. tratamento NTP inibida Akt e expressão ERK em ambas as linhas celulares em comparação com o único grupo de controle ou a gás (Fig. 7D).

Discussão

Os dados actuais indicam que NTP exerceu um efeito anti-tumoral por inibir a migração de células de cancro e invasão. NTP é uma modalidade promissora e emergente na pesquisa do câncer, e nós relatado anteriormente que os efeitos anti-câncer de NTP são mediadas através de uma paragem do crescimento e morte celular [10], [11]. No entanto, o primeiro ponto de contacto entre as células e uma NTP, é a membrana da célula, que contém várias proteínas que desempenham funções dinâmicas. Portanto, no presente estudo, centrada em mudanças na aparência de células que ocorreram na superfície da célula após o tratamento NTP. Os nossos dados mostram que as células de cancro da tiróide tratados com plasma perdido a sua, a polarização horizontal em forma de fuso plana e tinha diminuído projecções citosólicas, que são importantes para a mobilidade celular e de detecção do meio ambiente, enquanto que as células não mostraram apoptose significativa pelo tratamento NTP (Fig Complementar . S1). Estas saliências celulares baseadas em actina, chamado lamellipodia (filamentos de actina malha) e filopódios (filamentos de actina orientados radialmente), são controlados pela família Rho pequenas proteínas de ligação ao GTP (Rho-GTPases; RhoA, Rac1 e Cdc42) [24]. Estas proteínas altamente regulamentados também controlar a polarização mesenquimais do tipo de células e rearranjos do citoesqueleto, que são o primeiro passo na migração [24]. Nós confirmamos a indução de alterações morfológicas pela NTP através de coloração do citoesqueleto, que revelou o rearranjo de fibras de actina. Tomados em conjunto, a migração e os dados suspenso ensaio indicam que o plasma efetivamente inibiu a migração celular BHP10-3 e TPC1, relacionando assim, alterações morfológicas de células para rearranjo do citoesqueleto.

FAK é uma tirosina-quinase não receptora que localiza em adesões focais. FAK ARNm e a expressão da proteína é aumentada, na grande maioria dos tumores invasivo e metastático, incluindo o cancro da tiróide humana [25]. No entanto, a FAK é apenas detectável em tecidos normais ou tumores não invasivos [25] – [28]. Além disso, é uma das proteínas mais proeminente fosforilado em células de cancro papilar da tiróide [29]. Estudos têm demonstrado que FAK promove a migração de células através da formação de um complexo com Src e subsequente fosforilação do citoesqueleto molécula adaptadora paxilina pela FAK /Src complexo [30]. Além disso, paxilina está associada com o efector Cdc42 /Rac-alvo, o qual pode ligar Cdc42 e Rac a outras quinases e alvos a jusante [31], [32]. FAK também é conhecido por regular a migração de células através da modulação da montagem e desmontagem do citoesqueleto de actina através dos seus efeitos sobre a subfamilia Rho de GTPases pequenas [33], [34]. Os resultados deste estudo estão de acordo com estes estudos anteriores porque descobrimos que NTP migração celular inibiu significativamente suprimindo a expressão do complexo e paxilina sinalização FAK /Src, que estão relacionadas à regulação do citoesqueleto.

Além de o seu papel bem caracterizados na migração das células, a sinalização FAK está relacionada com a invasão do tumor por um número de mecanismos [35], [36]. Por exemplo, o sistema de MMP /uPA desempenha um papel importante na degradação de ECM e é crucial para facilitar a migração e invasão do tumor durante a metástase [37]. Por isso, nós investigamos o efeito de NTP na invasão de células de tumor e o sistema de FAK e MMP /uPA. A relação entre a FAK e a via de MMP-2 /-9 foi anteriormente investigado [22], [38]. inibição da FAK foi mostrado para reduzir a secreção de MMP-9 em células de carcinoma [39]. Além disso, uPA ligação ao receptor do activador de plasminogénio uroquinase activa a conversão de plasminogénio em plasmina. plasmina activada medeia a conversão de pró-MPM para as MMPs. Portanto, a inibição de MMP /uPA está intimamente relacionado com a diminuição da capacidade de invasão de células cancerosas. Neste estudo, os resultados com zimografia e RT-PCR indicam que o tratamento de NTP diminuição induzida em MMP-2 /-9 expressões e suas actividades, também. Estes dados estão de acordo com estudos publicados anteriores em que as expressões de Pro-MMP-2 /-9 e as respectivas actividades enzimáticas estão intimamente correlacionados com maligna e /ou fenótipo metastático de cancro [40] – [42]. Tomados em conjunto, os nossos resultados actuais mostram que a NTP diminui eficazmente a invasividade de células de cancro através do sistema /-9 /uPA MMP-2, que está associada com Akt e ERK sinalizações. Dados anteriores revelaram que o sistema de MMP /uPA é regulada através da ERK /sinalizações p38 PI3K-Akt e /ou [22], [43], [44].

Nós também examinou o efeito do NTP na linha de células da tiróide normal (Nthy-ori 3-1). tratamento NTP não induzir a morte celular por apoptose significativa em células normais da tireóide (figos complementares. S2 e S3). Além disso, em contraste com as células tumorais, as células normais da tiróide não mostraram alterações morfológicas significativas (Fig suplementar. S4) e redução da migração de células após o tratamento NTP (Fig suplementar. S5) sugerindo sensibilidade diferencial ao tratamento NTP entre células cancerosas e tiróide normais células. Estes resultados estão de acordo com estudos anteriores, que relataram o efeito seletivo anticancerígeno de tratamento de plasma [5], [45]. de três experiências independentes. Barra de escala = 50 mm.