Abstract

A resistência aos medicamentos é um obstáculo para o tratamento eficaz de câncer de ovário. Nós e outros autores mostraram que a via de sinalização de factor de crescimento semelhante a insulina (IGF) é um novo alvo potencial para superar a resistência à droga. O objetivo deste estudo foi validar IGF2 como um potencial alvo terapêutico no cancro do ovário resistente a medicamentos e para determinar a eficácia da segmentação IGF2

in vivo

. Uma análise dos dados Cancer Genome Atlas (TCGA) na serosa coorte câncer de ovário mostrou que a alta IGF2 expressão do mRNA é significativamente associada com um intervalo reduzido a progressão da doença e da morte, os indicadores clínicos de resistência aos medicamentos. Num painel geneticamente diverso de linhas celulares de cancro do ovário, os níveis de ARNm de IGF2 medido em linhas de células resistentes a diversos agentes de estabilização de microtúbulos, incluindo taxol foram encontrados para ser significativamente elevado em comparação com as linhas de células sensíveis a drogas. O efeito do IGF2 knockdown sobre a resistência Taxol foi investigada

in vitro

e

in vivo

. Transient knockdown IGF2 sensibilizados significativamente células resistentes a fármacos para tratamento com taxol. Um modelo de xenoenxerto de cancro do ovário resistentes Taxol, desenvolvida a partir de células T30-HEY, exibiu resistência a drogas extrema, em que a dose máxima tolerada do Taxol não retardou o crescimento do tumor em ratinhos. Bloqueando o IGF1R (um receptor transmembranar que transmite sinais de IGF1 e IGF2) usando um anticorpo monoclonal não alterou a resposta ao Taxol. No entanto, IGF2 estável knockdown utilizando ARN curto-hairpin em HEY-T30 efectivamente restaurada sensibilidade Taxol. Estes resultados validam IGF2 como um potencial alvo terapêutico no cancro do ovário resistente a medicamentos e mostrar que a segmentação diretamente IGF2 pode ser uma estratégia preferível em comparação com alvo IGF1R sozinho

Citation:. Brouwer-Visser J, Lee J, K McCullagh, Cossio MJ, Wang Y, Huang GS (2014) Insulin-like growth factor 2 silenciamento Restaura Taxol Sensibilidade em Drug Resistant cancro do ovário. PLoS ONE 9 (6): e100165. doi: 10.1371 /journal.pone.0100165

editor: Shannon M. Hawkins, Baylor College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 28 de fevereiro, 2014; Aceito: 22 de maio de 2014; Publicação: 16 de junho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Brouwer-Visser et al. . Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento: Conceder um apoio foi fornecido pelo Cancer Institute-National Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano (K12 HD00849) e do Congresso americano de Obstetras e Ginecologistas através da atribuição Programa de Desenvolvimento Scientist reprodutiva para GSH. Os autores reconhecem o uso das Einstein Cancer Center Recursos Partilhados Albert (Citometria de Fluxo do núcleo, Histologia e Patologia Comparada Core), apoiados pelo P30CA013330 concessão de Apoio Nacional Cancer Center Cancer Institute. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de ovário é a principal causa de morte por câncer ginecológico nos Estados Unidos. Desde meados da década de 1990, o tratamento padrão para câncer de ovário é citorredução cirúrgica e quimioterapia sistêmica, geralmente Taxol e platina [1]. No entanto, a maioria dos pacientes eventualmente sucumbir à doença recorrente, progressiva devido à resistência à quimioterapia

Para além dos seus papeis bem estabelecidos no desenvolvimento e crescimento, envelhecimento, carcinogénese e [2] -. [6], a via de sinalização de factor de crescimento semelhante a insulina (IGF) foi recentemente implicada na resistência à droga [7] – [11]. Como já relatado anteriormente, a regulação positiva do factor de crescimento tipo insulina 2 (IGF2) é uma resposta celular aguda para tratamento com taxol, e a sua expressão modula a resposta ao Taxol em linhas celulares de cancro do ovário resistentes aos medicamentos. [7]. Uma vez que o Taxol é utilizado no tratamento de primeira linha de cancro do ovário, a hipótese de que alta IGF2 estaria associada com resistência intrínseca clínico de drogas, que se manifesta como a diminuição do tempo para a progressão da doença /recorrência em pacientes. Apoiando esta hipótese, o nosso estudo anterior, utilizando uma abordagem de tissue microarray indicou que a alta expressão de IGF2 no tecido tumoral de ovário era de fato preditiva de intervalo reduzido a progressão /recorrência.

Com base nestes dados laboratoriais e clínicos, determinamos que IGF2 é um potencial alvo terapêutico para melhorar a resistência aos medicamentos no câncer de ovário, mas a nosso conhecimento, sem prévia

in vivo

estudos de validação ter sido feito. Portanto, como aqui descrito, realizamos estudos para avaliar se a resistência Taxol poderia ser superado

in vivo

alvejando IGF2. Foi examinado o impacto da IGF2 knockdown, não só sobre os efeitos do taxol, mas também a resposta aos microtúbulos não-taxano interagindo drogas e outros medicamentos vulgarmente utilizados no tratamento de cancro do ovário. Para confirmar a relevância clínica dos nossos resultados, uma análise da serosa coorte de cancro do ovário do The Cancer Genome Atlas (TCGA) foi feito para avaliar a relação de expressão IGF2 e os resultados clínicos.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Todos os experimentos com animais foram realizados com a aprovação do Comitê Institucional animal Cuidado e Uso (Protocolo 20.130.604) do Albert Einstein College of Medicine da Universidade de Yeshiva. A Institutional Animal Welfare Assurance (A3312-01) para esta instalação é totalmente credenciada pela Associação para a Avaliação e Acreditação do Laboratório Animal Care (AAALAC) desde 22 de fevereiro de 1983. Os animais foram tratados de acordo com a Lei de Bem-Estar Animal e do NIH “Guia para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório”.

linhas celulares e Reagentes

as linhas de células de carcinoma de ovário A2780 [12] e ei [13] (espécie presentes do Dr. Susan Banda Horwitz), e a linha celular de carcinoma do ovário de NIH: OVCAR8 [14] (uma simpática oferta do Dr. David Goldman) foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Life Technologies) com 10% de soro fetal bovino (Life Technologies) e 1% de penicilina /estreptomicina (Life Technologies) a 37 ° C com 5% de CO

2. Todas as linhas de células resistentes aos medicamentos foram gerados pelos autores, exceto HEY-Epo8 (um presente do Dr. Susan Banda Horwitz), que foi desenvolvido pelo Dr. C-P Huang Yang usando epotilona B [15]. A linha de células T30-HEY Taxol-resistente foi gerado a partir de HEY células, como descrito previamente [7]. A linha de células A2780-T15 foi gerado de forma semelhante a partir de A2780 que utilizam a selecção Taxol mas na presença contínua de 15 verapamil uM (Sigma). A2780-B20 e B20-HEY foram seleccionadas para resistência a ixabepilona (Ixempra Bristol-Myers Squibb), e OVCAR8-D30 para discodermolida. As linhas celulares foram autenticado utilizando o kit Genemarker 10 (Promega). linhas de células resistentes foram combinados para suas linhas sensíveis e aos dados publicados quando disponível. As linhas celulares foram rotineiramente para micoplasma com MycoAlert (Lonza). As células foram cultivadas em meio isento de droga, durante pelo menos 18 horas antes das experiências, excepto A2780-T15, que foi cultivado na presença de 0,5 nM de Taxol. Clinicamente formulado Taxol (Hospira) foi diluído 6 vezes em água a 5% de dextrose (Hospira) a uma concentração final de 1 mg /ml para experiências de xenoenxerto. NVP-AEW541, um pequeno inibidor de cinase de peso molecular de IGF1R, foi fornecido pela Novartis Pharma AG [16]. Um anticorpo monoclonal para IGF1R, IMC-A12 (Cixutumumab) foi fornecido por Imclone, uma subsidiária integral da Eli Lilly and Company.

Gene IGF2 análise da expressão em amostras clínicas de câncer de ovário

A cBioPortal para o cancro Genomics foi usado para acessar a expressão do gene e dados clínicos do Projeto Genoma Câncer Atlas (TGSF) [17]. A consulta foi realizada utilizando todos os tumores completos do conjunto de dados do ovário seroso cystadenocarcinoma (TCGA, Nature 2011), que inclui 489 casos de câncer de ovário seroso de alto grau. Para a expressão de ARNm de pontuações Z IGF2, um limiar de 1,6 desvios padrão acima da média do grupo definido IGF-elevado; todos os outros casos foram incluídos no grupo de IGF2-normal.

PCR quantitativa

Os lisados ​​celulares foram homogeneizados usando colunas Qiagen (Qiashredder Inc., Valencia, CA) e o ARN total foi isolado por RNeasy Mini kit (Qiagen). a concentração e a pureza do RNA foram avaliados utilizando um espectrofotómetro NanoDrop (Fisher Thermo Scientific), que mostra a OD 260/280 gama de proporção de 2,03-2,11. a integridade de ARN foi amostrado utilizando uma Bioanalyzer Agilent (Agilent Technologies), que mostra um intervalo NIR pontuação de 9,8 a 10. O DNA complementar foi feita através da realização de transcrição reversa (RT), utilizando o Kit de SuperScript VILO de síntese de ADNc (Life Technologies) de acordo com as instruções do fabricante, usando 1 mg de RNA total para todas as linhas de células, exceto A2780, A2780-T15 e A2780-B20, para o qual foi utilizado 2 ug de ARN total. Quantitative PCR em tempo real foi realizado utilizando um EP Eppendorf Mastercycler

realplex2

usando um método de três passos (95 ° C 10 min; seguido de 40 ciclos de 95C durante 10 s, 60 durante 20 seg, 72 ° C durante 20 seg; em seguida, para a fusão de curva de 95C 15 s, 60C para 95C ao longo de 20 min). Cada reacção utilizada uma /20 da reacção de ADNc, para a frente e para trás os iniciadores a uma concentração final de 200 nM, e PowerSYBR (Applied Biosystems, Foster City, CA) diluída em Água ultrapura (Life Technologies) para concentração final de 1X numa reacção final volume de 10 uL. Exon iniciadores de abrangência de junção (Tabela S1) foram validados por análise das curvas de fusão e eficiência de amplificação. Uma pontuação de expressão de ARNm foi calculada usando a fórmula * 1000, onde ôc

t é a diferença em C

t (limiar de ciclo) entre o gene de interesse e o gene de normalização interna,

PPIB

( peptidilprolil-isomerase B; ciclofilina B).

PPIB

foi verificada a ter níveis de expressão de mRNA estáveis ​​no parental, resistentes aos medicamentos, e transfectadas linhas celulares de ovário, incluindo: Ei, ei-T30, HEY-B20, HEY-T30 shIGF2-p, HEY-T30 shIGF2 -v, HEY-T30 shScrambled, A2780, A2780-T15, A2780-B20. A diferença média no C

valores de t quando se avalia

expressão PPIB

em comparações de pares destas linhas celulares foi de 0,2 (95% intervalo de confiança de -0,1 a 0,5). Dobra-alterações na expressão de ARNm relativa foi calculada usando o método [7]. O ADN genómico foi isolado com o AllPrep Mini Kit (Qiagen). Os iniciadores foram concebidos para abranger uma junção intrão-exão e foram validados por fusão e análise da curva de eficiência. Albumina (

ALB

) foi utilizado para normalização interna. Por matriz hibridização genômica comparativa, as células HEY foram encontrados para ter duas cópias do

IGF2

,

ABCB1

e

ALB

genes (dados não mostrados). variação do número de cópia foi determinada a partir de qPCR de ADN genómico utilizando o método e definir HEY 2 cópias [18].

Kinetics proliferação e Citotoxicidade

Para cinética de proliferação, as células foram semeadas em 6- placas de poços. A cada 24 horas, poços duplicados foram contadas utilizando um cetro Counter (Millipore). Para os ensaios de citotoxicidade, as células foram semeadas numa placa de 96 poços. Após 24 horas, as células foram tratadas com diluições em série da droga indicada, com uma concentração fixa de 1 uM NVP-AEW541 ou 10 ug /ml de IMC-A12, se indicado. Após 72 horas de tratamento, o número relativo de células em cada poço foi determinada utilizando o ensaio de Sulforodamina B [7]. A IC

50 representa a concentração do fármaco correspondente a uma diminuição de 50% no número de células calculada utilizando a curva dose-efeito.

ELISA para o receptor de fosforilação

As células foram cultivadas em meio completo para 24 horas, depois privadas de soro durante 12 horas antes da estimulação durante 10 minutos com IGF2 recombinante (50 ng /mL; Abcam) ou insulina (50 nM, Sigma), com ou sem pré-tratamento de células com NVP-AEW541 (1 uM) ou IMC-A12 (10 ug /ml) durante 2 horas. As células foram lisadas utilizando um tampão de lise baseia-NP40 com PhosSTOP (Roche) e cocktail de inibidor de protease (Sigma). Depois de quantificação de proteínas, o DuoSet IC Phospho-IGF-1 humano de R e R Phospho-insulina (R D systems) foram utilizados de acordo com as instruções do fabricante

Análise Western blot da expressão da proteína

para a análise de AKT fosforilado e total e ERK, quantidades iguais de proteína (15 a 20 ug, dependendo da experiência) foram carregados em cada pista num gel de Tris-glicina e transferiu-se para membranas de nitrocelulose, que foram bloqueados e incubados durante a noite com os anticorpos primários indicados 1:1000 diluída em tampão (LI-COR Biosciences) de bloqueio, excepto GAPDH utilizado no 1:5000 diluição. Os anticorpos primários utilizados foram: PhosphoAKT (Thr308) (Cell Signaling Technology 4056), PhosphoAKT (Ser473) (Cell Signaling Technology 4060), AKT1 (Cell Signaling Technology 2938), PhosphoERK1 /2 (Thr202 /Tyr204) (Cell Signaling Technology 4370), ERK 1/2 (Cell Signaling Technology 4695), GAPDH (Cell Signaling Technology 2118), IGF2 (Abcam AB9574). Depois de anticorpo secundário (1:10 000 anti-coelho, LI-COR Biosciences 926-32211) de incubação, as membranas foram digitalizados em um sistema Odyssey infravermelho imaging (LI-COR Biosciences) a 800 nm de comprimento. Densitometria foi feito nos arquivos TIFF medir a densidade integrada usando ImageJ, corrigindo para o fundo e normalizando a Ponceau coloração da respectiva pista.

estudos terapêuticos em xenoenxertos de rolamento Ratos

ratinhos nus atímicos fêmea ( Harlan) entre 6 e 8 semanas de idade foram injectados por via subcutânea com um milhão de células indicadas, suspenso em 100 ul de OptiMEM. O tamanho do tumor foi medido utilizando paquímetro digital e volume calculado por meio da fórmula: (comprimento * largura

2) /2. Os ratinhos foram tratados tal como descrito nas legendas das figuras. Os ratinhos foram sacrificados por anestesia com isoflurano seguido por deslocamento cervical, quando o xenoenxerto atingiu 20 mm de diâmetro, ou nos pontos de tempo especificados para análise do xenoenxerto. Hematoxilina e eosina secções de xenoenxertos foram avaliados pelo patologista estudo (Y.W.). Imuno-histoquímica para IGF2 (Abcam ab9574) foi feito em secções embebidas em parafina fixadas em formalina como descrito anteriormente para tecidos tumorais [7] e marcou pelo patologista estudo (YW).

IGF2 e IR Knockdown

O IGF2 e IR-alvo oligonucleótidos de ARNsi foram adquiridos de Life Technologies. Usando RNAiMax Lipofectamina (Life Technologies), inverter transfecção foi realizada como previamente descrito [7] em paralelo com a transfecção não segmentação de siRNA e controlos transfecção simulada. RNA foi colhida em 48 horas após a transfecção para confirmar knockdown por RT-qPCR (Fig. S2A /D em S1 Arquivo). Para as células HEY-T30, os resultados da primeira sequência de oligonucleótido IGF2 siARN testado foi mostrado numa publicação prévia [7]; validação destes resultados foi feito para este manuscrito usando duas novas sequências de oligonucleótidos única arbitrariamente nomeados siIGF2-1 e siIGF2-2. Para as células A2780-T15, foram usadas duas sequcias de oligonucleidos, que corresponde ao primeiro siARN utilizado em HEY-T30 (arbitrariamente denominado siIGF2-3), bem como o novo oligonucleótido siIGF2-1. Para knockdown estável usando o Induzível H1 Lentivirus RNAi Sistema BLOCK-iT (Life Technologies), vetores foram projetados para expressar uma shRNA alvo IGF2, ou um controlo não-alvo (shScrambled). células HEY-T30 foram transfectadas com o plasmídeo directamente ou com partículas de lentivírus, em seguida, seleccionadas com zeocina (Life Technologies). Os clones de células transfectadas com plasmídeos e células transfectadas com lentivirais foram rastreados para IGF2 knockdown. O clone com a menor expressão do mRNA IGF2 de cada grupo foi utilizado para as experiências subsequentes.

Análise do ciclo celular e apoptose

As células foram tratadas tal como descrito nas legendas das figuras. Após 16 horas, as células aderentes e flutuantes foram recolhidos. Para a análise do ciclo celular, as células foram fixadas com etanol frio a 70% durante 1 hora, em seguida, incubadas com 20 ug /ml de iodeto de propídio (Sigma) e 100 ug /ml de RNase (Fisher Thermo Scientific) em PBS. Para a análise da apoptose, a Violeta Ratiometric Membrane Assimetria Probe /Dead Cell Kit Apoptosis (Life Technologies) foi utilizada de acordo com o protocolo do fabricante. Um violeta corante excitável 4′-N, N-dietilamino-6- (N, N, N-dodecil-metilamino-sulfopropil) -metil-3-hydroxyflavone (F2N12S) foi usada para a detecção de alterações de assimetria de membrana que ocorrem durante o início apoptose, resultando em uma proporção diminuída de 585 nm a 530 nm de emissão. Simultaneamente, SYTOX (R) AADvanced foi utilizado como um corante de células mortas. Usando células não coradas e células não tratadas de controlo, foi determinada de selecção de quadrantes; viver, apoptose, e células mortas foram quantificados utilizando FlowJo (Treestar).

Droga Análise efluxo

Dois cem mil HEY HEY e-T30 células foram novamente suspensas em 1 ml quente PBS + 5% FBS . Todos os passos de incubação foram realizadas a 37 ° C na incubadora de cultura de células. Verapamil (15 uM) ou NVP-AEW541 (1 uM) foi adicionado e as amostras incubadas durante 1 hora. Em seguida, foi adicionado 50 | iM de tubulina Rastreio de reagente de verde (verde Oregon 488 Taxol, do bis-acetato) (Life Technologies) e as amostras incubadas durante 45 minutos. As células foram sedimentadas, em seguida ressuspensas em PBS + FBS a 5%, com verapamil ou NVP-AEW541 se indicado, e incubadas durante um período adicional de 20 minutos, lavadas em PBS e coradas com TO-PRO-3 (Life Technologies). As células foram imediatamente analisadas usando um FACSCanto II (BD) e FlowJo; -3 para-PRO células positivas (células mortas) foram fechado para fora e as células restantes foram representados graficamente para determinam marcado retenção de Taxol [19].

Análise Estatística

Para cada análise, os dados foram a partir de pelo menos duas experiências independentes. O número de repetições por experiência estão descritos nas legendas das figuras. As diferenças entre as médias dos dois grupos foram analisadas utilizando o teste t. Para diferenças entre três ou mais grupos, one-way ANOVA com pós-teste de Bonferroni foi utilizado. Para a análise de duas variáveis ​​independentes, foi utilizado ANOVA de duas vias com um pós-teste de Bonferroni. Para análise de sobrevivência, foi utilizado o teste logrank. Todos os valores de p são bicaudais e P 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Métodos Suplementares

File S2 contém os materiais e métodos utilizados para gerar os dados de mutação beta-tubulina (mostrado na Fig. . S1 de arquivo S1) eo IGF2 Western blot dados (mostrado na Fig. S2E de S1 Arquivo).

resultados

o nosso estudo prévio da expressão da proteína IGF2 utilizando um tissue microarray de epitelial de ovário tumores indicou que os níveis de expressão elevado do tecido de IGF2 foram associados com um intervalo reduzido para a progressão /recorrência [7]. Desde então, os dados de expressão de genes de amostras de cancro 489 estágio II-IV de alto grau clinicamente anotada seroso do ovário de O projeto Cancer Genome Atlas (TCGA) foram disponibilizados através do cBioPortal para o cancro Genomics [17]. Usando este portal de dados, testámos uma relação de expressão IGF2 e a resistência intrínseca de drogas, em que IGF2 alta foi definida como 1,6 DP acima da média, correspondente ao percentil 94-95th numa distribuição normal. Ao utilizar este ponto de corte, o tamanho do grupo de alta IGF2 aproxima da fracção de pacientes com cancro do ovário prevê venham a ter tumores resistentes aos medicamentos intrinsecamente, que se manifesta pela progressão durante ou pouco depois de completar a quimioterapia. Na nossa análise dos dados TCGA, que de facto que a expressão do mRNA de alta IGF2 no tecido tumoral significativamente correlacionado com um intervalo reduzido para a progressão /recorrência, isto é, sobrevivência livre de progressão (Fig. 1A). sobrevida livre de progressão mediana neste grupo foi 12 meses, indicativo de resistência à droga intrínseco. IGF2 alta expressão de mRNA também correlacionada com a sobrevivência global significativamente encurtado (Fig. 1B). A análise multivariada não foi ativado por este portal de dados, no entanto, em nossa publicação anterior observamos uma associação de expressão IGF2 com maior estágio e grau [7].

expressão IGF2 e sobrevivência do cancro do ovário. Usando o cBioPortal para o cancro Genomics para analisar os dados do estudo Cancer Genome Atlas of cystadenocarcinoma seroso do ovário, comparamos a sobrevida livre de progressão ea sobrevida global em pacientes com altos níveis de tumor de mRNA IGF2 (superior a 1,6 desvios padrão acima da média; a linha a cinzento) e aqueles com níveis normais de tumor de ARNm IGF2 (todos os outros pacientes; linha preta). Pacientes com níveis elevados de mRNA IGF2 tinha reduzido significativamente a sobrevida livre de progressão (A) e sobrevida global (B). (C) IGF2 expressão em linhas de células sensíveis e resistentes. Por RT-qPCR, medimos o nível de ARNm de IGF2 em seis linhas celulares de carcinoma do ovário resistentes aos medicamentos e suas três linhas celulares de origem. Todas as linhas de células resistentes a fármacos têm significativamente mais elevada expressão de ARNm de IGF2 em comparação com a sua linha de células sensíveis de origem. As barras mostram a média ± SEM de pontuação expressão de ARNm de IGF2 por pelo menos duas experiências independentes para cada linha de células, cada uma feita em triplicado, e o símbolo cima da barra indica a significância estatística comparando essa linha celular resistente, com o seu homólogo parental; * P 0,05, *** p 0,001, **** p 0,0001 por ANOVA com Bonferroni pós-teste. (D) a expressão ABCB1. Os níveis de expressão de mRNA ABCB1 foram medidos por RT-qPCR em HEY, HEY-T30, A2780 e A2780-T15. EI-T30 tem maior expressão de ARNm ABCB1 em comparação com as outras linhas celulares. As barras mostram a média ± SEM de pontuação ABCB1 expressão de ARNm, pelo menos, quatro experiências independentes para cada linha de células, cada uma feita em triplicado, (E) ADN ABCB1 número de cópias. Por qPCR realizada em DNA genómico, HEY-T30 tem um aumento de seis vezes no número de cópias de ADN ABCB1 indicando a amplificação do gene. As barras mostram a média ± SEM de duas experiências independentes, cada uma realizada em triplicado.

que anteriormente mostraram que os níveis de ARNm de IGF2 aumentar durante o tratamento agudo Taxol, e a hipótese de que a regulação positiva de IGF2 está associada com sobrevivente persistente As células que dão origem à doença recorrente resistentes aos medicamentos. Para estudar a resistência aos medicamentos no laboratório, o taxol, bem como agentes de estabilização de microtúbulos não-taxano (MSAs), ixabepilona, ​​discodermolida, e a epotilona B, foram utilizados para desenvolver linhas de células resistentes a seis distintas. Tal como determinado por PCR em tempo real, todos os modelos de linhas celulares resistentes a MSA tinha elevado de ARNm IGF2 expressão em relação à sua linha parental sensível (Fig. 1C). Uma vez que o Taxol é de longe o mais usado clinicamente entre estes fármacos, experiências subsequentes voltadas para as linhas de células resistentes ao Taxol HEY e A2780-T30-T15.

Foram avaliadas as linhas celulares resistentes a drogas de outros mecanismos de resistência Taxol [ ,,,0],20], [21]. HEY-T30 tem mRNA ABCB1 sobre-expressão (Fig. 1D) associado com a amplificação genómica de

ABCB1

(Fig. 1E), enquanto HEY tem nenhuma mudança do número de cópias de

ABCB1

. Estes resultados foram confirmados por hibridação genómica comparativa matriz (dados não mostrados). A2780-T15 foi seleccionado na presença de verapamil e não sobre-expressa ABCB1 (Fig. 1D), e nem A2780-T15 nem A2780 tem ADN número de cópias mudança de

ABCB1

(Fig. 1E). Nós não encontramos nenhuma correlação significativa entre IGF2 e expressão ABCB1 em nosso painel de linhas celulares (Fig. S3 de arquivo S1). A sequenciação de ADN revelou que A2780-T15 tem uma mutação (glicina na posição 360 é alterado para um ácido aspártico) no bolso de ligação ao Taxol de β-tubulina (Fig. S1A e S1B de Ficheiro S1), enquanto HEY-T30 não têm uma mutação na β-tubulina.

HEY-T30 proliferaram de forma semelhante em meios Taxol-livres ou meios contendo concentrações baixas de taxol (≤30 nM) (Fig. 2A). A2780-T15 proliferavam muito mais lentamente em meios Taxol-livres do que em meios contendo taxol (≤15 nM) (Fig. 2B), sugerindo a possibilidade de Taxol dependente de crescimento associado com a sua mutação β-tubulina. Quando uma dose baixa de Taxol estava presente, A2780-T15 proliferaram a uma taxa semelhante à A2780. As linhas de células resistentes mostrou resistência cruzada a ixabepilona, ​​um MSA que compartilha um local de ligação β-tubulina comum com o Taxol. perfil expandida de HEY-T30 (Fig. 2C, painel esquerdo) mostrou resistência à vinblastina desestabilizadores do microtúbulo droga e a resistência à doxorrubicina, mas a sensibilidade semelhante à cisplatina, em comparação com parental HEY. A2780-T15 (Fig. 2C, painel da direita) apresentou resistência cruzada a ambos doxorrubicina e CDDP, mas foi mais sensível à vinblastina. Hipersensibilidade a medicamentos que desestabilizar microtúbulos tenha sido observado anteriormente em uma outra linha de células resistentes à droga ancorando uma mutação β-tubulina que foi associado com a dependência de drogas de estabilização de microtúbulos de proliferação [22].

cinética de proliferação de linhas de células. As células foram cultivadas em meio completo com a concentração indicada de Taxol em placas de 6 poços, e as células dos poços duplicados contadas a cada 24 horas. (A) células HEY-T30 na presença ou ausência de 30 nM de Taxol proliferarem mais lentamente do que células HEY (p 0,05, medidas repetidas ANOVA de duas vias, o pós-teste de Bonferroni). (B) A2780-T15 na presença de 2 nM e 15 nM de Taxol crescem de forma semelhante ao A2780. No entanto, na ausência de Taxol, A2780-T15 prolifera mais lentamente, sugerindo dependência Taxol (p 0,01, ANOVA de duas vias, de Bonferroni pós-teste). Cada curva representa a média de crescimento de pelo menos duas experiências independentes, cada um feito em duplicado, cada ponto é representado como a média ± SEM. (C) IC

50 de quimioterápicos em linhas de células sensíveis e resistentes. Em placas de 96 poços, as células foram tratadas com diluições em série dos fármacos indicados e a concentração de inibição de proliferação de 50% (IC

50) determinada utilizando o ensaio SRB citotoxicidade. HEY-T30 são cross-resistente a ixabepilone e vinblastina. Não é modesta resistência cruzada a doxorrubicina, mas não a CDDP. A2780-T15 são resistência cruzada a ixabepilona, ​​e modestamente resistência cruzada a doxorrubicina e a CDDP, mas mais sensível à vinblastina. Os dados são apresentados como a média ± SEM de pelo menos três experiências independentes efectuadas com seis repetições. Os valores de p calculado pelo teste t não emparelhado. (D, E) Comparação de HEY-T30 e HEY resposta xenotransplante de Taxol. A seguir à injecção subcutânea de HEY-T30 ou HEY células, os ratinhos foram divididos em grupos de tratamento de 6 animais cada. Quando o volume médio de xenoenxerto atingiu 120 mm

3, O tratamento com taxol foi administrada na dose máxima tolerada (DMT) de 20 mg /kg por via intraperitoneal de três em três dias, durante cinco tratamentos (dias de tratamento: 0, 3, 6, 9, 12 ), resultando numa dose cumulativa de 100 mg /kg. Os animais de controlo receberam injecções intraperitoneais de diluente (5% de dextrose em água; D5W) de acordo com o mesmo esquema. Os tumores foram medidos a cada três dias, e a média ± SEM volumes dos tumores para cada grupo mostrado em cada ponto de tempo. HEY xenotransplantes responderam ao tratamento Taxol, que potencialmente suprimiu o crescimento do tumor (Fig 2D;. Frustradas linha azul). xenotransplantes HEY-T30 não respondeu ao Taxol tratamento (Fig 2E;. linha laranja pontilhada) e cresceu a uma taxa semelhante como xenoenxertos HEY-T30 tratados com o veículo. HEY Taxol vs HEY D5W no dia 19, p 0,001; teste t não emparelhado.

Uma etapa fundamental para traduzir achados laboratoriais em potenciais terapias para os pacientes é a realização de

in vivo

testes utilizando modelos animais. Como as células A2780-T15 eram dependentes de Taxol para o seu crescimento, mas HEY-T30 não foram, avaliamos HEY-T30 como modelo de xenotransplante para

in vivo

teste de estratégias terapêuticas visando resistência às drogas. Nós Taxol administrado utilizando a dose previamente determinada máxima tolerada (MTD; dose cumulativa de 100 mg /kg) [23], para avaliar a resistência aos medicamentos

In vivo

. crescimento de xenoenxerto parental HEY foi eficazmente suprimida pelo taxol, indicando sensibilidade ao Taxol (Fig. 2D). Em contraste, Taxol não conseguiu inibir o crescimento de xenotransplante HEY-T30 comparado ao veículo (5% de dextrose em água; D5W) de tratamento, indicando resistência aos medicamentos (Fig 2E.)

Para criar estratégias como alvo de droga mediada por IGF2. resistência, examinámos a expressão do receptor e activação nas linhas de células resistentes e sensíveis a drogas. estudos anteriormente publicados indicou que induz a autofosforilação de ligação IGF2 de IGF1R e o receptor de insulina isoforma A, IV-A [24], [25], resultando na activação do receptor e a sinalização a jusante para moléculas efectoras, tais como a AKT. Além disso, a elevada RI-A expressão /IGF1R foi associado com resistência a terapias anti-IGF1R, como a sinalização através de IV-A pode contornar a dependência do IGF1R [26]. Nós determinamos que a expressão do mRNA IGF1R foi maior em HEY HEY e-T30, em comparação com A2780 e A2780-T15, sem diferenças significativas entre as linhas sensíveis e resistentes emparelhados (Fig. 3A). Como mostrado na Fig. 3B, os níveis IV-A foram menores em HEY HEY e-T30 comparado ao A2780 e A2780-T15. dados em tempo real PCR também foi analisada com correção para diferenças na eficiência de amplificação entre conjuntos de iniciadores (Tabela S1 de arquivo S1), com resultados semelhantes. Por Western blot, IGF1R e IR expressão de proteína correspondia a níveis de ARNm (dados não mostrados). Assim, HEY HEY e-T30 apresentaram menores índices /IGF1R IR-A do que A2780 e A2780-T15.

(A) mRNA IGF1R de linhas de células sensíveis e resistentes. Medido por (5 experiências independentes realizadas em triplicado cada n =) RT-qPCR, os níveis de ARNm do IGF1R são semelhantes quando as linhas de células resistentes são comparadas com as suas linhas de células parentais de origem. As barras mostram a média ± SEM. (B) mRNA de IR de linhas de células sensíveis e resistentes. Medido por RT-qPCR (n = 5 experiências independentes, cada um feito em triplicado) níveis de IV-A e IV B-mRNA em HEY-T30 são significativamente diminuídos quando comparados com HEY, enquanto que os níveis semelhantes são observadas quando se comparam A2780-T15 para A2780. As barras mostram a média ± SEM, **** p 0,0001; teste t não emparelhado. (C) Phospho-IGF1R e fosfo-IR em ELISA HEY-T30. As células foram jejuadas durante a noite, incubadas com 1? M de NVP-AEW541 ou 10 ug /ml de IMC-A12 durante 2 horas, estimuladas com 50 ng /ml IGF2 ou 50 nM de insulina durante 10 minutos, submetidas a lise, e os níveis de IGF1R fosforilada e IR determinada pela ELISA. Ambos IGF2 e insulina causada 5 a 6 vezes de mudança de níveis aumentados de fosfo-IGF1R que poderia ser suprimidos por NVP-AEW541 ou IMC-A12. As mudanças na fosfo-IR após a estimulação com IGF2 ou insulina eram muito menores (fold-change 1,5). Barras retratam média ± SEM níveis dobra-alterações de fosforilação de pelo menos duas experiências independentes, cada uma realizada em duplicado. (D) Phospho-AKT e Western blot fosfo-ERK. Os lisados ​​celulares preparados como descrito em (C) foram utilizados para imunotransf erência usando AKT específicos de fosforilação de ERK e anticorpos. fosforilação de AKT na treonina 308 e serina 473 foi suprimida por NVP-AEW541 e IMC-A12, enquanto AKT total foi inalterada induzida por IGF2. Nenhum efeito foi observado em níveis de fosfo-ERK. Uma experiência representativa de duas expericias independentes é mostrado. Carga igual de proteína foi confirmada por coloração Ponceau e immunoblotting GAPDH. (E) Phospho-IGF1R e fosfo-IR em ELISA A2780-T15. As células foram preparadas de forma semelhante a (C). IGF2 e insulina causada 7 vezes e 10 vezes o aumento dos níveis de fosfo-IGF1R, respectivamente, e isto poderia ser suprimida por NVP-AEW541 ou IMC-A12. Os níveis de fosfo-IV após estimulação ou IGF2 insulina também aumentou, de 4 vezes e 9 vezes, respectivamente.