Abstract

Estudos têm sugerido uma possível correlação entre a ubiquitina E3 recém-identificado proteína anel ligase dedo 146 (RNF146) e desenvolvimento do tumor. No entanto, até agora, os estudos sobre RNF146 foram restritas a poli (ADP-ribosil) ção e ubiquitina de ligação, enquanto que o papel de RNF146 em biologia tumoral tem sido raramente relatada. No presente estudo, o papel de RNF146 no cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) foi investigada. Os resultados mostraram que a expressão de RNF146 foi aumentada em amostras de cancro de pulmão clínicos e linhas celulares. expressão RNF146 correlacionada com o tamanho do tumor, o nível de diferenciação, metástase linfática, pTNM estadiamento e prognóstico de pacientes em estágio I. expressão RNF146 foi negativamente correlacionada com a expressão Axin mas positivamente correlacionada com a expressão nuclear de β-catenina em tecidos NSCLC. RNF146 regulada negativamente a expressão de Axin em linhas celulares de cancro do pulmão e induzida a expressão e distribuição nuclear de β-catenina. A sobre-expressão de RNF146 em linhas celulares de NSCLC aumentou os níveis de cyclinD1, ciclina, e CDK4, promovido ciclo celular transições G

0 /L

1-S, e a proliferação celular regulado. A sobre-expressão de RNF146 levou a níveis supra-regulada de metaloproteinases de matriz 2 e 7 e invasividade aumentada de células de cancro pulmonar, eventos que foram mediadas pela via de sinalização /β-catenina clássica de Wnt. Em resumo, os dados do presente estudo indicam que RNF146 regulada no desenvolvimento e progressão do NSCLC por aumento do crescimento celular, invasão e sobrevivência, o que sugere que RNF146 pode ser um alvo potencial tratamento em NSCLC

citação:. Gao Y, Song C, Hui L, Li Cy, Wang J, Tian Y, et al. (2014) sobre-expressão de

RNF146

em não-pequenas células do cancro do pulmão Melhora a proliferação e invasão de tumores através da Wnt /β-catenina via de sinalização. PLoS ONE 9 (1): e85377. doi: 10.1371 /journal.pone.0085377

editor: Tanya V. Kalin, Hospital Infantil de Cincinnati Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 05 de setembro de 2013; Aceito: 26 de novembro de 2013; Publicação: 14 de janeiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Gao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do National Science Foundation da China (No. 30972967 e 30973502), Fundo de Investigação especializada para o programa de Doutorado da Educação Superior (nº 20092104110018), programa de Liaoning excelentes talentos na Universidade e Liaoning Provincial da Ciência e programa de plano de tecnologia (No. 2012225072). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

ligases E3 ubiquitina desempenham papéis importantes na regulação das funções celulares, incluindo a proliferação, a paragem do ciclo celular e apoptose. Eles também podem ter funções adicionais que dependem da identidade dos seus substratos. Por exemplo, se uma ubiquitina ligase E3 como alvo para a degradação um oncogene, pode ser considerado um supressor de tumor. Da mesma forma, se uma ligase E3 uniquitin degrada uma proteína supressora de tumor, pode ser considerado um oncogene. Muitas proteínas que contêm os domínios RING-finger possuem actividade de ubiquitina-ligase, alguns dos quais participam na tumorigénese e metástase do tumor. A proteína recentemente identificada E3 ubiquitina ligase anel de dedo 146 (RNF146) interage com poli (ADP-ribose) (PAR) através de um motivo de ligação PAR no domínio Trp-Trp-Glu (WWE). O

gene RNF146

está localizado no cromossoma humano 6q22, 33 [1]. RNF146 tem atividade neuroprotetora, devido à sua inibição da Parthanatos via ligação com o PAR [2]. RNF146 pode facilitar a reparação do ADN contra a morte celular induzida por agentes que danificam o ADN ou γ-irradiação [3]. Em resposta ao dano celular, RNF146 transloca para o núcleo e melhora a ubiquitinação e degradação de várias nucleoproteínas que participam na reparação de danos do ADN. Além disso, como um poli (ADP-ribosil) ation (PARsylation) -directed ubiquitina ligase E3, RNF146 regula a degradação Tankyrase-dependente de Axin positivamente e regula a via de sinalização Wnt [1].

A sinalização Wnt via é altamente activo em células de cancro do pulmão, levando a metástases e a proliferação destas células [4]. sinalização Wnt aberrante pode ser activados por diferentes mecanismos, e uma função principal é a de inibir a proteólise da β-catenina, que é controlada pela fosforilação [5]. Β-catenina livre pode entrar no núcleo e activar os genes alvo de Wnt. níveis de estado estacionário de Axin são muito importantes, já que esta proteína andaime inicia a formação do complexo de degradação β-catenina. Os investigadores demonstraram que a transferência de resíduos de PAR para Axin catalisada por Tankyrase leva à PARsylation de Axin [1], [6]. RNF146 participa na degradação do PARsylated Axin através do seu motivo de ligação de PAR. Esta interacção conduz à destruição do complexo de degradação β-catenina, a agregação de intracelular β-catenina, e aumento da sinalização através da via Wnt [1].

Apesar de muitos estudos sobre RNF146, a sua função exacta permanece por esclarecer em tumorigénese . No presente estudo, os papéis de RNF146 no câncer de pulmão foram investigados.

Materiais e Métodos

NSCLC amostras de tecido

amostras primária NSCLC e tecidos de controle foram coletados de 133 pacientes . amostras de pulmão normal foram obtidos a partir de tecido de pulmão mais de 5 cm a partir do local da ressecção de cancro. Procedimentos teve lugar na Quarta Affiliated Hospital da China Medical University. Os pacientes não receberam nenhum tipo de radiação ou quimioterapia antes da operação. NSCLC estadiamento foi baseada na Classificação TNM de tumores malignos, Seventh Edition [7]. O tempo de sobrevida foi calculado a partir do dia operação para a morte através da avaliação de recorrência e metástase, ou até que a última data de acompanhamento. espécimes frescos foram congelados em azoto líquido e armazenado a -80 ° C. Para experiências envolvendo tecidos humanos, a aprovação foi obtida a partir da comissão de revisão institucional da China Medical University. consentimento informado por escrito foi fornecido de acordo com a Declaração de Helsinki.

Anticorpos e reagentes

O anticorpo RNF146 policlonal de coelho anti-humano foi comprado de Abcam (Cambridge Science Park). anticorpos anti-β-catenina anti-Axin e foram adquiridos a BD Transduction Laboratories (San José, CA, EUA). Os anticorpos anti-CyclinA, anti-CyclinB, anti-CyclinD1, e anti-PRB foram de Cell Signaling Technology, Inc. (Boston, MA, EUA). Anti-CDK4, anti-CDC6, anti-ITMP-1, anti-ciclina, siAxin, siβ-catenina, e siTCF4 eram de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA). Os anticorpos contra RhoA, RhoB, RhoC, e eram de Rock1 Proteintech (Chicago, IL 60612, EUA). Os anticorpos contra CDK2, P21, da metaloproteinase da matriz 2 (MMP2), MMP7, MMP9 e eram da NeoMarkers (Palo Alto, CA, EUA). Anti-P27 e anti-P53 foram da Thermo Fisher Scientific (Fremont, CA, EUA). Os plasmídeos recombinantes superexpressão pEX4-hRNF146 e pGPHI-shhRNF146 e controle plasmídeos vazias foram construídas por GenePharma (Xangai, China). O kit anticorpo secundário imuno-histoquímica foi adquirida da Dako (Copenhaga, Dinamarca).

linhas celulares e Cultura de Células

A linha epitelial brônquica normal de células HBE, o adenocarcinoma do pulmão linhas celulares A549 humana e H1299 foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA). As linhas de células NSCLC humanas LK2, LH7, LTE e SPC foram adquiridos a partir do celular Shanghai Bank, da Academia Chinesa de Ciências. As linhas celulares foram cultivadas em Modificação de meio F-12 de Ham, Roswell Memorial Institute Park (RPMI) -1640 ou meio Eagle’s-F12 modificado por Dulbecco com 10% de soro fetal de bovino (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) contendo 100 unidades /ml de Kaighn penicilina e 100 unidades /ml de estreptomicina (Sigma, St. Louis, MO, EUA) a 37 ° C com 5% de CO

2.

imuno-histoquímico de coloração

As secções de parafina com uma espessura de 4 mm foram preparadas e coradas imuno-histoquimicamente com Envision como descrito anteriormente [8] – [9]. espécimes de parafina foram incubadas com anticorpos anti-RNF146 (1:100), anti-Axin (1:200), e anti-β-catenina (1:200) a 4 ° C durante a noite. amostras PBS-incubadas foram usados ​​como controles negativos.

Dois médicos patologia avaliou os resultados de coloração em uma escala semi-quantitativa. Cinco campos de alta ampliação foram selecionados aleatoriamente a partir de cada seção, e 100 células de tumor em cada campo foram contadas para avaliar a intensidade e amplitude de coloração RNF146. Um resultado negativo foi atribuída uma pontuação de 0 (sem coloração), coloração amarelo pálido foi registrado como 1, amarelo foi classificada como a 2, e coloração castanho escuro foi registrado como um 3. pontuações percentuais foram atribuídos da seguinte forma: 5 %, 0; 5-25%, um; 26-50%, 2; 51-75%, 3; ≥75%, 4. Duas contagens independentes foram multiplicados para obter o coeficiente de coloração do paciente, que foi classificado como “expressão de baixo” para o coeficiente de coloração 4 e “alta expressão” para o coeficiente de coloração ≥4. Axina e β-catenina foram pontuados como previamente descrito [8] – [9].

transfecção celular

As células foram plaqueadas em placas de 24 poços a aproximadamente 50% de confluência e transf ectadas com plasmídeo ou siRNA 24 horas mais tarde. A transfecção de linhas celulares de cancro do pulmão A549 e LTE foi realizada utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Para as experiências de co-transfecção, um a 1,5 ug de co-transfectadas ou vector vazio e 45 pmol de siRNA foram adicionados à mistura de transfecção. Depois de 5 h a 37 ° C e 5% de CO

2, meio completo foi adicionada à mistura de transfecção. eficiência de transfecção foi determinada por Western blot.

RT-PCR Ensaio

O RNA total foi extraído utilizando TRIzol (Invitrogen) de acordo com as instruções do Kit TaKaRa RNA PCR (Takara, Dalian, China) . expressão de GAPDH serviu como o controlo interno. As sequências iniciadoras foram: RNF146: para a frente: 5′-GGACGTCGCAGGAAGATTAAG-3 ‘e inverso: 5′-CAATGGAGGTGTCTGGTGCT-3′; Axina: para a frente: 5’-GACTTGCTGGACTTCTGGTT-3 ‘e inverso: 5′-TGTACTTTCGGTAGATGGCT-3′; p-catenina: para a frente: 5’-CTAAACAGGAAGGGATGGAAG-3 ‘e inverso: 5′-ACAGATGGCAGGCTCAGTGAT-3′; GAPDH: frente: 5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGAT-3 ‘e inverter: 5′-CCTGGAAGATGGTGATGGG-3’. Os produtos de PCR para RNF146 (376 pb), Axin (109 pb), β-catenina (221 pb) e GAPDH (153 pb) foram amplificadas com 30 ciclos de PCR.

Western Blot

As células foram lisadas em tampão contendo NaCl 150 mM, PMSF a 1% de NP-40, 0,1% de SDS, 2 ug /mL de aprotinina e 1 mM. A proteína total foi colhido, e 60 ug foram separadas por SDS-PAGE e transferidos para fluoreto de polivinilideno (PVDF) membranas (Millipore, Billerica, MA, EUA). As proteínas em membranas de PVDF foram bloqueadas com albumina 5% de soro de bovino (BSA) em salino tamponado com fosfato com Tween (PBST), incubadas com anticorpo primário a 4 ° C durante a noite, e, em seguida, incubadas com anticorpos secundários à temperatura ambiente durante 2 horas. As membranas foram reveladas com o líquido químico melhorado (ECL) (Thermo Fisher Scientific), e os resultados foram registados utilizando um sistema de bioimaging (UVP Inc., Upland, CA, EUA). os níveis de expressão da proteína foram avaliadas usando β-actina como um controlo de carga.

Coloração por imunofluorescência

Células cultivadas em lamelas de vidro foram fixadas com paraformaldeído a 4% e tratou-se com 0,2% de Triton X-100. Após lavagem com PBS, as células foram bloqueadas com soro animal não imunizado, a 37 ° C durante 30 minutos, e, em seguida, incubadas com anticorpos primários anti-RNF146 (1:100), anti-Axin (1:100), e anti-β-catenina (1:100) a 4 ° C durante a noite. Os controlos negativos e positivos foram incluídos em todas as experiências. As células foram incubadas com anticorpos secundários FITC ou TRITC-marcados (1:100, Chemicon, EUA), a 37 ° C durante 30 minutos. Após lavagem com PBS, as células foram incubadas com 0,1% de 4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) (Invitrogen) a 37 ° C durante 10 minutos. As células foram lavadas com PBS e observados sob um microscópio de fluorescência.

Ensaio MTT

As células transf ectadas e as células de controlo foram plaqueadas em placas de 96 poços em 10

3 células por poço e cultivadas durante 24 horas. A proliferação celular foi detectado com a solução de contagem de células Kit-8 (Dojindo, Gaithersburg, MD) de acordo com as instruções do fabricante. O 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT) foi repetido em 4 dias consecutivos. Os valores de densidade óptica foram medidas utilizando um leitor de microplacas (Spectra Thermo, Männedorf, Suíça) a uma absorvância de 550 nm.

-cicatrização de feridas Ensaio

Cada poço de uma placa de 6 poços foi semeada com 5 × 10

5 células, cultivadas por 24 horas, e riscado com um ponta de lança. As células foram lavadas com PBS e cultivadas em meio isento de soro a 37 ° C e 5% de CO

2. As amostras foram colhidas e as fotografias foram tiradas às 0, 6, 12 e 24 horas. Cada experiência foi repetida pelo menos três vezes e os valores médios foram calculados.

Transwell

As suspensões de células de 100 uL contendo 2,5 x 10

6 células /ml foram adicionadas à câmara superior de uma inserção Transwell, e 600 ul de meio contendo soro bovino fetal a 10% foi colocada na câmara inferior. Uma membrana microporosa de policarbonato com um diâmetro de 8 um separada a parte superior e as câmaras inferiores. As células foram cultivadas a 37 ° C e 5% de CO

2, durante 6 horas. Após lavagem com PBS, as células foram fixadas com metanol a temperatura ambiente durante 15 minutos. Finalmente, as células tratadas foram coradas com hematoxilina, foram tiradas fotografias e as células coradas foram contadas. Para medir a capacidade invasiva de células, o meio pré-arref ecido sem soro e Matrigel (BD Biosciences, EUA) foram misturados a uma proporção de volume de 1:07 e adicionaram-se para dentro da câmara superior. O volume do líquido de mistura foi de 100 ul. As células foram tratadas durante 3 horas à temperatura ambiente, e os resultados foram obtidos após as células foram cultivadas durante 24 horas.

ciclo celular Ensaio

As células foram semeadas a 5 x 10

6 células por prato de cultura de 6 cm, em cultura durante 12 horas, e transfectadas. As células foram sincronizadas por privação de soro durante 20 horas. As células foram mantidas em meio contendo 10% de soro durante 24 horas. As células foram colhidas e fixadas em etanol frio a 70%. Após lavagem com PBS, as células foram incubadas com 0,1 mg /ml de ARNase (Roche Indianapolis, IN) a 37 ° C durante 30 minutos e tratou-se com 5 mg /ml de iodeto de propídio durante 30 minutos. Finalmente, as células tratadas foram analisadas por citometria de fluxo.

Análise Estatística

Bases de dados foram criados usando o Excel. A análise dos dados foi realizada utilizando SPSS17.0. As relações entre a expressão de RNF146, Axin, β-catenina, e fatores clínicos e patológicos foram avaliados pelo teste de Fisher

χ

2

de teste e. curvas de sobrevida de Kaplan-Meier e Log-rank foram usadas para detectar e avaliar as diferenças. Outros dados foram comparados pelo

t

-teste. Dados de três experimentos independentes foram mostrados como

± s. A

P Art 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

RNF146 superexpressão em NSCLC

Para investigar a expressão de RNF146 em NSCLC, 20 emparelhado. NSCLC e não-canceroso amostras de tecido foram recolhidas, e RT-PCR e Western blot foram utilizados para analisar ARNm RNF146 e os níveis de expressão de proteína, respectivamente. Expressão de mRNA nas amostras RNF146 NSCLC foi maior do que a dos tecidos pulmonares não cancerosos (

P =

0,030) (Figura 1A). Os resultados da mancha de Western e imuno-histoquímica confirmou que a coloração expressão da proteína RNF146 foi aumentada em NSCLC (

P = 0,014

,

P =

0,000) (Figura 1B), consistente com a RT-PCR resultados. A expressão de RNF146 também foi analisada no HBE e linhas celulares de NSCLC. observaram-se diferentes níveis de expressão RNF146 entre as linhas celulares de NSCLC (Figura 1C). A expressão de ARNm e proteína RNF146 tanto na HBE e LK2 (escamosas) linhas celulares eram baixos. A expressão da proteína RNF146 na LTE (adenocarcinoma) e linhas de células LK2 (escamoso) foram moderadas, e a expressão de proteína RNF146 na A549 e linhas de células H1299 (adenocarcinoma) eram altas. Os dados indicaram que a expressão de RNF146 foi aumentada nas amostras e cancro do pulmão de células NSCLC linhas clínicos.

Detecção de ARNm e a expressão da proteína de 20 amostras RNF146 em NSCLC e de controlo por RT-PCR (A) e Western blot (B). amostras tumorais;: t N: combinado tecidos normais; M: Marcador. (C) de ARNm e a expressão da proteína de RNF146 na linha celular HBE e as linhas de células NSCLC humanas LK2, LH7 (carcinoma escamoso), H1299, LTE, A549, e SPC (adenocarcinoma). GAPDH e β-actina serviram como controlos internos. (D) Expressão e distribuição de RNF146 em NSCLC por imuno-histoquímica. D1, RNF146 não foi expressa no epitélio bronquial e alveolar normal. D2, RNF146 foi expressa no citoplasma de células de cancro do pulmão, e fraca expressão RNF146 foi detectado no epitélio brônquico adjacente. D3 e D5 mostrou coloração RNF146 fraco no carcinoma de células escamosas bem diferenciado e adenocarcinoma. D4 e D6 mostraram forte coloração RNF146 no carcinoma de células escamosas pouco diferenciado e adenocarcinoma. (E) Relação entre a expressão RNF146 eo prognóstico de pacientes com NSCLC. E1 mostrou correlação entre a expressão RNF146 e prognóstico de pacientes em estágio I (

P Art 0,05). E2 e E3, nenhuma correlação entre a expressão RNF146 e prognóstico de fase II e fase III pacientes (

P

0,05).

Para explorar o papel da RNF146 em NSCLC Além disso, o relações entre a expressão da proteína e as características patológicas clínicos foram analisados. Houve correlação entre a expressão de RNF146 e tamanho do tumor (

P

= 0,044), tipo histológico (

P =

0,005), má diferenciação (

P

= 0,002) , metástase linfática (

P

= 0,009), e estágio pTNM (

P

= 0,015). No entanto, a expressão RNF146 não foi correlacionada com a idade ou sexo dos pacientes com NSCLC (Tabela 1, Figura 1D). Além disso, a análise de sobrevivência de Kaplan-Meier demonstrou que a superexpressão de RNF146 foi correlacionada com a sobrevivência de pacientes com câncer de pulmão em estágio I (

P

= 0,016). Não houve correlação entre a expressão RNF146 e tempo de sobrevivência em todos os pacientes (

P = 0,616

) ou aqueles pacientes com estágio II (

P

= 0,437), ou fase III NSCLC (

P =

0,520) (Figura 1E).

a expressão de RNF146, Axin e Distribuição Nuclear de β-catenina

Como uma ubiquitina ligase E3, RNF146 regula a Tankyrase degradação dependente de Axin e positivamente regula a via de sinalização Wnt [1]. Para investigar a relação entre RNF146, Axin, e β-catenina, as expressões de Axin e β-catenina em 133 amostras de NSCLC foram detectados por métodos de imuno-histoquímica e correlações das proteínas foram calculados. RNF146 foi negativamente correlacionada com a expressão Axin (

P =

0,003), mas não foi correlacionada com a diminuição da expressão de β-catenina em membranas ou o aumento da expressão de β-catenina no citoplasma (

P =

0,524). expressão alta RNF146 foi positivamente correlacionada com a coloração β-catenina nuclear (

P =

0,047) (Tabela 2, Figura 2A).

(A) Expressão e distribuição da RNF146, Axin e β -catenina em NSCLC por imuno-histoquímica (x 200). Axin expressão forte e associada à membrana β-catenina correlacionada com baixa expressão de RNF146 no adenocarcinoma (A1). Axin expressão baixo e citoplasmática e nuclear-expressão de β-catenina foi encontrada em cancros escamosas com elevada expressão de RNF146 (A2 e A3). Expressão e distribuição de RNF146, Axin e β-catenina detectado por (B) RT-PCR, (C) de transferência de Western, e (D) de imunofluorescência. As células transfectadas com os vectores vazios serviram como controlos.

LTE linhas de células foram transfectadas transientemente com o plasmídeo superexpressão pEX4-RNF146 ou o controlo pEX4 plasmídeo vazio. As experiências confirmou que RNF146 foi regulada positivamente. A549 e células H1299 linhas foram transientemente transfectadas com RNF146-shRNA1, RNF146-shRNA2 ou controlar SHNC, e experimentos confirmaram que a expressão RNF146 foi reduzida (Figura 2C e Figura S1A). Além disso, os níveis de Axin e β-catenina de expressão foram analisados ​​por RT-PCR, Western blot, e imunofluorescência. Superexpressão ou knock-down de RNF146 não afetou os níveis de Axin e β-catenina (Figura. 2B) expressão de mRNA. No entanto, os resultados de Western blot indicou que a sobre-expressão de RNF146 em células de cancro do pulmão LTE inibiram a expressão da proteína de Axin e aumentou a expressão de β-catenina (Figura. 2C). Imunofluorescência confirmou, ainda, que a sobre-expressão de RNF146 diminuiu a expressão citoplasmática de Axin e aumentou a expressão de β-catenina no citoplasma e núcleo. Em contraste, a expressão reduzida de RNF146 levou a um aumento da expressão de Axin no citoplasma e a diminuição da expressão de β-catenina no citoplasma e no núcleo (Figura. 2D).

A expressão de RNF146 e a proliferação de células do cancro do pulmão

Para explorar o papel dos RNF146 na proliferação de células, as células LTE e A549 foram transfectadas com os plasmídeos, tal como descrito acima, e proliferação de células foi detectada pelo ensaio de MTT. Em comparação com o grupo de controlo e o grupo transfectado com o plasmídeo vazio, a sobre-expressão de RNF146 aumentou significativamente a proliferação celular em células de LTE, enquanto knockdown de RNF146 inibiu a proliferação celular em células A549 e H1299 (Figura 3A e Figura S1B). O ciclo celular foi analisada por citometria de fluxo, e os resultados demonstraram que a sobre-expressão de RNF146 diminuiu a percentagem de G

0

1 células /g LTE fase e aumentou a percentagem de células em fase S. Em contraste, knockdown de RNF146 em células A549 e H1299 aumentou a percentagem de células em G

0 /L

1 fase e diminuição da percentagem de células em fase S (Figura 3B e Figura S1C).

(A) ensaio de proliferação celular do MTT com sobre-expressão de RNF146 e knockdown de RNF146 shRNA-mediada. **

P Art 0,05. (B) Efeitos de RNF146 no ciclo celular analisada por citometria de fluxo. (C) Detectar a expressão da proteína do ciclo celular por Western Blot.

Proteínas reguladoras relacionadas ciclo de

resultados de Western blot também revelou correlações entre os níveis de RNF146 em células de câncer de pulmão e a expressão de células incluindo cyclinD1, ciclina e CDK4 (Figura 3C). Os dados indicaram que RNF146 regulada a expressão de cyclinD1 e ciclina e progressão do ciclo celular regulado por induzir a G

0 /G

1-S transição.

Expression RNF146 e invasão das células do cancro do pulmão

a superexpressão e knockdown de RNF146 afetou as capacidades de migração celular e invasão de células NSCLC. Cicatrização de feridas e experiências Transwell demonstraram que a sobre-expressão de RNF146 melhorada de migração e invasão celular em células LTE, e que knockdown de RNF146 diminuiu a migração celular e invasão de células A549 (Figura 4A, B, C). Resultados semelhantes foram obtidos em células H1299 em que a expressão RNF146 foi empobrecido (Figura S2, S3). Proteínas relacionadas à migração e invasão também foram detectados por Western Blot. Os níveis de MMP2 e MMP7 foram expressão aumentada nas células que sobre-expressos RNF146 LTE, enquanto que os níveis de RhoA, RhoB, RhoC, Rock1, e o TIMP-1 permaneceram inalterados. Além disso, os níveis de MMP2 e MMP7 foram diminuiu significativamente quando a expressão RNF146 foi derrubado (Figura 4D).

(A) a cicatrização de feridas ensaio em células LTE com superexpressão RNF146 e células A549 tratadas com shRNA-1 segmentação RNF146. O histograma mostra as percentagens de células que migraram nas áreas raspadas (em baixo). (B-C) Análise da migração celular e invasão capacidade no ensaio Transwell. O histograma mostra o número de células que migraram ou invadidas. (D) Western blot da migração e proteínas associadas à invasão. β-actina serviu como controle interno.

Expressão regulada por RNF146 de cyclinD1 e MMP7

Propusemos que a migração de células regulamentado RNF146 e invasão de regulação indiretamente a transcrição de genes-alvo através Axin /sinalização β-catenina. Para testar esta hipótese, nós derrubado RNF146 em células tratadas com siRNA segmentação Axin. Nós descobrimos que os níveis de cyclinD1, ciclina, e MMP7 recuperado em comparação com as células tratadas com shRNF146 sozinha (Figura 5A). A sobre-expressão de RNF146 em combinação com siRNA knockdown de β-catenina não causar níveis de cyclinD1, ciclina, ou MMP7 a aumentar, ao passo que os níveis de MMP2 ainda estavam aumentados (Figura 5B). Knockdown de TCF-4 endógena em células LTE combinados com RNF146 superexpressão não causar níveis de cyclinD1 e MMP7 para aumentar (Figura 5C). No entanto, quando RNF146 e TCF-4 foram derrubados nas células A549 simultaneamente, a expressão de cyclinD1 e MMP7 diminuiu mais dramaticamente (Figura 5D). Tomados em conjunto, os dados indicaram que RNF146 provavelmente regulada a expressão de cyclinD1 MMP7 e pela via de sinalização Wnt /β-catenina.

(A) Níveis de cyclinD1 /E e MMP2 /7 em células A549 depois de tratamento com shRNA direcionados para RNF146 e siRNA direcionado para Axin. (B) Os níveis de cyclinD1 /E e MMP2 /7 em LTE, após sobre-expressão de RNF146 e knockdown de β-catenina. (C e D) Níveis de cyclinD1 e MMP7 foram detectados após knockdown de TCF-4 endógena em células LTE e A549 com superexpressão ou knockdown de RNF146.

Discussão

No presente estudo, descobrimos que RNF146 foi superexpresso no tecido NSCLC em comparação com tecidos pulmonares normais adjacentes. O nível de expressão RNF146 mostrou correlações com diversos fatores patológicos clínicos, incluindo o tamanho do tumor, o nível de diferenciação, metástase linfática, encenação pTNM, eo prognóstico de pacientes na fase I, que são fatores importantes que representam o potencial de malignidade do câncer de pulmão. Estes dados sugerem que a superexpressão de RNF146 em NSCLC pode aumentar a metástase em câncer de pulmão, e que RNF146 pode ser um indicador de mau prognóstico na fase I NSCLC.

Os nossos dados são consistentes com os resultados de dois relatórios recentes [10 ] – [11] que RNF146 pode estar envolvido no desenvolvimento de tumores. Ouro

et al.

Descobriram um gene risco de câncer de mama na população judaica Ashkenazi localizado na 6q 22,33 em um estudo de associação do genoma. Esta localização continha dois genes,

RNF146 Comprar e eno� CoA domínio hidratase contendo 1 [11]. Outra descoberta importante foi que interagiram com RNF146 PARsylated Axin através do seu motivo de ligação de PAR, levando à degradação Axin e regulação positiva da via de sinalização Wnt. Estes resultados proporcionaram provas novo para o papel potencial de RNF146 no desenvolvimento do tumor [1], [6]. Foi indicado que os substratos RNF146 recentemente identificados básica leucina zipper factor nuclear 1 (BLZF1) e suscetibilidade ao câncer candidato 3 (CASC3) estão envolvidos no desenvolvimento do tumor e proliferação celular [12] – [13]. Estes relatórios sugerem que RNF146 pode desempenhar papéis importantes em tumores, alterando a expressão de genes ou proteínas alvo degradantes.

A via de sinalização Wnt afecta a expressão do gene e a migração celular. Tal como uma molécula importante na via de sinalização Wnt, Axin participa na formação de a /glicogénio sintase quinase 3β Axin (GSK-3β) /polipose coli adenomatosa (APC) /caseína cinase I (CKI) complexo de degradação, o que aumenta a degradação de β -catenina e inibe a proliferação do tumor, invasão e metástase [14] – [15]. Estudos anteriores estabeleceram que Axin desempenha papéis importantes em NSCLC [14]. axina expressão foi mostrada para inibir a proliferação e invasão de células de cancro do pulmão [9]. estabilização citoplasmática e acúmulo de β-catenina nuclear, um importante transdutor de sinal, são processos importantes na transdução de sinal Wnt.

Nós descobrimos que RNF146 foi negativamente correlacionada com a expressão de Axin e positivamente correlacionada com a expressão nuclear de β- catenina. coloração de imunofluorescência demonstraram que RNF146 regulada a distribuição e acumulação nuclear de β-catenina. Estudos anteriores demonstraram que a expressão nuclear β-catenina leva à perda de adesão celular. Além disso, esta proteína aumentou a transcrição de genes alvo, incluindo c-myc, cyclinD1, VEGF, e MMP7, interagindo com o factor potenciador factor de células T /linfóide, assim levando à proliferação e metástase de células tumorais [16] – [ ,,,0],17]. No presente estudo, RNF146 regulada Axin e β-catenina da via de sinalização Wnt, indicando que RNF146 afectou a proliferação e invasão de células tumorais.

O MTT e experiências ciclo celular mostraram que não apenas a proliferação celular regulado RNF146 e a progressão do ciclo celular, mas também afectou os níveis de proteínas relacionadas com o ciclo celular de expressão. Ciclina D1 regula principalmente G progressão fase

1 [18], e ciclina E aumenta G

1 /S de transição [19] – [20]. A ciclina D1 poderia interagir com CDK4 /6 e melhorar a transcrição dos genes a jusante [18]. Assim, pode concluir-se que RNF146 controla a proliferação do tumor através da regulação do ciclo celular.

Os nossos dados também mostraram que RNF146 afectou a migração e a invasão de células do cancro do pulmão, o que sugere que RNF146 tem múltiplas funções. Os resultados do teste do zero e ensaio transpoço mostrou que RNF146 aumentou a migração e invasão de células de câncer de pulmão. MMPs degradam várias proteínas da matriz extracelular, interromper barreiras teciduais para a invasão de células de tumor, e desempenham um papel chave na invasão e metástase de tumores [21]. Os dados do presente estudo revelou que MMP2 e MMP7 foram regulados pelo RNF146. A degradação da matriz e da matriz óssea extracelular por MMP2 e MMP7 foi demonstrado ser intimamente relacionado com NSCLC invasão e metástase [22] – [23]. Os dados sugerem que RNF146 pode regular a migração e invasão dos cancros do pulmão através da regulação MMP2 e MMP7.

Antes do nosso estudo, os papéis de RNF146 na via de sinalização Wnt foram confinados à degradação da Axin ea promoção da agregação nuclear de β-catenina. Porque β-catenina interage com TCF-4, depois da sua entrada no núcleo [16] – [17], a hipótese de que RNF146 poderia regular a proliferação e invasão celular através da regulação indirecta de transcrição do gene alvo através de Axin /β-catenina. Nossos experimentos mostraram que RNF146 não desempenham papéis reguladores nas proteínas a jusante cyclinD1, ciclina, e MMP7 em células com knockeddown Axin e β-catenina. Da mesma forma, a sobre-expressão ou knockdown de RNF146 não induziu alterações nos níveis de proteína alvo quando TCF4 foi derrubado. **

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0.05.

doi:10.1371/journal.pone.0085377.s003

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Acknowledgments

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