Abstract
Fundo
Nós iniciamos um estudo prospectivo para identificar alterações de transcrição associados à quimioterapia adquirida de resistência a partir de amostras pré e pós-biópsia do mesmo paciente e descobrir potenciais vias moleculares envolvidos na falha do tratamento para ajudar a orientar alternativas terapêuticas.
Metodologia /Principais achados
Um estudo prospectivo, de alto rendimento estudo de perfis de transcrição foi realizada utilizando amostras de biópsia endoscópica de 123 doentes com cancro gástrico metastático anteriores à cisplatina e fluorouracil (CF) combinação de quimioterapia. 22 pacientes que inicialmente responderam ao CF foram re-biópsia depois de terem desenvolvido resistência a CF. Uma assinatura resistência à quimioterapia adquirida foi identificada através da análise dos perfis de expressão gênica do combinado pré e pós-CF amostras tratadas.
A assinatura resistência adquirida foi capaz de segregar uma coorte separada de 101 pacientes com câncer gástrico recém-diagnosticados de acordo com o tempo até à progressão após CF. agrupamento hierárquico usando uma assinatura resistência adquirida 633-gene (seleção de funções com
P Art 0,01) separou as amostras de pacientes 101 pré-tratamento em dois grupos com significativamente diferentes tempos até à progressão (2,5 vs. 4,7 meses). Esta assinatura 633-gene incluiu a regulação positiva de
AKT1
,
EIF4B
, e
RPS6
(mTOR), genes de reparo do DNA e do metabolismo de drogas, e foi enriquecido para genes overexpressed em assinaturas de células-tronco embrionárias. Uma assinatura resistência adquirida 72-gene (um subconjunto da assinatura 633 também gene identificado em conjuntos de genes relacionados de células ES) era um preditor independente para o tempo de progressão (ajustado
P
= 0,011) e sobrevivência (ajustado
P
= 0,034) desses 101 pacientes.
Conclusão /Significado
Esta assinatura pode oferecer novos insights sobre identificação de novos alvos e terapias necessárias para superar a resistência adquirida de câncer gástrico para CF.
Citation: Kim HK, Choi IJ, Kim CG, Kim HS, Oshima a, Michalowski a, et al. (2011) Um Gene Expression Assinatura do Adquirida chemoresistance a cisplatina e fluorouracil combinação de quimioterapia em pacientes com câncer gástrico. PLoS ONE 6 (2): e16694. doi: 10.1371 /journal.pone.0016694
editor: Alfons Navarro, da Universidade de Barcelona, Espanha |
Recebido: 10 Setembro, 2010; Aceito: 24 de dezembro de 2010; Publicação: 18 de fevereiro de 2011
Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da declaração Creative Commons Public Domain que estipula que, uma vez colocado no domínio público, este trabalho pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita
Financiamento:. Este trabalho foi financiado em parte pelos Institutos Nacionais Programa Intramural Saúde, Centro de Pesquisa do Cancro, Instituto Nacional do Câncer de; pelo Cancer Center Grant Korean National 0910570 e pelo Programa de Convergência Research Center através do Ministério da Educação, Ciência e Tecnologia (2010K001121). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Compreender como tumores evoluem em um nível molecular para superar os efeitos citotóxicos da quimioterapia é um passo crítico no desenvolvimento de abordagens terapêuticas que previnam ou superar chemoresistance. No entanto, devido às dificuldades de obtenção de biópsias de tumores em série de pacientes em várias fases de tratamento, a identificação de alterações moleculares que ocorrem como tumores tornam-se resistentes à terapia tem sido um sério problema. A recolha de série de amostras de tumores sólidos, do mesmos pacientes tem sido extremamente difícil na prática clínica, mas o cancro gástrico proporciona uma oportunidade única para este propósito, uma vez que é muitas vezes inicialmente respondem à quimioterapia e endoscopia repetidas pode ser realizada para monitorizar a resposta do tumor aos quimioterapia.
neste estudo, amostras de biópsia endoscópicos foram coletadas de pacientes com câncer gástrico. Foram identificadas uma assinatura para a expressão do gene quimiorresistência adquirida à cisplatina e fluorouracil (CF) a quimioterapia de combinação, comparando amostras colhidas antes da terapia com CF amostras tomadas a partir dos mesmos doentes com a resistência do tempo para CF desenvolvidos com base em progressão clínica objectivo. Usando essa abordagem, foi possível identificar os candidatos moleculares que podem eventualmente levar ao desenvolvimento de novas terapias direcionadas para o câncer gástrico. Importante, também descobrimos que uma assinatura chemoresistance adquirida poderia identificar se pacientes com câncer gástrico recém-diagnosticados teria uma terapia CF resposta curta ou mais sustentado. Desde a assinatura resistência adquirida já é altamente representados em não-respondedores e que parece improvável que os numerosos expressão mudanças que ocorrem em um nível global evoluiria em um período relativamente curto de tempo, os nossos resultados parecem apoiar o modelo de seleção convencional, clonal para a progressão do tumor e quimiorresistência adquirida [1]. Identificar biomarcadores que distinguir pacientes com câncer que vai ou não vai beneficiar de quimioterapia citotóxica irá melhorar significativamente a gestão clínica. Embora estudos utilizando perfis de transcrição de elevado rendimento de amostras de biópsia pré-tratamento têm tentado identificar tais preditores, o desempenho destas preditores foi misturado [2]. Em parte, isto pode ser devido à dificuldade de identificar assinaturas de gene em tumores sólidos de populações com grande variação genética. Os nossos dados sugerem que a expressão de perfilação de amostras de pós-tratamento pode ser uma possível alternativa.
Alguns estudos sugeriram que os tumores que se desenvolvem quimiorresistência pode adquirir certas propriedades inerentes às células-tronco, e que o tratamento com quimioterapia conduz a um enriquecimento concomitante de câncer de células-tronco
in vitro
[3]. Demonstramos ainda que a resistência adquirida a assinatura é enriquecido para genes previamente identificados em estaminais embrionárias (ES) de assinaturas de expressão de células, o que sugere ainda que para o cancro gástrico, quimiorresistência surge da selecção de células pré-existente com determinadas características de células estaminais.
Materiais e Métodos
recrutamento de pacientes e acompanhamento
Esta é a parte de um estudo prospectivo aprovado pelo Institutional Review Board (IRB) do Hospital National Cancer Center, em Goyang, Coréia (NCCNHS01-003). Todos os participantes assinaram um termo de consentimento IRB-aprovado. Elegibilidade para a inscrição no estudo incluiu os seguintes parâmetros: 1) idade ≥ 18 anos; 2) histologicamente confirmada adenocarcinoma gástrico; 3) clinicamente documentados metástases à distância; 4) não ser o cancro gástrico doenças malignas prévias ou concomitantes; 5) sem histórico prévio de quimioterapia, ou adjuvante ou paliativa; e 6) a função adequada de todos os órgãos principais. Os pacientes que foram perdidos para follow-up antes de completar 6 ciclos de quimioterapia, exceto para doença progressiva documentada, foram excluídos das análises.
O nosso estudo prospectivo teve 2 objetivos. O primeiro objetivo, que é o foco de um outro papel [4], foi desenvolver um preditor genômica para a resposta inicial a quimioterapia, correlacionando a expressão profiling de dados de amostras pré-tratamento com o resultado clínico (
resistência intrínseca estudo
). O tamanho da amostra do estudo foi planejado com base neste primeiro objectivo. Para o conjunto de treino, 91 eventos foram estimadas a ser necessária no α = 0,001, β = 0,05, τ (desvio padrão da intensidade de log) = 0,75, e δ (razão de risco associado com uma unidade de alteração da intensidade de log) = 2. Assim, 96 amostras pré-tratamento foram coletadas a partir de agosto de 2001 a janeiro de 2005, como o conjunto de treinamento (para o
resistência intrínseca estudo
). Um segundo grupo de 27 pacientes elegíveis foi matriculado como a coorte de validação de matriz entre fevereiro de 2005 e abril de 2006, que inclui 22 pacientes tratados com CF, e 5 pacientes tratados com cisplatina e capecitabina oral (um fluorouracil pró-droga considerada equivalente a fluorouracil; CX ). terapia CX demonstrou ser terapeuticamente equivalente ao regime de CF para o cancro gástrico metastático [5].
O segundo objectivo do nosso estudo prospectivo, que é perseguido por análises apresentadas neste trabalho, foi identificar a expressão gênica assinatura para o chemoresistance adquirida comparando amostras de pós-tratamento pré e dos respondedores clínicos (
resistência adquirida estudo
). Depois de uma biópsia endoscópica inicial, todos os pacientes do estudo foram prospectivamente tratados e acompanhados. Os doentes foram tratados com cisplatina (60 mg /m
2, D1) em combinação quer com fluorouracilo (1 g /m
2 durante 5 dias; n = 118) ou capecitabina (Xeloda; Roche; 1250 mg /m
2 BID por 2 semanas; n = 5)
5 a cada 3 semanas. doses de quimioterapia foram reduzidas dependendo toxicidades e performance status do paciente. esquemas de modificação de dose específicas para o subsequente ciclo de tratamento foram a critério do oncologista assistente. O programa de tratamento para fluorouracil poderia ser reduzido à discrição do oncologista de 5 para 3 dias para os doentes idosos (≥ 70 anos) ou pacientes com um nível de desempenho baixo (Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) performance status ≥2). espirais abdominal tomografia computadorizada (TC) foram realizadas para todos os pacientes (
i., 9 semanas) a cada 3 ciclos de quimioterapia. resposta objetiva foi documentada para os pacientes com doença mensurável de acordo com critérios da Organização Mundial da Saúde (OMS) [6]. Uma resposta parcial (PR) foi definida como mais do que uma diminuição de 50% na soma dos produtos das 2 maiores diâmetros perpendiculares de lesões mensuráveis durante pelo menos 4 semanas, mas uma CT de confirmação não foi realizado rotineiramente 4 semanas após a documentação inicial do PR.
Havia 38 pacientes com PR entre 96 conjunto de treinamento (do
resistência intrínseca estudo
). Os pacientes com PR sofreu observou-se uma biópsia de seguimento na progressão da doença de tempo (
i.
, Doença progressiva de acordo com os critérios da OMS), conhecido como o “estado resistente à quimioterapia”. amostras de biópsia adequadas de tumores em um estado resistente à quimioterapia estavam disponíveis a partir de 22 pacientes com PR (57,9%). amostras de biópsia estaduais chemoresistance dos outros 16 pacientes (42,1%) não poderia ser perfilado devido ou inadequada RNA quantidade /qualidade ou a recusa dos pacientes. Não houve diferença na idade, sexo, tipo histológico, o tempo até à progressão (TTP), e sobrevivência global entre os 22 pacientes biopsiados re-e os outros 16 pacientes que tiveram PR, mas não foram re-biopsiados. As amostras foram coletadas pelo menos 2 semanas após a última dose do fluorouracil
e
antes de segunda linha quimioterapia foi iniciada, a fim de minimizar quaisquer efeitos intoxicação aguda sobre o perfil de expressão.
Duas peças de amostras de tecido da mucosa gástrica grosseiramente-normais, também foram coletadas de antro de 21 voluntários saudáveis (Tabela S1).
Identificação de uma assinatura de resistência adquirida à CF
biópsias endoscópicas foram realizadas para obter o tecido fresco . Cinco a dez peças de tecidos tumorais frescas foram obtidas a partir da porção não necróticas de tumores grandes utilizando fórceps de biópsia copo de 7,3 mm de diâmetro (Olympus FB-24K-1, Olympus, Tóquio, Japão). Em seguida, os tecidos frescos obtidos foram congelados em azoto líquido dentro de 15 minutos da primeira colheita a biópsia. As amostras de tecido contendo células de tumor, pelo menos, 50% foram processados para o ARN, como previamente descrito [7]. Um micrograma de ARN total foi amplificado e hibridado com um conjunto de cartucho HG-U133A, de acordo com o protocolo do fabricante (Affymetrix, Santa Clara, CA). Todos os dados de expressão microarray está disponível no Gene Expression Omnibus (GEO) Banco de dados (número de acesso GSE14210, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) [Atualmente, REVISOR acesso apenas: http: //www.ncbi .nlm.nih.gov /geo /query /acc.cgi de token = rtgnlocqoqeiwtw ? acc = GSE14210]. dados de microarranjos de expressão gênica foram normalizados pela Robust Multichip Média (RMA) usando R2.6. Pré e pós-CF dados de expressão de 22 respondedores rebiopsied foram normalizados, independentemente, a partir dos dados de expressão a partir de um grupo separado de 101 pacientes não-rebiopsied. dados de microarranjos foram analisados utilizando ArrayTools BRB (versão 3.6, National Cancer Institute, https://linus.nci.nih.gov/BRB-ArrayTools.html) [8].
mudanças de expressão gênica que marcaram a inicial estatuto da transcrição de tumores a partir de padrões de expressão gênica quando os tumores se tornou resistente à quimioterapia, foram determinados para os 22 pacientes com resposta inicial documentado (PR) à terapia CF. dados de microarray combinado foi comparado entre as amostras obtidas antes do tratamento e CF amostras colhidas após a resistência à terapêutica desenvolvida. Estes dados foram analisados utilizando o algoritmo de comparação de classe de BRB-ArrayTools (modelo de variância aleatória), que calcula um emparelhado
t
-teste para cada gene usando os diários de intensidades RMA-resumidas para matrizes U133A Affymetrix. Genes diferencialmente expressos entre estas 22 amostras pareadas definidos a assinatura resistência adquirida. Na seleção de recurso
P
cortes -valor de 0,05 e 0,01, foi calculado um valor P de permutação, que é a proporção de permutações aleatórias que identificam um número similar de genes importantes que são encontrados quando se comparam os verdadeiros rótulos de classe.
o tempo para progressão foi traçada pelo método de Kaplan-Meier. Um teste de log-rank foi utilizado para determinar diferenças entre as curvas de sobrevida. teste de Wald foi utilizado para avaliar a significância estatística da taxa de risco de Cox. análises de regressão multivariada foram realizadas utilizando um modelo de risco proporcional de Cox. Todas estas análises foram realizadas com SPSS (versão 15.0; SPSS, Inc., Chicago, IL). análise de regressão logística ordinal multivariada foi realizada utilizando a SAS (versão 9.1.3, SAS, Cary, NC), para avaliar a associação entre o índice preditivo de 72 gene ea resposta radiográfica.
fator de transcrição análise
análises fator de transcrição foram realizadas a olhar para o enriquecimento de metas de fatores de transcrição dos genes que compreende a assinatura resistência adquirida (BRB-ArrayTools). Todos os genes consultados neste algoritmo de análise foram catalogadas as categorias de resposta ao factor de transcrição com base experimentalmente verificado fator de transcrição de resposta. Fator de transcrição de ligação informações curadoria na transcrição Regulatory Elemento de banco de dados (TRED) [9] foi usado para eliminar alvos sem qualquer verificação experimental.
A análise de dados de microarranjos de DNA público de pacientes com câncer gástrico tratados cirurgicamente
os dados microarray publicamente acessível para pacientes gástricos tratados cirurgicamente gerados pela Stanford Functional Genomics Facility também foram obtidos a partir do banco de dados do NCBI GEO (GSE4007) e incluiu cerca de 30.300 genes comuns a esses conjuntos de dados. Os dados de microarray foram gerados e normalizada, tal como descrito em Leung
et al [10]. efeitos de lote na expressão dos genes foram removidos com sonda-wise significa centralização e dados perdidos foram imputados com o método média de vizinho mais próximo [11]. Os clones de cDNA de matriz foram anotados utilizando SOURCE (Stanford Microarray Banco de Dados) eo Entrez GeneID foi usado como o identificador de mapeamento para a matriz Affymetrix HG-U133A.
analisa comparação set Gene
O conjunto de genes ferramenta de comparação de análises de conjuntos de genes definidos pelo usuário para expressão diferencial entre as classes pré-definidas de um conjunto de dados de origem. Para cada conjunto de dados fonte, a
P
-valor é calculado para cada gene para correlacionar o nível de expressão
vs.
Tempo de sobrevivência usando um modelo de risco proporcional (ou para a expressão diferencial entre pré-definida classes, dependendo da natureza do fenótipo), gerando uma lista classificada gene de um determinado projecto BRB-ArrayTools. Para um conjunto de
N
genes, a estatística LS é definido como o logaritmo natural negativo médio do
P
-Valores dos testes univariados único gene apropriado [12]. Um resumo estatístico é calculado que resume estes
valores P
sobre o conjunto de genes definido pelo usuário; a estatística de resumo é log médio (
P
) para o resumo LS de como
valores P
diferem de uma distribuição uniforme para LS [12]. O resumo estatístico está relacionada com a distribuição das estatísticas de resumo para amostras aleatórias de
N
genes, amostrados daqueles representados na matriz. Aqui
N
é o número de genes no conjunto gene definido pelo usuário. 100.000 conjuntos de genes aleatórios foram amostrados para calcular esta distribuição. O LS
valor P
é a proporção de conjuntos aleatórios de
N
genes com menor estatística de média de resumo do que os resumos LS computados para os dados reais. Esta abordagem é utilizada para uma variedade de tipos de correlações entre os níveis de expressão de genes e fenótipo. A natureza do fenótipo (por exemplo, o tempo de sobrevivência ou indicadores binários) determina a maneira pela qual os específico para o gene de
valores P
são computadas. Um LS
P
valor menor que 0,005 é considerado significativo.
A identificação de uma assinatura específica do cancro gástrico e uma diferenciação câncer gástrico assinatura
O RNA total foi isolado a partir endoscópica congelada as amostras de biópsia da mucosa antral recolhidas a partir de 21 voluntários saudáveis e analisadas por micromatriz, como descrito anteriormente. A fim de identificar o assinatura específico do cancro gástrico, foram comparados os dados de expressão a partir das 21 amostras normais com 101 amostras de pacientes antes de amostras de quimioterapia (22 pacientes excluindo rebiopsied usados para desenvolver o assinatura resistência adquirida) utilizando algoritmos de comparação de classe BRB- ArrayTools.
dos 101 pacientes, 41 pacientes tiveram o tipo histológico intestinal de Lauren de tumores primários e 60 tiveram o tipo difuso. tumores do tipo mista foram categorizados em conjunto com o tipo difuso. Uma assinatura diferenciação foi identificada pela comparação dos dados de expressão de genes a partir das 41 amostras tipo intestinal com amostras do tipo 60 difusas usando algoritmos de comparação de classe de BRB-ArrayTools.
Geração de assinaturas de células ES a partir publicada
dados
para gerar um conjunto de genes definido pelo usuário para análises nossa comparação gene, adotamos várias listas de genes a partir do trabalho publicado de Ben-Porath
et al
[13], em que vários conjuntos de genes associados a identidade da célula ES foram compilados para as análises de comparação conjunto de genes. Um “
ES expressão Set Online” foi previamente definido por Ben-Porath
et al
[13] como genes sobre-expressos em células embrionárias humanas em pelo menos 5 dos 20 estudos de perfis [14 ]. Este ES Situado expressão foi então alterada [13], de modo que os genes da “proliferação” Gene Ontology eo cluster proliferação de cancro da mama [13], [15] foram excluídos e referido como o
ES Situado sem genes de proliferação
. Listas de genes-alvo para MYC [16], SOX2 [17], OCT4 [17], NANOG [17], SUZ12 [18], EED [18], e H3K27 [18], que são fatores-chave de transcrição em células-tronco, também foram aprovadas a partir de Ben-Porath [13]. Estes genes foram originalmente identificados em estudos de imunoprecipitação matriz cromatina [16] – [18]. Para a nossa comparação conjunto de genes análises, Entrez IDs [13] de genes alvo foram mapeados para sondar IDs definidos na matriz HG-U133A (www.NetAffx.com).
A identificação de um índice preditivo de 72 gene
Entre os 468 genes regulados positivamente no estado resistente à quimioterapia (
P Art 0,01), 72 genes únicos eram membros de pelo menos uma das 4 publicada
conjuntos de genes relacionados com células ES
( “
ES Situado sem genes de proliferação
” [13], [15], o MYC transcrição conjunto de genes alvo de factor experimentalmente validado (TRED MYC_T00140) [9], e genes alvo de MYC e SOX2 identificado por um estudo conjunto da cromatina imunoprecipitação [16], [17]). Um preditor genómico (referido como o “índice preditivo 72-gene”) foi calculado através do cálculo da combinação linear ponderada dos valores do sinal de registo destes 72 genes únicos de sobreposição entre o assinatura resistência adquirida e “
conjuntos de genes relacionados de células ES
“. A uni
t
-Estatísticas para comparar as classes (adquirida resistente à quimioterapia
vs.
Estados de pré-tratamento) foram utilizados como os pesos. BRB-ArrayTools (a previsão classe) foi utilizado para calcular o
t
-valor de cada gene. O poder preditivo do índice preditivo de 72 genes foi testada pelo tempo para progressão e sobrevivência utilizando o modelo de riscos proporcionais de Cox.
Resultados
Identificação de uma assinatura de resistência adquirida à CF
Vinte e dois pacientes que apresentaram uma resposta clínica (PR) para terapia CF foram biopsiados antes do início do tratamento e, subsequentemente, a seguir a progressão da doença após a quimioterapia. Pré e amostras pós-CF não foi significativamente diferente da percentagem de células tumorais e medidas de controle de qualidade de dados microarray (Tabela 1 e Tabela S2). intervalo médio entre os 2 biópsias foi de 8,7 meses (intervalo interquartil, 6,4-12,6). Desde a permutação
P
valores foram consistentemente inferiores a 0,05 em
P
pontos de corte para seleção de características de 0,01 e 0,05 (permutação
valores P
, 0,012 e 0,006, respectivamente), isto demonstra que a expressão do gene é significativamente diferente entre a resistente à quimioterapia, e estados de pré-tratamento. Os genes diferencialmente expressos entre o estado de pré-tratamento de 22 tumores provaram que inicialmente responsiva à FC quimioterapia e tumores dos mesmos pacientes, depois de ter evoluído para um estado resistente à quimioterapia adquiridos foram identificados como os “assinaturas de resistência adquirida”. 2.446 genes foram identificados na assinatura resistência adquirida com uma seleção de características de
P Art 0,05, enquanto que 633 genes foram identificados utilizando uma seleção de características de
P Art 0,01. A categoria funcional com maior representatividade na assinatura resistência adquirida era
da síntese da proteína
(Tabela S3; Ingenuity Pathway Analysis [www.ingenuity.com]), que inclui
AKT1
, mRNAs da subunidade ribossômica (
RPS6, RPL13, RPL14, RPL15, RPL18, RPL29, RPL3, RPL30, RPL4, RPS11, RPS19, RPS9
) e fatores de iniciação da tradução eucarióticas (
EIF4B EIF3D, EIF3E, EIF3F, EIF3H
). Akt /mTOR e Ras-MAPK módulos de sinalização são duas vias mais estudados que exibem um efeito primordial sobre a regulação de translação [19]. Dada a regulação positiva simultânea destes componentes-chave desta via (
AKT1
(
P
= 0.0012),
EIF4B
(
P
= 0,0089), e
RPS6
(
P
= 0,0009)), o PI3K /Akt /mTOR via de transdução de sinal é presumido para ser activado no estado de resistência adquirida (Figura S1). AKT1 tem sido associada a
In vitro
resistência à cisplatina [20] – [22]. inibição de mTOR também tem sido conhecido para reverter
in vitro
adquiriu resistência à terapia endócrina e inibidores de EGFR de cancros da mama e do pulmão, respectivamente [23], [24]. Desde
ERBB2
também está regulada na assinatura resistência adquirida (
P
= 0,0065),
ERBB2
pode desempenhar um papel na regulação positiva de
da síntese da proteína
genes relacionados com, através da activação da via mTOR [25].
gene do factor de transcrição definido análise de comparação indicaram que o assinatura resistência adquirida é enriquecido com alvos de vários factores de transcrição, incluindo um gene alvo MYC set (TRED MYC_T00140) [9] (Tabela S4). Isto é consistente com um conjunto de dados de microarray na literatura de que a maioria dos genes responsivos a superexpressão Myc estão envolvidos na síntese de macromoléculas, a rotatividade de proteínas, e do metabolismo, incluindo os genes 30 da proteína ribossómica de [26].
A assinatura resistência adquirida segrega pacientes de acordo com o tempo para a progressão da doença após a terapia CF, mas não é prognóstico em pacientes com câncer gástrico tratados apenas com cirurgia
Nós fato para determinar se a expressão da assinatura resistência adquirida em tumores de câncer gástrico no diagnóstico inicial foi preditivos da resposta à terapia CF. Expressão da assinatura resistência adquirida em um grupo separado de 101 pacientes com câncer gástrico não-rebiopsied foi determinada e relacionada com a evolução clínica dos pacientes, segundo a qual grande agrupamento hierárquico os pacientes foram agrupados. Em pacientes sem lesões inicialmente mensuráveis por diagnóstico por imagem, tempo de progressão (TTP) foi medido a partir do início da terapia CF ao tempo em que uma mudança na terapia foi necessária devido à progressão da doença inequívoca. agrupamento hierárquico das amostras pré-tratamento 101 foi realizada utilizando a assinatura resistência adquirida 2.446-gene. Resultado como medido por TTP era significativamente diferente entre os pacientes em cada um dos dois grupos principais. Os doentes no conjunto com a expressão aumentada dos genes regulados positivamente no estado resistente à quimioterapia teve um TTP significativamente mais curto do que os pacientes com menor expressão desses genes (log-rank
P
valor = 0,033) (Figura 1A). A fim de melhor avaliar a associação desses 2.446 genes com TTP de 101 pacientes, nós também realizada uma análise de predição de risco a sobrevivência da BRB-ArrayTools, em que todo o processo de validação cruzada de 10 vezes foi repetido utilizando 2.446 genes e um log- classificação estatística para TTP entre 2 previu grupos de risco foi obtida para cada conjunto de dados aleatórios com dados TTP embaralhadas entre os 101 pacientes [8], [27]. A permutação
P valor
para testar a hipótese nula de que não há nenhuma relação entre 2.446 genes e TTP, que é a área da cauda desta distribuição nula além do valor log-rank obtidos para os dados reais, foi estimada 0,06 , sugerindo uma significância limítrofe da associação. Os pacientes no cluster com expressão aumentada de 468 genes regulados positivamente no estado resistente à quimioterapia em
P Art 0,01 também tinha um TTP significativamente menor do que os pacientes com menor expressão destes genes (log-rank
P
valor = 0,012) (Figura 1B). Estes resultados sugerem que a assinatura resistência adquirida reflete perfil molecular real dos clones quimiorresistentes, e não efeitos de drogas não específicas.
dendrogramas agrupamento hierárquico de amostras de pré-tratamento de um conjunto separado de 101 pacientes com câncer gástrico, usando genes diferencialmente expressos entre o pré-tratamento – e quimiorresistentes-membros de 22 de respondedores rebiopsied em vários
P
pontos de corte para seleção de características. Curvas de Kaplan-Meier para o tempo de progressão (TTP) calculada para cada um dos dois grupos principais geradas por cada dendrograma são mostrados abaixo. (A) de agrupamento hierárquico de 101 amostras de pré-tratamento utilizando a assinatura resistência adquirida 2.446-gene (
P Compra de recurso de seleção 0,05). Heatmap gerado usando um
2 imagem-pseudo log com centragem gene. Curvas de Kaplan-Meier para a TTP calculada para cada um dos dois grupos principais geradas são mostrados abaixo. Os pacientes em cluster de alto risco (n = 60, alta expressão dos genes regulados positivamente no estado resistente à quimioterapia (
superior) tinha uma TTP significativamente menor do que os pacientes em cluster de baixo risco (n = 41, baixa expressão) (3,0
vs
5,0 meses;.
P
= 0,033) (B) de agrupamento hierárquico das mesmas 101 amostras de câncer gástrico utilizando a assinatura resistência adquirida 633-gene (
P Compra de. recurso de seleção. 0,01) Os pacientes em cluster de alto risco (n = 38, alta expressão de genes regulados positivamente no estado resistente à quimioterapia (
superior) tinha uma TTP significativamente menor do que os pacientes em cluster de baixo risco (n = 63, baixo expressão) (2,5
vs
4,7 meses;.
P
= 0,012)
Nós também desejava aprofundar se essas assinaturas de resistência adquirida foram preditivos de CF. resposta ou representados uma assinatura prognóstico geral que poderia prever a sobrevida de 88 pacientes com câncer gástrico que foram tratados por cirurgia sozinha e não pela quimioterapia
10. Nenhuma das duas assinaturas de resistência adquirida (2.446 ou 633 genes) foi preditivo de sobrevivência no tratados cirurgicamente pacientes com câncer gástrico, utilizando o mesmo método de agrupamento hierárquico como acima (Log-rank
P valores
, 0,84 e 0,41, respectivamente). Assim, a assinatura resistência adquirida é preditiva de resposta do paciente a CF e não apenas de prognóstico para pacientes com câncer gástrico em geral.
A assinatura ações de resistência adquirida muitas características com a assinatura resistência intrínseca, mas não com um Câncer gástrico assinatura específica ou uma diferenciação câncer gástrico assinatura
Estas assinaturas de resistência adquirida foram então comparadas com a assinatura resistência aos medicamentos intrínseca de um grupo separado de 101 pacientes não-rebiopsied, usando análise de comparação conjunto de genes de BRB-ArrayTools [12] . Resumidamente, este algoritmo calculado um
P
-valor para cada um dos 2.446 genes para correlacionar o nível de expressão
vs.
TTP desses 101 pacientes usando um modelo de risco proporcional. Em seguida, ele calculado significa logaritmo negativo natural dos
P
-Valores dos testes univariados um único gene (estatística LS deste conjunto de 2.446 genes) ea proporção de conjuntos aleatórios de 2.446 genes com menores estatística de média de resumo do que o LS resumos calculado para os dados reais (LS
P
valor). A mesma análise foi repetida para 633 genes seleccionados a
P
0,01. Consistente com os resultados do agrupamento hierárquico análises, as assinaturas de resistência adquirida foram encontrados para ser altamente enriquecida na “assinatura resistência intrínseca” de um grupo separado de 101 pacientes tratados com FC. LS re-amostragem
P
valores foram 10
-5 para ambos os conjuntos de genes definidos pelo usuário selecionados com diferentes pontos de corte para definir a assinatura resistência adquirida (
ou seja
, para 2446 e 633 genes). Genes que se sobrepõem entre assinaturas de resistência adquirida e intrínsecos estão listadas na Tabela 2. Figura 2C
b
mostra graficamente que 468 genes regulada no estado resistente à quimioterapia de 22 pacientes rebiopsied (
P Art 0,01) mostram a superexpressão concordantes em pacientes não-rebiopsied com menor TTP, enquanto que 165 genes regulados negativamente o estado resistente à quimioterapia mostrar a superexpressão concordantes em pacientes com mais TTP.
(a) de agrupamento hierárquico de amostras de doentes 101 pré-tratamento usando o “ES definir sem a assinatura genes de proliferação “. Curvas de Kaplan-Meier para o tempo de progressão (TTP) de pacientes em cada grupo gerado são mostrados no lado direito. Os pacientes em cluster de alto risco (I) (n = 44, alta expressão de “set ES sem genes de proliferação”) teve um TTP significativamente menor do que os pacientes no cluster de baixo risco (II) (n = 57, baixa expressão) (2,7
vs
4,7 meses; Log-rank
P
valor = 0,014).