Abstract

Fundo

A incidência de carcinoma papilífero de tireóide (PTC) tem aumentado de forma constante ao longo dos últimos décadas, bem como as taxas de recorrência. Tem sido proposto que a terapia dirigida física ablativo pode ser uma modalidade terapêutica no cancro da tiróide. Targeted bio-afinidade funcionalizados nanotubos de carbono de paredes múltiplas (BioNanofluid) agir localmente, para converter eficientemente a energia de luz externa para aquecer, assim, especificamente matar as células cancerosas. Isto pode representar um novo câncer modalidade terapêutica promissora, avançando para além de ablação a laser convencional e outras abordagens de nanopartículas.

Métodos

hormônio estimulante da tireóide Receptor (TSHR) foi selecionado como um alvo para células PTC, devido à sua expressão de largura. Ou anticorpos TSHR ou TSH recombinante ou purificada TSH (tireotropina) foram quimicamente conjugada com o nosso Bionanofluid funcionalizado. Um sistema de diodo laser (532 nm) foi utilizada para iluminar uma linha celular de PTC para tempos de exposição definidos. A morte celular foi avaliada usando a coloração azul de tripano.

Resultados

BioNanofluids

TSHR-alvo eram capazes de ablação seletiva BCPAP, uma linha celular PTC TSHR positivo, células, enquanto não TSHR nulos NSC-34 . Determinou-se que uma mistura 2: 1 de células BCPAP: proporção de conjugado α-TSHR-BioNanofluid e uma exposição de 30 segundo laser mataram aproximadamente 60% das células BCPAP, enquanto 65% e 70% das células foram ablacionadas usando Thyrotropin- e Thyrogen- BioNanofluid conjugados, respectivamente. Além disso, mínimo assassinato não-alvo foi observada usando controles seletivos.

Conclusão

A BioNanofluid plataforma que oferece um caminho potencial terapêutico para o câncer de tireóide papilar foi investigado, com a nossa

in vitro

resultados sugerindo que o desenvolvimento de um método potente e rápida de matar células de cancro selectiva. Portanto, o tratamento BioNanofluid enfatiza a necessidade de novas tecnologias para o tratamento de pacientes com recorrência local e metástases que estão actualmente submetidos a qualquer re-operatórias explorações pescoço, a administração repetida de iodo radioativo e, como a radiação último recurso feixe externo ou quimioterapia, com menos efeitos colaterais e melhoria da qualidade de vida

Citation:. Dotan I, Roche PJR, Paliouras M, Mitmaker EJ, Trifiro MA (2016) Engenharia multi-carbono vítreo Therapeutic Bionanofluids para seletivamente as células alvo papilar cancro da tiróide. PLoS ONE 11 (2): e0149723. doi: 10.1371 /journal.pone.0149723

editor: Valentin Cena, Universidad de Castilla-La Mancha, Espanha

Recebido: 18 de junho de 2015; Aceito: 04 de fevereiro de 2016; Publicação: 22 de fevereiro de 2016

Direitos de autor: © 2016 Dotan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. ID recebeu apoio salário da Cancer Research Fund Israel (ICRF)

Conflito de interesses:. Os autores (ID, PJRR, MP, EJM, e MAT) gostaria de divulgar para o editor e os revisores que eles também são inventores no pedido de patente seguintes: BIONANOFLUID pARA USO como um contraste, a imagem latente, desinfecção e /ou no escritório de patente agentes terapêuticos-US PCT- CA2014 /051094 sobre o trabalho apresentado aqui e em outros desenvolvimentos sobre os desenvolvimentos terapêuticos. Este pedido de patente não está em conflito com a política de dados abertos da revista sobre os dados presentes neste manuscrito ou do pedido de patente. Não há mais patentes, produtos em desenvolvimento, ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento, como detalhado em linha no guia para os autores.

Introdução

Durante a última década tem havido uma aumento significativo na incidência de câncer de tireóide [1]. Este padrão é parcialmente explicado por um aumento na detecção de pequenos nódulos encontrados incidentalmente na imagem pescoço, mas uma tendência mais ameaçador é o aumento da prevalência de maior tireóide ( 4 cm) tumores juntamente com metástases linfáticas ocultas [2]. carcinoma papilífero de tireóide (PTC) em si é responsável por aproximadamente 80% dos carcinomas da tiróide [3, 4]. Apesar de uma taxa de sobrevivência muito elevada de 10 anos de mais de 90% [3], a recorrência local ocorre em até 20% dos casos, que conduz a desafios de diagnóstico e de tratamento [4]. Além disso, as variantes agressivas do PTC, tais como células de altura, de célula colunar, insular, trabecular e variantes esclerosante difusa, embora raros, estão aumentando em incidência. Estes tipos muitas vezes necessitam de terapias agressivas associadas com numerosos eventos adversos [5, 6].

A base do tratamento PTC principal é a tireoidectomia total [3, 7, 8], geralmente seguido por radioiodine ablação (RAI) no intermediário e pacientes de alto risco [3, 7-10] e terapia levotiroxina ao longo da vida. Embora profilática esvaziamento cervical linfático central (PCND) permanece controversa, linfáticos terapêutica dissecções nó são realizadas rotineiramente [2, 11]. Para recorrente /PTC avançada, a extirpação cirúrgica é a melhor opção. No entanto, a remissão bioquímica completa com níveis de tiroglobulina negativos só é alcançada em 27% dos pacientes (muitas vezes depois de várias intervenções) [12], com uma taxa de sobrevivência de 20 anos tão baixo quanto 36% [13]. O número significativo de pacientes que não são candidatos à cirurgia podem ser sujeitos a opções de tratamento adjuvante, como a radioterapia externa (RT), que predispõem à morbidades irreversíveis [7, 14-18]. Portanto, é necessário encontrar opções de tratamento mais precisas e específicas que permitam alcançar resultados semelhantes para a doença primária e melhorar os benefícios clínicos para doença recorrente, minimizando simultaneamente morbidade.

Infelizmente, existem limitações inerentes com nosso arsenal atual de estratégias para erradicar a recorrência de tumores e há uma necessidade de descobrir novas técnicas quando se trata de doença recorrente. Nanomedicina refere-se ao uso da nanotecnologia no domínio da saúde, e que normalmente utiliza materiais desenvolvidos em dimensões em nanoescala e já provou ser extremamente eficaz como uma plataforma para entrega de qualquer energia física ou drogas, e também em aplicações de imagem [19] . Portanto, a noção de cancro terapêutica à base de nanopartículas é para contornar problemas com a farmacocinética da droga convencional e resistência, enquanto limitando os danos, sistemicamente ou ao tecido adjacente normal. Além disso, estende-se para incluir pacientes que são inoperáveis ​​com base em métodos convencionais. Com base em quimioterapias actuais, o aumento da pressão selectiva por meio da aplicação de agentes quimioterapêuticos leva a um aumento na resistência do tumor [20-22]. Além disso, as terapias convencionais físicas usadas para fazer a ablação do tecido, tal como radiação ou laser de alta intensidade de tratamentos, também danificar o tecido saudável. As nanopartículas estão a ser utilizados como agentes físicos que são capazes de amplificar ou convertendo a energia de entrada, para induzir o dano celular numa escala selectiva. Isso é para suas propriedades únicas fotônicos e comportamentos plasmonic, principalmente nanotubos de carbono, em que tais partículas absorvem a luz de forma muito eficiente e através de ressonância plasmônica converter a sua absorção de energia para geração de calor excessivo em sua superfície [23, 24].

nanopartículas bio-afinidade, aqui descritos como BioNanofluid, deve ser capaz de: 1) converter eficientemente a luz em energia calorífica, 2) ser facilmente modificados com ligandos e /ou biomoléculas para conferir especificidade, 3) prevenir a morte de células não específico, e 4) têm uma distribuição de tamanho inferior a 1 micron para permitir a perfusão tecidual. O nanomaterial que melhor se encaixa nessa descrição é nanotubos de carbono multicamadas (MWCNTs), que são estruturas cilíndricas de concêntricos [25, 26] folhas de grafeno. A disposição em camadas do comprimento do tubo grafeno e relação de aspecto grande dá uma área de superfície significativa para vários anexos biomoleculares, a criação de partículas multi-dentado, em que os anticorpos ou outros ligandos podem reconhecer múltiplos receptores de superfície celular. nanotubos de carbono multicamadas oferecem excelentes ganhos de temperatura localizadas em virtude de sua alta capacidade de absorver luz e convertê-lo ao calor, mantendo-se intacta [27-29]. O calor gerado em escalas nanométricas por nanomateriais afixadas células, irá causar hipertermia local suficiente sem aquecimento em massa de tecido não canceroso [30]. Além disso, dado que o corpo humano é transparente para o infravermelho próximo (NIR), tais partículas com um braço de direccionamento, pode proporcionar uma grande quantidade de calor localmente quando expostos à luz NIR. NIR já possui excelente penetração profundidade humana, mas pode ser prorrogado por fibra /avanços endoscópicos feitos no campo de imagens médicas que podem trazer fonte de luz NIR quase qualquer parte do corpo [31].

O objetivo deste estudo é projetar e preparar BioNanofluids conjugados para retirar PTC

in vitro

, através da criação de uma abordagem específica, com a intenção de causar danos físicos às células cancerosas no nível celular. Além disso, a eficácia de uma nova terapia-alvo foto-térmico para PTC usando esses nanotubos conjugados funcionalizados de paredes múltiplas carbono (BioNanofluid) em um modelo de linha de células de cancro da tiróide será avaliado.

Materiais e Métodos

As linhas celulares

A linha papilar carcinoma da tiróide celular (BCPAP) [32-34] foi comprado de DMSZ (Braunschweig, Alemanha). O mouse híbrido neurônio neuroblastoma-motor NSC-34 [35] linha celular foi doado pelo Dr. Neil R. Cashman.

cultura celular

células BCPAP foram cultivadas em RPMI 1640 suplementado com 10 % de FBS. células NSC-34 foram cultivadas em meio DMEM suplementado com FBS a 10% e 20% de L-glutamina. Todas as linhas celulares foram incubadas a 37 ° C, 5% de CO

2 ar humidificado em frascos de cultura de plástico (VWR, Canadá). Uma vez confluentes, as células foram recolhidas utilizando uma solução Versene (EDTA 0,48 mM em PBS), centrifugadas e diluiu-se em meio a uma concentração de 2,5 a 3,5 x 10

5 células /mL.

Anticorpos e química reagentes

Os anticorpos anti-TSHR foram adquiridos da Novus Biologicals, Canadá e Acris anticorpos Inc, EUA. Tirotrofina (TSH humano purificado phTSH) foi adquirido a partir de Bioworld, EUA. Thyrogen® (TSH recombinante ou rhTSH) foi adquirido a Genzyme Canadá Inc, Canadá. Thiolyated PEG 5000 (polietilenoglicol, MW 5000 kD) foi comprado de Immutabilis Bio, EUA. NHS (

N

hidroxissuccinimida) e EDC (etil-dimetilaminopropil-carbodiimida) foram adquiridos da Sigma-Aldrich, EUA.

Western blot

BCPAP e NSC-34 células foram recolhidas utilizando 0,05% de tripsina e lisadas utilizando um tampão de lise Repórter X. Para a análise de Western blot, 20 ug de lisado total de limpou-celular foi carregada num gel de SDS-PAGE a 10%. Os anticorpos primários foram diluídos 1: 1000 e utilizado sob protocolos sugeridos pelo fabricante. A expressão da proteína foi visualizada usando kit ECL e expostos a película.

Conjugado BioNanofluid preparação

MWCNTs Au-decorados foram obtidos a partir da Universidade McGill, no Canadá, e diluída com d funcionalizada-COOH

2H

2O para uma concentração de trabalho de 18-20 mg /L antes da conjugação, para assegurar a mono-dispersividade. COOH funcionalização foi conseguida por tratamento de plasma, um método geral para a adição de grupos funcionais em defeitos em estruturas de grafeno [36, 37]. Au decoração foi realizada por ablação de laser pulsado utilizando um laser de Nd: YAG laser focado no alvo MWCNT a uma fluência da ordem de 1 J /cm

2. O processo pode rotineiramente decorar CdSe, Au, Ag, Si, Sn e nas MWCNTs. O material criado tinha ilhas Au-revestidos (tamanho variável entre 1 nm e 5 nm como observado e medido a partir de SEM em Fig 1A) para a fixação PEG e expostos grupos COOH onde Au estava ausente. Consistência de soluções de lote foi avaliado por espectrometria de UV-vis, utilizando o pico de 260 nm para determinar a concentração consistente.

A. microscopia eletrônica de varredura (SEM) imagens de bionanofluids derivados tiol-carbono Au-rotulados COOH-funcionalizados, em duas ampliações diferentes. Au partículas definiram estruturas esféricas, com destaque para a ponta da seta. B. EDC-NHS química de acoplamento para ligar moléculas bio-afinidade, se o anticorpo ou proteína /mitogénio para o tiol-PEG-CNT. PEGilação do tiol-CNT é descrito nos Materiais e Métodos.

BioNanofluid foi modificada usando tiolado PEG (PM 5000) ao longo de 1 hora com o grupo -SH que formam a ligação Au-S, formando o base para a prevenção da absorção não específica. O material criado tinha ambas as escovas de PEG que cercam as ilhas revestidas de ouro finas e grupos COOH expostos onde o ouro estava ausente. Uma solução stock de 150 uM thiolyated PEG foi preparada em água destilada a pH 4,5. MWCNT [500 uL da solução (1 ug)] foi incubado com 200 uL da solução tiolado PEG5000 150 uM estoque em um volume final de 700 uL à temperatura ambiente durante uma hora a pH 5. A mistura foi então centrifugada durante 10 minutos a 13.000 RPM, o sobrenadante foi rejeitado e o sedimento foi re-suspenso em 350 ul de PBS (pH 7,4). O tiol-PEG-CNT foi posteriormente conjugado com a molécula alvo. A mistura de conjugação incluídas 350 uL de PEG-BioNanofluid, 90 mL (36,8 mM) de NHS, 90 ul (22,1 mM) de EDC, e 4 ug de um dos seguintes ligandos: a-TSHR, tirotropina ou TSH recombinante, com um pH final de 5.5 (ver Fig 1B). A conjugação foi deixada prosseguir durante 1 hora à temperatura ambiente. Depois de completar a conjugação, a mistura foi centrifugada durante 10 minutos a 13.000 rpm, à temperatura ambiente, o sobrenadante foi removido e os sedimentos foram lavados BioNanofluid conjugados (3 vezes) com PBS e em seguida ressuspensas em 300 ul de PBS.

celular segmentação e o tratamento a laser

100 a 200 ul de células recolhidas de fresco (contendo 250,000-350,000 células por mL) foram misturadas com conjugados de 100-200 uL, tiol-PEG-CNT /BioNanofluid ou PBS, de acordo com a experiência , num tubo de Eppendorf de 1,5 mL. As amostras foram então incubadas a 37 ° C em uma cremalheira em rotação durante 1 hora. As amostras foram então lavadas 3 vezes com PBS para remover BioNanofluid não ligado e os detritos celulares estranhas. Após lavagem, as células foram divididas em alíquotas de 25 ul em 200 ul eppendorfs estéreis, e tratou-se com uma 532 nm de 2,7 W cm

Laser /2 de alimentação. Tratamentos a laser foram realizadas utilizando incubações individuais de α-TSHR, tirotropina ou Thyrogen conjugado-BioNanofluid. As experiências foram repetidas com um mínimo de 3 repetições por concentração ou exposição ao laser tempo. As experiências de controlo foram realizadas com BioNanofluid nua IgG-conjugada, tiol-PEG-CNT (não há ligandos) ou com PBS e as células sozinho. O objectivo do controlo foi o de investigar os efeitos de cada modificações químicas e biológicas, a absorção e tempo de exposição não específica para o laser sobre as células, e também para limitar ou eliminar os efeitos secundários que poderiam causar a morte celular de tal modo que ocorre apenas quando o do laser interage com os nanotubos de carbono

imediatamente após a exposição ao laser, azul de tripano foi adicionado numa proporção de 1:. fractura célula proporção de 1 volume de cada microtubo, e o branco (vivo), as células foram contadas utilizando um hemocitómetro. As contagens foram realizadas em triplicado e cada experiência foi realizada em 3 ocasiões diferentes. A percentagem de morte celular (células vivas remanescentes) foi calculado de acordo com a equação:

BioNanofluid experiências de estabilidade

4 ° C

Os conjugados foram preparados no dia 1, e mantida. a 4 ° C até o dia 21. as experiências foram realizadas por uma semana inteira (dias 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7), e depois continuou nos dias 10, 14 e 21. células BCPAP foram expostos ao 532 nm do laser para 30 segundos, a uma 2: células proporção de 1: BioNanofluid. As concentrações dos conjugados e não conjugados BioNanofluid foram medidos usando o espectrómetro de UV-VIS, para garantir a equivalência da concentração, utilizando uma solução de igual absorvência.

-20 /-80 ° C.

Os conjugados criados no dia 1 foram divididos em alíquotas e mantido a -20 ° C ou -80 ° C. Os experimentos foram realizados nos dias 1, 5, 7 e, em seguida, a cada semana para até 6 semanas. BCPAP células foram expostas ao laser de 532 nm durante 30 segundos a uma mistura 2: 1 de células: proporção de conjugado. Da mesma forma, as concentrações dos BioNanofluid conjugada e não conjugada foram medidos usando o UV-VIS espectrômetro.

Resultados

BioNanofluid características

A física óptica de nanotubos de carbono têm sido estudadas e descrito noutro local [38]. Em suma, eles têm o maior coeficiente de espécies de nanopartículas absorção e uma absorção de banda larga que atenda às regras de design. A disposição em camadas do comprimento do tubo grafeno é na gama do micrómetro, conferindo uma proporção muito grande para vários anexos biomoleculares, a criação de partículas multi-dentado, em que vários receptores de superfície celular podem ser reconhecidos por anticorpos ou outros ligandos. nanotubos de carbono multicamadas (MWCNTs) oferecem um excelente método de geração de calor altamente localizado em virtude de sua alta capacidade de absorver a luz e convertê-lo ao calor, mantendo-se intacta [27-29]. Esta é uma propriedade dos materiais à base de grafeno, que exibam absorvância de luz de banda larga, sendo capaz de absorver um muito largo espectro de cores claras e ser capaz de converter essa energia com alta eficiência. Isto é demonstrado pela cor preta que os nanotubos de carbono exibem. Com absorvância de luz, a energia do fotão promove um electrão para um nível de energia mais elevado a partir do estado fundamental, a perda de que a energia pode ocorrer tanto nas emissões de foto-luminescentes fracos e processos intersistema pequeno, mas a transferência fundamental de energia para o circundante materiais de carbono é sob a forma de energia térmica. Assim, o calor gerado em escalas nanométricas por MWCNTs funcionalizada-bio afixadas células seletivos /alvo, irá causar hipertermia local rápida e suficiente, sem “aquecimento em massa” de tecido vizinho potencialmente sensíveis. Anteriormente, as nanopartículas de ouro com as suas propriedades de absorção plasmonic têm sido utilizados para converter a luz para aquecer e induzir a morte celular em tumores [25]. A grande fluxos de luz ou modulações pulso de luz ultra-curtos necessárias para atingir altas temperaturas [39] necessita de exposição prolongada de 5 a 15 minutos [40] e causar danos prejudiciais para circundante de células não-cancerosas.

O material de base do BioNanofluid é COOH funcionalizado nanotubos de carbono de paredes múltiplas (comprimento que varia de 0,25 ^ m a 10 um, com um diâmetro de 25-50 nm) com ouro (Au) sendo escassamente revestido como uma modificação adicional, foi gerado através de amida ligações tiol para ligandos químicos e biológicos. Imagens de COOH-funcionalizados MWCNTs Au-decorados foram realizadas utilizando microscopia eletrônica de varredura (Fig 1A).

TSHR alvo de BioNanofluid para linhas de células PTC

receptor do hormônio tireoideano estimulante (TSHR) foi escolhido para sua expressão robusta, tanto normal, assim como em células de cancro da tiróide diferenciadas [41-44], tal como evidenciado por estudos que mostram não haver diminuição da regulação de TSH-R em células de cancro da tiróide diferenciadas [45], enquanto outros mostraram TSHR sendo sobre-expressos em carcinomas e adenomas benignos, em comparação com o tecido normal da tireóide [43]. O acessório de TSH ao seu receptor estimula o crescimento celular e a proliferação, auxiliando assim na progressão PTC [46]. Isso fornece uma explicação de por que a levotiroxina é prescrita em doses que suprimem TSH, ou seja, de modo a impedir o crescimento de micro-metástases e /ou tecido tireoidiano remanescente após a terapia convencional para o câncer de tireóide. Além disso, a expressão robusta do TSHR, sendo ubíqua para tirócito, ainda serve como um importante e persistente regulador fisiológico e marcador na doença metastática primária e com a capacidade de segmentar os conjugados BioNanofluid para um potencial terapêutico.

para avaliar o potencial de segmentação TSHR, uma linha celular que expressa PTC TSHR-positivo (BCPAP) foi encontrado e incubadas com dois diferentes α-TSHR-BioNanofluid utilizando anticorpos TSHR de fornecedores diferentes (Figura 2). Ambos os anticorpos fornecedor apresentaram taxas de matar células semelhantes e significativos de 62 ± 5,6% (Ab # 1 -Acris anticorpos) e 62 ± 5,1% (Ab # 2 -Novus biológicos), com valores de p de 0,000148 (Ab nº 1); e 5,74 x10

-5 (Ab # 2), quando comparado com IgG-BioNanofluids. Os anticorpos sozinhos, IgG-BioNanofluid, ou não conjugada tiol-PEG-CNT mostrou um potencial mínimo de matar células

Dois anticorpos específicos TSHR, adquiridos a partir de diferentes fontes (Ab nº 1, Acris Antibodies;. Ab nº 2, Novus Biologicals ) foram conjugados com a tiol-PEG-nanotubos de carbono, juntamente com IgG de coelho e rato-tiol-PEG-CNT conjuga como controlos não específicos para a segmentação de morte celular de células PTC BCPAP. Outras condições de controlo incluem PBS, partículas CNT e anticorpos sozinhos. Os resultados são apresentados como% células vivas, após o tratamento a laser, seguido por coloração com azul de tripano para definir mortos a partir de células vivas. α-TSHR-Bionanofluid conjugados significativamente (Ab nº 1, p = 0.000148; Ab nº 2, p = 5,74 x10

-5) células BCPAP mortos vs. conjugados de IgG-bionanofluid. Todos os outros controles não apresentaram células significativas matando taxas vs. IgG bionanofluids.

BioNanofluid otimizações

A fim de atingir uma taxa máxima de matar células com uma ocorrência mínima de células não-específica morte, procedeu-se a otimizar as nossas condições para explicar a concentração de células para bioNanofluid e duração do tempo de exposição do complexo de células bionanofluid ao laser

primeiro, avaliamos quatro relações diferentes (4:. 1, 2 : 1, 1: 1 e 1: 2) de células para BioNanofluid conjugados. A 2: célula 1 a proporção BioNanofluid rendeu 58,9% (± 2,3) a taxa de morte celular por α-TSHR-BioNanofluid, 65,1% (± 2,1) para Tireotropina-BioNanofluid, e 72,4% (± 3,52) para Thyrogen-BioNanofluid (Fig 3A ). Além disso, a tiroglobulina BioNanofluid superou tanto α-TSHR- e tirotropina-BioNanofluid na proporção de 2: 1. O aumento do conteúdo BioNanofluid para uma mistura 1: 1 ou 1: 2 (células: BioNanofluid) rácio causada 47,1% (± 7,65) e 69,0% (± 4,52) a morte celular, respectivamente, das taxas de matança não-alvo celulares no CNT nanopartículas controlo sozinho grupo. Este aumento da morte celular, a concentrações mais elevadas de nanopartículas não conjugadas refere-se a um aumento na retenção de partículas na célula por associações de superfície de células não-específicos, que são prevalentes em todas as concentrações MWCNT. Portanto, uma maior concentração /rácio de retenção de partículas do grupo não-específica é suficiente para gerar numerosos efeitos indesejáveis ​​grandes quantidades de aquecimento matando assim as células. Além disso, a morte relativa adicional célula de direccionamento não específica dos conjugados α-TSHR-BioNanofluid no 1: 1 [56,2% (± 8,70), p = 0,1501] ou 1: 2 [61,8 (± 21,2), P = 0,681] grupo de relação não foi significativa.

incluídos nestas condições experimentais são, α-THSR-, Thyrogen- e conjugados-PEG-CNT tirotropina-tiol purificados. As condições de controlo incluídos PBS e CNT sozinho. A. Determinação do celular ideal de conjugar razão BioNanofluid para alcançar a máxima alvo morte celular BCPAP específico. tempo de exposição do laser foi de 30 segundos para todas as condições. Os rácios são representados como o volume: razões de volume, assim, para uma proporção de 1: 1, 100 uL de células (de 250,000-350,000 células por ml) foram misturados com 100 ul de conjugado de 2-BioNanofluid concentração ug /mL. B. exposição óptima experiência determinação do tempo. BCPAP células foram expostas a tratamento com laser durante 20, 30, e 40 segundos, na proporção de 2: célula proporção de 1: conjugated- ou não conjugado PEG-tiol-CNT

Tempo de exposição experiências foram realizadas com todos. conjugados para determinar a maior taxa de morte celular sem perda de especificidade, ou seja, altas taxas de morte não-alvo de células (Fig 3B). Quarenta segunda exposição rendeu 67,8% (± 4,4) morte celular (α-TSHR), 67,8% (± 5,6) (tirotropina) e 80,1% (± 5,1) (Thyrogen). Trinta segunda exposição rendeu 59,4% (± 1,3) matando (α-TSHR), 64,9% (± 5,8) (tirotropina) e 75,2% (± 3,5) (Thyrogen). Vinte segunda exposição rendeu 48,5% (± 4,75) (α-TSHR), 52,9% (± 6,8) (tirotropina), e 65,8% (± 7,5) (TSH recombinante). Embora as maiores taxas de morte celular foram obtidos com tempos de exposição mais longa (40 s 30 s 20 seg), para uma morte não-alvo no grupo de controlo BioNanofluid com 40 segundo tempo de exposição foi de 32,7% (± 11,6), reflectindo novamente o questão de lidar com a de células não-específico de matar através de re-investigação do PEG-modificação. Portanto, uma segunda vez 30 exposição correspondeu à maior taxa de morte celular específica. No entanto, quando a exposição a laser foi aumentada por um segundo intervalo de dez, causou aproximadamente 2,5 vezes a (morte celular de 12% a 30 segundos versus morte celular de 33% a 40 segundos de exposição à radiação laser) quantidade de morte celular não específica na ONU grupo controle -conjugated CNT. Isso reflete o ponto de viragem entre a entrega da temperatura escala nano e o tempo que leva para BioNanofluid ao calor suficientemente granel uma suspensão de células. Estudos anteriores examinaram o efeito da potência do laser e tempo de exposição necessário para transferir energia suficiente que conduz à destruição da célula. Por exemplo, um estudo de células Daudi tratadas com tempos de exposição de 7 minutos, e obteve-se a morte celular superior a 90% [47]. Outros estudos tratadas de câncer de mama, câncer de cólon, carcinoma hepatocelular e linhas de células Daudi por 3 minutos ou mais [48-50]. Embora alguns dos estudos acima mencionados usados ​​nanotubos de carbono de parede única (SWCNT) com características fototérmicos definidos, descobrimos que mesmo com um pequeno aumento de 10 segundos, o uso de MWCNT demonstrou mais danos colaterais. Nossos resultados sugerem que a preparação técnica e de partículas do MWCNT utilizada para este experimento mostram uma maior eficiência na transferência de calor foto-térmico de uma forma específica de células.

-alvejado TSHR seletividade BioNanofluid e especificidade

para avaliar tanto a selectividade e especificidade do BioNanofluid TSHR-alvo, foram selecionados para realizar os experimentos de ablação celular simultaneamente, tanto a TSHR positivo e linha celular negativa TSHR. Como BCPAP é um TSHR positiva expressar linha celular, descobrimos que a linha celular do neurônio motor do mouse NSC-34 é nulo para a expressão TSHR (Fig 4A). Portanto, nós testamos com α-TSHR-, Thyrotropin- e Thyrogen-BioNanofluids contra ambos BCPAP e NSC-34 células (Fig 4b). Usando um 2: células proporção de 1: BioNanofluid e 30 segundos, descobrimos que o nosso direcionamento seletivo de TSHR podem especificamente e significativamente discriminar entre TSHR expressar e não expressam linhas celulares

A.. TSHR expressão de células BCPAP e NSC-34 foi determinada por análise de transferência de Western, utilizando o anticorpo específico TSHR. BCPAP foram positivas para a expressão TSHR, enquanto que as células NSC-34 foram nulos. B-actina foi utilizado como um controlo de carga. B. BCPAP e celular NSC-34 foram incubadas α-THSR-, Thyrogen- e conjugados-PEG-CNT tirotropina-tiol purificados. condições de controle incluídos IgG-tiol-PEG-CNT, PBS e CNT sozinho. Todas as condições foram realizadas em 2: 1 de células: rácio bionanofluid e 30 segunda exposição a laser. As células mostraram BCPAP ~ 60% para ~ 73% de células com matando todos TSHR alvo conjugados bionanofluid, ao passo que a morte celular mínimo observado com o controlo de outras condições. A linha de células NSC-34 mostrou a morte celular insignificante em todas as condições.

BioNanofluid estabilidade

Os experimentos foram realizados para avaliar a atividade dos BioNanofluids TSHR-alvo, avaliando a sua estabilidade sob condições de armazenamento prolongado. Um lote de α-TSHR-BioNanofluid foi criado e armazenado a 4 ° C durante 21 dias, ou -20 ° C e -80 ° C durante 6 semanas. O lote de α-TSHR-BioNanofluid armazenado a 4 ° C, foi avaliado quanto à sua actividade para a ablação de células BCPAP todos os dias ao longo de um período de 1 semana, e em seguida, repetido nos dias 10, 14 e 21 (Figura 5A). α-TSHR-BioNanofluid começou a perder a eficácia por dia 5, com a sua capacidade de fazer a ablação de células BCPAP passando de 60% para 40%, enquanto que os conjugados tiroglobulina BioNanofluid perdido eficácia no dia 6. Ambos α-TSHR- e tiroglobulina BioNanofluid pareceu plateau de ser 40% eficaz até a conclusão do experimento, sugerindo continuou, mas impedido seletividade celular. Pode-se supor que o desempenho irá diminuir com a desnaturação dos ligandos de proteína ao longo de um curto período de tempo quando armazenado em condições instáveis ​​de 4 ° C. No entanto, embora nada pode ser directamente inferido como a TSH recombinante ou estrutura α-TSHR, as concentrações do BioNanofluid armazenados a 4 ° C foram estáveis ​​como medido por UV /VIS espectrómetro antes da mistura com as células. Como ligando-BioNanofluid UV /VIS absorvância permanece constante independentemente do potencial de desnaturação, sugere-se que dá a absorvância da estrutura combinada a 260 nm (absorção a este comprimento de onda é comum a proteínas e os nanotubos de carbono) que pouca ou nenhuma perda de ligando ou de nanotubos de carbono, devido à responsabilidade do apego amida ou degradação CNT razões para o declínio da atividade (ver S1 Tabela).

a. α-TSHR- e Thyrogen®-tiol-PEG-CNT conjugados foram preparadas no dia 1 e foi mantida a 4 ° C durante até 21 dias. Os conjugados actividade foi avaliada por ensaio de morte celular de células BCPAP (como descrito acima). B. De modo semelhante, os conjugados α-TSHR- e Thyrogen®-tiol-PEG-CNT foram preparadas no dia 1 e foram mantidas a -20 ° C ou -80 ° C durante até 6 semanas. atividade conjugados foi avaliada por matar ensaio de células no dia 5, dia 7, e cada semana para até 6 semanas.

Uma experiência semelhante foi realizada mais de 6 semanas, com a BioNanofluid armazenadas a -20 ° C ou -80 ° C (Fig 5B). BCPAP experimentos de ablação de células foram realizados nos dias 1, 5, 7 e semanais, por até 6 semanas. Os resultados revelam a estabilidade da actividade BioNanofluid em ambas as condições de -20 ° C e -80 ° C de armazenamento, como observado por percentagens de ablação celular para o α-TSHR-BioNanofluid e ainda manter 60% de eficácia, e a tiroglobulina BioNanofluid possuindo 65% de eficácia, ao longo de 6 semanas da experiência. As concentrações MWCNT conjugados e não-conjugados foram medidos em paralelo para cada experiência, e todas apresentaram concentrações estáveis.

Discussão

Existem limitações inerentes no tratamento de câncer de tireóide recorrente. Embora a maioria dos casos são tratados com Tireoidectomia, seguido por terapia de TSH-supressivo com levotiroxina e iodo radioactivo em casos seleccionados; cancro da tiróide recorrente apresenta um desafio terapêutico. O paradigma do tratamento do cancro da tiróide e recorrência fornece um quadro adequado para estudar a aplicação de agentes físicos molecularmente direcionados. terapia térmica foto mediada por Nano está ganhando força na forma de agentes físicos específicos que tratam uma variedade de cânceres. O desafio crítico para o câncer de tireóide é entregar um agente que não tem como alvo apenas as células tumorais, mas também dirige as células da tireóide remanescentes normais. Neste estudo, o objetivo foi avaliar a eficácia de uma terapia física alvo inovador usando nova engenharia bio-afinidade nanotubos de carbono funcionalizados, ou conjugados BioNanofluid, a fim de demonstrar

in vitro

, a eficácia da segmentação TSHR e ablação