Abstract

biomarcadores de câncer facilitam o rastreio ea detecção precoce, mas são conhecidos por apenas alguns tipos de câncer. Nós demonstramos o princípio da indução de tumores a secretar um biomarcador de soro utilizando um vector de entrega de genes que tem como alvo administrados sistemicamente tumores para a expressão selectiva de uma cassete de engenharia. Nós explorada replicação tumor-selectiva de um vírus condicionalmente replicante herpes simplex (HSV) combinado com um promotor virai tardio dependente de replicação para alcançar expressão de biomarcadores tumorais selectiva, como exemplo de um vector de entrega de genes. a replicação do vírus, citotoxicidade e biomarcador de produção foram baixas em humano normal de repouso queratinócitos do prepúcio e rica em células cancerosas

in vitro

. Após a injecção intravenosa do vírus 90% dos ratinhos portadores de tumores exibiram os níveis mais elevados de marcador biológico do que os ratos que não incidem tumorais e sobre a necropsia, foram detectados vírus exclusivamente nos tumores. A nossa estratégia de tumores forçando a secretar um biomarcador de soro poderia ser útil para o rastreio do cancro em doentes de alto risco, e, possivelmente, para a monitorização da resposta à terapia. Além disso, porque os vectores oncolíticos para entrega de genes específicos de tumor são citotóxicos, que podem completar nossa estratégia de rastreio como um agente de “theragnostic”. A abordagem rastreio do cancro apresentada neste trabalho introduz uma mudança de paradigma na utilidade de entrega de genes que prevêem a ser melhorado por vetores alternativos visando a entrega do gene e expressão aos tumores. Refinando esta abordagem vai inaugurar uma nova era para o rastreio do cancro clínica que pode ser implementado no mundo desenvolvido e subdesenvolvido

Citation:. Browne AW, Leddon JL, Currier MA, Williams JP, Frischer JS, Collins MH, et ai. (2011) Cancer Screening por Sistêmica Administração de um Gene Expression Entrega Vector Encoding Tumor-seletiva segreg�el Biomarcador. PLoS ONE 6 (5): e19530. doi: 10.1371 /journal.pone.0019530

editor: Syed A. Aziz, Health Canada, Canadá |

Recebidas: 1 de março de 2011; Aceito: 31 de março de 2011; Publicado em: 11 de maio de 2011 |

Direitos de autor: © 2011 Browne et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo CancerFree Crianças Pediatric Cancer Research Alliance (AWB) e prêmio NIH 1R01-CA114001-01A2 (TPC). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

detecção precoce do câncer é vital para melhorar as taxas de cura, porque o estágio do câncer prediz prognóstico. biomarcadores de sangue associada a cancro foram identificadas em algumas cancros, tais como o antigénio específico da próstata (PSA) no cancro da próstata e alfa fetoproteína, em alguns cancros do fígado e da linha germinal. Biomarkers não foram identificados para a maioria dos cancros pediátricos e muitos cancros adultos. Inovações em transferência de genes sistêmica a perspectiva de entrega e ativação de genes que codificam biomarcadores facilmente detectáveis ​​em células tumorais que não produzem marcadores biológicos conhecidos seletivamente. Buscou-se desenvolver uma estratégia de rastreio do cancro prototípico pelo qual a informação genética que codifica para um biomarcador soro universal para o cancro seria injectado num doente sistemicamente, entregues e expressos nas células tumorais de uma forma selectiva de tumores. Os tumores seria efectivamente ser forçado a secretar um biomarcador de soro, que pode então ser medido no sangue ou urina, como um teste de rastreio, enquanto os pacientes livres de tumor que mostram nenhuma ou apenas baixos níveis de biomarcador após a administração sistémica do vector de entrega de genes (Fig. 1a)

(a) Passos para a estratégia de rastreio do cancro são as seguintes:. 1)-alvo cancer vírus Herpes Simplex (HSV) é injetado sistemicamente. 2) Engineered HSV replica selectivamente em tumores ao ser apuradas a partir de tecidos não cancerosos saudáveis. 3) biomarcador é produzido selectivamente em tumores. 4) As amostras de sangue são recolhidas e analisadas para os níveis dos biomarcadores. 5) Os níveis séricos de exogenamente entregues biomarcador são mais elevadas em ratinhos portadores de tumores do que os ratos livres de tumor saudáveis. (B) os mapas gene para o tipo selvagem HSV e da novela recombinante RQ-M38G.

administrada exogenamente biomarcadores codificados por genes exigem a entrega gene alvo-tumoral e /ou expressão. Segmentação de pequenas moléculas e partículas de tumores pode ser conseguido por aumento da permeabilidade passiva e de retenção (EPR) [1], [2], [3], a segmentação activa orientada pelo ligando [4], [5], [6], [7 ], tumor dependente de microambiente segmentação [8], [9], [10], ou uma combinação de cada um [11]. Os vírus são de ocorrência natural nanopartículas optimizados para entregar a informação genética para as células-alvo. A principal vantagem de vírus mais de vectores não virais para a entrega de ADN é a sua inerente predilecção para a replicação em tumores e consequente amplificação de sinal.

O vírus do herpes simplex (HSV) do tipo 1 é um vector de entrega de genes modelo porque pode infectar uma ampla gama de tipos de células humanas, transduzir tanto células em divisão e quiescentes de forma eficiente, ser manipulado para expressar produtos de transgenes, aceitar transgenes accionados por promotores heterólogos ou homólogos, é epigenômico, tem produção escalável, e pode ser seguramente controlado com drogas antivirais [ ,,,0],12]. mutações seletivos em genes HSV conferem replicação viral câncer selectivo. A mutação nos genes que codificam para o HSV subunidade grande da redutase de ribonucleótidos (ICP6 /L

L39) e a proteína virai tardia ICP34.5 (γ

134,5) limita a replicação viral robusta para tumores [13], [14], [ ,,,0],15], [16] e foram mostrados para ser seguro em ensaios clínicos. A activação do estrito de genes tardios virais L

L38 é dependente anterior activação sequencial dos genes imediatos precoces e virais e factores de transcrição celular [17] e o L

promotor L38 (L

L38p) foi demonstrada para ser activado selectivamente em células cancerosas no contexto da replicação competente γ

134,5

– /- mutantes de HSV [18]. A dependência da expressão de genes tardios após activação por genes precoces faz L

L38p um forte candidato para a entrega de transgenes às células cancerosas com expressão selectiva no contexto de um duplo mutante de HSV falta de ICP6 e γ

134,5.

desenvolvemos um HSV como um vector de entrega de genes de exemplo para induzir a secreção de biomarcador selectivamente a partir de tumores. Outros têm incorporado genes que codificam biomarcadores segreg�el a vírus oncolytic como repórteres para a atividade do vírus [19], [20], [21], [22] e cassetes de genes para não-invasiva de monitorização virais entregues genes [23]. genes iodeto de sódio symporter codificados em oncolytic vírus também facilitar a medicina nuclear e tratamento em tumores infectados [24], [25]. Recentemente, Gaussia luciferase (glic) foi identificado e desenvolvido como uma molécula repórter novo e poderoso [26] que é facilmente secretada a partir de células tornando-se útil tanto para o

in vitro

in vivo para aplicativos onde

e cinética de expressão são de interesse. Nós empregamos glic como um biomarcador de exemplo para esta prova de princípio, porque glic é 1000 vezes mais brilhantes do que outras luciferases, é mais sensível do que a fosfatase alcalina segreg�el, ​​e é detectável no sangue e na urina

in vivo

[27], [ ,,,0],28]. Utilizando uma abordagem de recombinação dirigida [29], nós desenvolvemos um mutante de HSV, RQ-M38G, com glic sob o controlo do promotor virai tardio L

L38 (Fig. 1B).

Procuramos avaliar nossa engenharia vector de entrega de genes virais em modelos de animais para vários tipos de tumores diferentes formada locais diferentes: por via intraperitoneal, subcutânea, intramuscular e intra-renais tumores ortotópicos. Após a injecção sistémica do nosso vector de entrega de genes (RQ-M38G) no sangue de murganhos portadores de tumor, foi observado RQ-M38G produzir citotoxicidade e biomarcador produção dependente de células do cancro. Observamos, também, vários casos em que RQ-M38G foi capaz de forçar encargos tumorais microscópicas para produzir biomarcador de sangue detectável. Estes ensaios experimentais demonstraram o princípio da detecção de tumores, forçando-os a expressar um biomarcador segreg�el.

Resultados

In vitro

caracterização dos mutantes HSV RQ-M38G

rQ-M38G mediada por transdução gluc, replicação e citotoxicidade foram testados por infectar uma variedade de tipos de células com várias concentrações de vírus e avaliar os níveis gluc em meios de cultura (Fig. 2a, Fig. S1), vírus do número de cópias do genoma (Fig. 2b, Fig. S2) e a citotoxicidade (Fig. 2c, Fig. S3) nos dias 2, 4 e 6 após a infecção. citotoxicidade celular dependente de replicação foi observado em queratinócitos do prepúcio humano replicar (HFK-r), enquanto a citotoxicidade foi atenuada ou ausente em diferenciada humano /quiescente queratinócitos do prepúcio (HFK-Q) (Fig. S3). Vero, uma linha de células de rim de macaco verde Africano, que é conhecido para a replicação do HSV permissiva, mostraram expressão glic alta e RQ-M38G replicação seguinte baixa dose de infecção RQ-M38G (MOI = 0,001, um vírus por 1000 células).

(a) Gaussia luciferase (gLIC) a expressão do transgene, (b), a replicação do vírus, e citotoxicidade (c) a seguir à infecção de células Vero e um painel de linhas celulares de tumores humanos com rQ-M38G (MOI = 0,001).

Nós avaliamos a expressão do transgene, a replicação do vírus e citotoxicidade após infecção rQ-M38G de 5 linhagens de células tumorais humanas. SK-NEP_Luc (sarcoma de Ewing), demonstrou expressão elevada Gluc, a replicação do vírus e da susceptibilidade citotóxicas semelhantes às células Vero. Osteomet (osteossarcoma), STS26T_dsRed (MPNST) e S462.TY (MPNST) cada demonstraram menor sensibilidade em todos os três ensaios. Finalmente, avaliou-se a citotoxicidade em 3 modelos de tumor de rato bem estabelecidas derivadas de um fundo C57 /BL6 (Fig. S3) e vários espontânea tiróide murino ou linhas de tumor de pulmão de células pequenas gerados por um colaborador (dados não mostrados). HGF116 (rabdomiosarcoma) era a única linha celular mostrando qualquer citotoxicidade mensurável, mas apenas a uma dose elevada de vírus (MOI = 1, um vírus infeccioso por célula). Estes dados identificados SK-NEP_Luc como um alvo principal para

in vivo

despistagem mediante a utilização RQ-M38G enquanto outras linhagens de células tumorais humanas foram previstas serem menos susceptíveis de rastreio com RQ-M38G.

Sistémico administração de rQ-M38G para identificar tumores presença

Foi testada a aptidão de rQ-M38G como um vector de entrega de genes para forçar a secreção específico de tumor de um biomarcador após administração sistémica de rQ-M38G em ratos com e sem tumores . Onze ratinhos foram injectados com 10 ortotopicamente

6 células SK-NEP_Luc em sua subcápsula renal. camundongos implantados-tumorais e ratos livres de tumor de controle foram posteriormente injetada por via intravenosa (i.v.) com 1,2 × 10

7 pfu de RQ-M38G 5 semanas após a implantação do tumor. Nos dias 1, 4 e 7 seguintes ratinhos injecção de vírus foram fotografadas para identificar tumores de luciferase-positivos e amostras de sangue foram recolhidas do pirilampo por retro-orbital do olho sangrar e ensaiadas para gluc soro (Fig. 3a).

In vivo

de imagem identificados 10 dos 11 ratos que receberam injeções de células tumorais tinham formado tumores (Fig. 3b). Um rato (# 9) nunca formaram um tumor e um rato (# 11) tinha um tumor que foi mal detectável. Em todos os ratinhos, onde a carga do tumor foi aparente (9 de 11), os níveis séricos gluc foram de 15 a 440 vezes maior do que os ratinhos livres de tumor, enquanto que gluc soro a partir dos outros dois ratinhos permaneceram abaixo dos níveis gluc soro de rato de controlo (Fig. 3). Portanto, RQ-M38G administrados sistemicamente para induzir a produção biomarcador resultou numa sensibilidade de detecção de 90% para ratinhos SK-NEP_Luc-rolamento. Resultados semelhantes foram para tumores em diferentes sítios anatômicos (Fig. S4).

(a) curso Tempo de expressão glic em subcápsula renal (RSC) SK-NEP_Luc-rolamento e ratos sem tumor injetado sistemicamente com 1,2 × 10

7 pfu ou rQ-M38G. Os números em lenda representam ratinhos individuais. (B) a expressão glic e

in vivo

imagem da SK-NEP_Luc de rolamento ratos quatro dias após a injecção sistémica de 1,2 × 10

7 pfu de RQ-M38G. Os níveis séricos de glic para ratos injectados com tumor e controle que não receberam injeções de tumor (gráfico de barras) e

in vivo

imagem luciferase de ratos que receberam injeções de células tumorais.

Para determinar a localização de rQ-M38G nos tecidos seguintes IV injecção e confirmar que o sinal de glic soro estava a ser expressa a partir de tumores e não órgãos normais, os órgãos foram recolhidos a partir de ratinhos de 7 dias após a infecção pelo vírus e submetido a imunofluorescência para a expressão de GFP e PCR quantitativo para genomas de vírus. Apenas tumores demonstraram expressão da GFP em ambos controlo (dados não apresentados) e os ratinhos experimentais (Fig. 4a) injectados sistemicamente com RQ-M38G. PCR quantitativa para cópias de genoma de vírus expressaram a mesma distribuição de vírus em ratinhos portadores de tumores, como foi visto com expressão da GFP em que as cópias de vírus foram, pelo menos, 2100 vezes mais elevada do que os tumores em tecidos saudáveis ​​(Fig. 4b). A imunofluorescência e qPCR indicam que a infecção pelo vírus predominaram no tumor, enquanto sendo mínima nos tecidos saudáveis. Por conseguinte, administrada sistemicamente RQ-M38G identificado com sucesso a presença de tumores SK-NEP_Luc forçando tumores para produzir um biomarcador segreg�el. Nós demonstramos resultados semelhantes em modelos de tumores que são menos suscetíveis à infecção do vírus, incluindo modelos de tumores da bainha dos nervos periféricos malignos (em ambos os locais subcutânea e intraperitoneal) e osteossarcoma (Figuras S5, S6, S7).

(a) imunofluorescência GFP em ratos SK-NEP_Luc de rolamento com e sem administração vírus sistêmico. Os ratinhos que receberam vírus (# 1 e # 2) apresentaram expressão da GFP selectiva no tumor, enquanto que os ratinhos que não receberam vírus (sem controle de vírus) mostrou-GFP negatividade global. Barra de escala = 15 microns. (B) Biodistribuição do vírus em camundongos com tumores SK-NEP_Luc após a administração sistémica, conforme determinado por qPCR de genomas virais.

Indução de expressão glic em tumores por injecção de vírus intratumoral

A foi observada diferença clara entre os três outros modelos de tumor testados qual cada mostraram SK-NEP_Luc e menor

in vitro

citotoxicidade e expressão glic juntamente com menor expressão de biomarcadores

in vivo

. Para identificar se entregar doses maiores de vírus para tumores poderia aumentar

in vivo

biomarcador expressão, administrou RQ-M38G diretamente em tumores por injecção intratumoral em modelos de S462.TY e Osteomet.

Ratos rolamento Osteomet flanco subcutânea tumores superior a 200 mm

3 foram injectados com 1,9 × 10

5 pfu de vírus. As amostras de sangue foram recolhidas e analisadas para Gluc em cada ponto de tempo (Fig. S7A) quando dois ratos foram sacrificados em cada ponto de tempo e analisadas para cópias genómicas virais por qPCR (Fig. S7b). Os níveis séricos de glic no sangue de ratinhos portadores de tumores injectados com RQ-M38G foi maior do que os níveis Gluc em ratinhos não infectados de controlo, e aumentando gluc ao longo do tempo traçado um perfil semelhante ao número de cópias virais nos tumores. Apesar de uma amplificação genómica 4000 vezes em tumores, os níveis séricos glic subiu apenas 10 vezes acima controles não infectados. injecção intratumoral com 8 × 10

3 pfu ou 8 × 10

7 pfu de vírus foi repetido em tumores S462.TY quando os tumores eram maiores do que 500 mm

3. Quatro dias após i.t. Os níveis séricos de injecção gluc foram ensaiadas como representada graficamente na Fig. S8. Todos os ratinhos que receberam a injecção intratumoral do virus demonstraram níveis gluc mais elevados do que os controlos livres de tumor, sem uma diferença significativa na concentração de glic entre a dose baixa e dose de 10.000 vezes elevados de vírus, o que sugere a saturação com a dose baixa (pelo menos, por via intra-tumoral).

sensibilidade Biomarcador

modelos animais de pequeno porte utilizados para detectar o mínimo de encargos tumorais apresentam desafios de escalabilidade teóricas ao traduzir descobertas a praticidade em escala humana. Para enfrentar esses desafios buscamos avaliar os limites de detecção teóricas para a nossa biomarcador com base em um

in vitro

ensaio e detectar pequenas cargas tumorais

in vivo

por 3 métodos: IVIS imagem luminescência, vírus mediada expressão glic no soro e post-mortem análise histológica. O volume de sangue num rato é de cerca de 2 mL (8% de 25 g de peso corporal total [30]). Esférica tumor SKNEP-Luc composto de 10

6 células foi determinada ser de 1,83 mm de diâmetro por medição do volume ocupado numa amostra centrifugada por um número igual de células, assumindo pequenos tumores são compostos predominantemente por células tumorais. Dez a 1 milhão de células foram colocadas em placas em 2 ml de meio de cultura celular e de co-infectados com o RQ-M38G a uma MOI de 3 para garantir que cada célula seria infectada. Dois dias após a infecção por meio de cultura celular foi recolhido e analisado quanto à concentração gluc. Vírus-mediada expressão gluc pode ser eficazmente resolvido por transdução simultaneamente 1.000 células, que se aproxima um tumor esférica de diâmetro 183 micra (Fig. S9).

Ewings tumores de sarcoma (SKNEP-Luc) de tamanhos diferentes foram estabelecidos em 11 ratos por injecção de 10

6 células para o subcapsularly rim esquerdo em 3 grupos de ratos em 3 semanas consecutivas. Os ratos com tumores que se desenvolveu ao longo de 2, 3 e 4 semanas e 4 ratos de controle livres de tumor foram infectadas sistemicamente com 1 × 10

7 pfu de RQ-M38G. Quatro dias após a infecção ratos foram fotografadas via IVIS, amostras de sangue coletadas para glic quantificação e ratos foram sacrificados para o dimensionamento histológico do tumor.

In vivo

de imagiologia para a expressão de luciferase revelou ratinhos expondo tumores drasticamente diferentes em tamanho no momento da infecção e do sacrifício (exemplos extremos mostrados na Fig. 5A). A concentração sérica Gluc em ratinhos portadores de tumor 4 dias após a infecção, revelou níveis gluc maior do que os ratinhos de controlo livres de tumor infectadas de forma semelhante (Fig. 5b). A avaliação histológica de tumores em cada rato revelou um tumor macroscópica e microscópica focos tumorais em camundongos

i

e

ii

respectivamente (Fig. 5c).

a)

in vivo de imagens

de dois ratos (

i

e

ii

) com muito diferentes cargas tumorais SKNEP-Luc. b) A concentração sérica glic em i rato, II e quatro ratos de controle livres de tumor 4 dias após a infecção sistêmica com 1 × 10

7 pfu de RQ-M38G. c) hematoxilina e eosina imagens macroscópicas dos rins portadores de tumor (T = tumorais, barras de escala = 1 mm) e inserções de focos do tumor microscópico no parênquima renal de rato

ii

(barra de escala = 200 mm).

Discussão

Nós desenvolvemos uma estratégia de rastreio do cancro do romance pelo qual os tumores são forçados a secretar um biomarcador. Foi desenvolvido um HSV condicionalmente replicante, RQ-M38G, para forçar selectivamente células tumorais para secretar Gaussia de luciferase como uma demonstração desta estratégia de rastreio. animais portadores de tumor dadas intravenosa RQ-M38G expressaram níveis mais elevados de biomarcador em comparação com os animais livres de tumor, que apresentou apenas baixa, a expressão do fundo. O utilitário de RQM-38G para o rastreio parecia ser uma função da capacidade de um dado tumor para suportar a replicação de HSV. Independentemente do tipo de tumor ou localização, triagem do tumor por RQ-M38G foi altamente sensível à presença do tumor.

Uma característica fundamental para o rastreio do cancro é a capacidade de detectar pequenos tumores, em última instância, nas pessoas. Um

a priori

preocupação era que os tumores pequenos pode ser associada com menos área de superfície disponível para entrada vascular HSV. Este problema não pareceu ser uma limitação em ratos, porque, em alguns dos modelos que eram capazes de detectar tumores tão pequenas como 4-5 mm de diâmetro (50 mm

3) e em que um outro modelo detectada carga tumoral microscópica . Escalabilidade para os seres humanos (com volumes de sangue maiores) é difícil de prever, mas algumas estimativas são possíveis.

In vitro

avaliação do aumento do número de células tumorais SKNEP-Luc indica que infectar tão poucos como 1.000 células num volume de meio de cultura de células igual a um rendimento de sangue do rato o volume da secreção gluc detectável. Assim, a expressão simultânea de glic de 1.000 células, em qualquer momento num rato é teoricamente detectável. Sob estas condições infectando 10% das células num tumor de diâmetro 400 um (10

4 células) seria detectável em um rato. Quando dimensionada de um ratinho a um ser humano do limite teórico de detecção é aumentada por uma relação de 1:2600 (25 mg mouse:65 kg humano) e diluindo o biomarcador em um volume de sangue humano maior média de 4,7 L. Utilizando estes números, o limite teórico de detecção quando infectar 10% das células num tumor é alterado a partir de uma massa de 394 um de diâmetro num rato para um diâmetro de 1-4 mm do tumor num ser humano. Se apenas 1% das células tumorais são transduzidas por vírus, tumores tão pequenas como 8,5 mm de diâmetro pode ser ainda detectável usando estes cálculos. Esta sensibilidade sugere um forte potencial para a identificação de cargas tumorais mínimas, mesmo quando dimensionada para proporções humanas.

A capacidade desta estratégia de rastreio para revelar tumores é dependente de fatores virais, microambiente do tumor, e limitações de detecção de biomarcadores cada um dos quais pode ser aprimorado para praticidade do mundo real. Aqui nós empregou um HSV duplamente atenuada para efetuar uma transdução específica do tumor e expressão do gene. Tais vectores foram já documentada para ser seguro para uso humano [31]. vírus alternativas com mutações simples ou menos atenuantes demonstrar maior capacidade oncolytic também já estão em ensaios clínicos (por exemplo, HSV1716, consulte www.clinicaltrials.gov, NCT00931931). Juntando esta estratégia de rastreio de vírus atenuados menos provável será diversificar a sua utilidade, entre os diversos tumores sólidos, bem como melhorar a componente terapêutico. Os agentes que são, simultaneamente, tanto de diagnóstico e terapêuticos têm sido apelidado “theragnostic.” É possível nossa estratégia pode ser refinada por utilização de um promotor dependente de cancro mais robusto para conduzir a expressão biomarcador. distribuição de vector melhorado para o tumor pode também ser conseguido usando tumor direccionamento de moléculas pequenas e nanopartículas estratégias de melhoramento de absorção como recentemente descrito com a utilização de internalizar péptidos RGD [8]. comercialização eventual de nossa estratégia de rastreio proposto beneficiar do uso de biomarcadores que já estão em uso generalizado, como βHCG (teste de gravidez), PSA (câncer de próstata) e αFP (fígado e células germinativas tumores malignos). Biomarcador a sensibilidade do ensaio no contexto desta estratégia de rastreio pode ainda melhorar exponencialmente à medida que está a ser realizado com tecnologias de microfluidos [32], [33], [34], [35].

Uma preocupação significativa para o cancro do protótipo método de rastreio desenvolvida neste trabalho é o desenvolvimento de uma resposta imune para o agente de entrega de genes ou o biomarcador transduzidas, que evitarão a utilização repetida da ferramenta de rastreio. trabalho anterior no campo mostrou que os animais pré-imunizados ainda experimentam o benefício terapêutico de HSV com eficácia sustentada [36]. Uma vez que 80% da população em geral tem sido expostos a HSV, a aplicação desta estratégia de detecção com HSV dependerá da eficácia da NAV manipuladas administradas a indivíduos imunocompetentes que foram previamente expostos com o tipo selvagem estirpes de VHS.

In vitro

rastreio de linhas celulares tumorais de rato revelou que todas as linhas de rato que testamos exibiu comparativamente baixa susceptibilidade à infecção pelo nosso vírus mutante atenuado, a par com células humanas quiescentes normais. In vivo modelos de HGF116 demonstrou nenhuma sensibilidade vírus seguinte i.t. ou i.v. injecção. Assim, somos incapazes de avaliar nossa estratégia de rastreio do cancro em um modelo imunocompetentes, até a identificação de modelos de ratos que são mais suscetíveis a HSV humano. A implementação desta estratégia pode evoluir com vetores não-virais [37] ou vectores virais mascarados em lipossomas [38].

O desafio de rastreio do cancro em toda a população é o desenvolvimento de ensaios clínicos que são fiscalmente prático, universal através de um espectro de tipos de câncer, e fácil de implementar. O exame físico, enquanto a preços acessíveis, muitas vezes não consegue identificar tumores malignos que são profundas ou assintomática. benefícios de imagem de alta sensibilidade, mas nem sempre pode diferenciar massas inespecíficos ou benignas da doença maligna (por exemplo, nódulos pulmonares pode ser granuloma ou câncer), é financeiramente desafiador e difícil de implementar de forma ampla. Com a identificação de biomarcadores apropriados, o rastreio do cancro poderiam ser economicamente viável com o ponto automatizado de teste de cuidados (POCT) tecnologias (www.i-stat.com, www.biosite.com, www.siloambio.com [39]).

Este trabalho demonstra o princípio da indução da expressão de um transgene secretável no cancro utilizando um agente de entrega de genes sistemicamente administrados como um biomarcador para rastrear a presença de tumor. O princípio de triagem romance proposto e demonstrado neste trabalho poderia prender implicações imediatas para pacientes com riscos de câncer conhecidos como predisposições genéticas (BRCA-1, mutações Nf1) ou pacientes com um histórico de câncer que estão em alto risco de recorrência. Em última análise, a administração exógena de um agente de entrega de genes do cancro de segmentação (infecciosa ou não) pode forçar qualquer malignidade de secretar um biomarcador e poderia ser utilizado como um primeiro passo universal para o rastreio do cancro em toda a população. O impacto desta abordagem iria revolucionar a tecnologia para detecção de câncer nos países industrializados e os países em desenvolvimento, onde imagem e diagnósticos com base em biópsia pode não ser tão prontamente disponível.

Materiais e Métodos

Células e Os vírus

linhas de células de tumores humanos foram descritos anteriormente [40], [41] ou foram adquiridos à American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA), excepto SK-NEP_Luc, que foi um presente do tipo de Jason Frisch (CCHMC, Cincinnati, OH). As células foram cultivadas em DMEM ou meio McCoys 5A (ATCC, SK-OV-3, SK-NEP_Luc) com 10% de soro fetal bovino (Hyclone, Logan, UT) e penicilina /estreptomicina (Life Technologies, Carlsbad, CA). linhas de células de rato C57 /Bl6 LLC

GFP [42] (Lewis carcinoma do pulmão) e B16-BL6 (melanoma) foram presentes amáveis ​​de Joe Palumbo (CCHMC, Cincinnati, OH) e HGF116 (rabdomiossarcoma) foi derivada de uma engenharia genética rato. humana primária queratinócitos do prepúcio (HFK) foram um presente amável de Susa Wells (CCHMC, Cincinnati, OH), cultivadas em EpiLife mídia (Cascade Biologics, Portland, OR) e diferenciadas em queratinócitos quiescentes com 10% FBS e 1 mmol /L CaCl

2 [43]

rQ-M38G foi construído como se segue:. a L

L38 promotor foi isolado a partir de HSV rRp450 por PCR utilizando iniciadores desenhados anteriormente [18], que foram modificados para incluir um 5 ‘ BglII e 3 ‘HindIII locais (F1, R1 na Tabela S1) e clonado nos locais BglII e HindIII de pCMV-gluc (Invitrogen), substituindo o promotor de CMV. A cassete de L

L38p-gluc foi amplificado por PCR a partir de pU

L38p-gluc com a inclusão de um 5’SpeI e 3 ‘EcoRI e clonado nos locais SpeI-EcoRI do “HSV-Quick” plasmídeo de vaivém, pT-OriSIE4 /5 [29] (a simpática oferta do Yoshinaga Saeki, The Ohio State University, Columbus, Ohio), em que a Oris (/5 fragmento Kpnl E4 tinham sido removidos. o plasmídeo resultante, pT-U

L38p-gluc, foi utilizada no sistema HSVQuick BAC para gerar rQ-M38G [29]. os iniciadores para a análise por PCR e sequenciação são mostrados na Tabela S2. os vírus foram propagados e titulados [44] por ensaio de placas em células Vero. citotoxicidade celular foi determinada em placas de 96 poços de cultura de tecidos utilizando um MTS /PMS ensaio modificado (Promega, Madison, WI).

Gaussia ensaio de luciferase

gluc actividade foi avaliada em amostras de 10 uL de cultura de tecidos mídia ou soro por ensaio quimioluminescente [45] em um luminómetro autoinjecting por injeção de 50 mL de 50 mM celenterazina (Prolume, Pinetop, AZ) para cada amostra em triplicado e integrando o sinal por 2,5 segundos [26].

biodistribuição

os estudos em animais de vírus foram aprovados pelo animal Care Hospital Institucional do Cincinnati Children e Use Committee (protocolo animal # 9D12095). 5-6 semanas de idade fêmea Balb /c atímicos ratinhos nus (Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN) foram injectados com 1-5 milhões de células. As células foram preparadas em 33% de Matrigel (Becton Dickinson, Bedford, MA) e 66% de tampão fosfato salino (PBS, pH 7,4) para administração subcutânea (s.q.) de injecção e de PBS apenas para subcápsula renal (r.s.c) ou injecção intraperitoneal (i.p.). doses de vírus encontram-se descritos no texto. O vírus foi suspenso em 100-150 ul de PBS para as injecções na veia da cauda e 50-100 uL de PBS para as injecções intratumorais, que foram distribuídos em 5 fracções em todo o tumor.

Preparação do tecido e a imunofluorescência

Os tecidos foram fixados, embebidos, e cortado em secções de 12 micron utilizando procedimentos padrão. As secções foram permeabilizadas com 0,2% de Triton X em PBS durante 10 minutos, bloqueadas em soro de cabra normal a 10% durante 60-90 minutos, e incubada com anti-GFP de galinha (# 16901, Millipore /Chemicon, Billerica, MA) durante 60 minutos , enxaguadas três vezes com PBS, e incubadas com o anticorpo secundário (anti-cabra com FITC de galinha, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), lavou-se com PBS e montadas com Fluoromount-G (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA). Todas as lâminas foram então fotografadas com OpenLab Software Imaging (Improvisação, Waltham, MA) em uma fluorescente invertida microscópio Zeiss.

HSV genoma quantificação

DNA foi isolado de tecidos de camundongos usando o isolamento Gentra Puregene DNA kit (Qiagen, Valencia, CA) e quantificada utilizando o espectrofotômetro NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE). PCR em tempo real foi realizado utilizando o sistema ABI 7500 (Applied Biosystem, Foster City, CA) [46]. Os padrões foram feitas a partir de DNA viral purificado HSV1716.

RQ-M38G expressão dos genes e replicação estudos em linhas de células

As células foram infectadas em placas de 12 poços durante 1 hora e recolhidas nos tempos indicados. 100 uL da suspensão de células foi utilizada para medir Gaussia de luciferase, enquanto que a suspensão de células remanescente foi submetido a três ciclos de congelação-descongelação e centrifugadas a 20000 × g. Os sedimentos foram ressuspensos em 200 ul de PBS. O ADN foi isolado usando o kit DNeasy Blood and Tissue (Qiagen, Valencia, CA). Fast-PCR em tempo real foi realizado utilizando o Fast Time PCR System real 7900HT (Applied Biosystem, Foster City, CA). ADN padrão ou DNA extraído a partir de células infectadas (40 ng) foi adicionado a 10 uL de Kit SYBR Premix Ex Taq II (Takara, Otsu, Shiga, Japão), 1,6 uL de uma mistura de timidina quinase do iniciador (TK 290-F: 5 ‘ TCG CGA ACA TCT ACA CCA CAC AAC; TK 400-R: 5 ‘CGG CAT AAG GCA TGC CCA TTG TTA; cada um, a 400 nm), 0,4 mL de Rox (Takara) e água PCR-grade para um volume final de 20 ul por reação. A PCR foi um ciclo de 95 ° C durante 30 segundos, 40 ciclos de 95 ° C, durante 3 segundos, 60 ° C durante 15 segundos, e 72 ° C durante 25 segundos.

in vivo

imaging

Os ratos foram injectados com 150 mg /kg de D-luciferina (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA) e fotografada por IVIS200 (Calipur Lifesciences).

Informações de Apoio

Figura S1.