Abstract

α-Tomatina é um glycoalkaloid encontrado no tomate e curcumina é um grande pigmento amarelo de açafrão. No presente estudo, foi estudado o efeito combinado desses dois compostos sobre as células de cancro da próstata. O tratamento de diferentes células de cancro da próstata com a curcumina ou α-tomatina isoladamente resultou em inibição do crescimento e apoptose de um modo dependente da concentração. Combinações de α-tomatina e curcumina sinergicamente inibiu o crescimento e a apoptose induzida em células PC-3 de cancro da próstata. Efeitos da combinação α-tomatina e curcumina foram associados com a inibição sinérgica de actividade de NF-kB e um potente diminuição na expressão do seu gene a jusante de Bcl-2 nas células. Além disso, fortes reduções nos níveis de fosfo-Akt e fósforo-ERK1 /2 foram encontrados em células PC-3 tratadas com α-tomatina curcumina e em combinação. Em experiências com animais, os ratinhos SCID com PC-3 foram tratados tumores de xenoenxerto com α-tomatina e curcumina. Combinação de α-tomatina e curcumina mais potentemente inibiu o crescimento de tumores PC-3 do que qualquer agente sozinho. Os resultados do presente estudo indicam que α-tomatina em combinação com a curcumina pode ser uma estratégia eficaz para inibir o crescimento do câncer de próstata

Citation:. Huang H, Chen X, Li D, Ele Y, Li Y, du Z, et al. (2015) Combinação de α-Tomatina e curcumina inibe o crescimento e induz a apoptose em células cancerosas humanas da próstata. PLoS ONE 10 (12): e0144293. doi: 10.1371 /journal.pone.0144293

editor: Hong Wang, Rutgers, a Univesity Estado de New Jersey, Estados Unidos

Recebido: 07 de outubro de 2015; Aceito: 16 de novembro de 2015; Publicação: 02 de dezembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Huang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Província de Guangdong, concessão de Liderança 2011 (https://pro.gdstc.gov.cn/egrantweb/), National Natural Science Foundation da China, 81272452, 21102020 e 21272043 (http : //www.nsfc.gov.cn/), Instituto Nacional do Câncer, P30-CA072720 (https://www.nih.gov/). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata é um dos cancros mais comuns nos homens europeus e americanos e tem uma alta taxa de mortalidade [1]. A maioria dos pacientes demonstram uma resposta inicial à manipulação hormonal, mas infelizmente a grande maioria dos pacientes evoluem para desenvolver a doença hormônio-refratário. Enquanto mais recentes de tratamento e quimioterapia opções anti-andrógenos estão disponíveis para pacientes com cancro da próstata independente de androgénios, estes agentes possuem toxicidade considerável e são apenas temporariamente eficaz [2-5]. Portanto, inovadora e abordagens menos tóxicos para o tratamento de câncer de próstata seria de grande benefício para os pacientes.

A curcumina (Fig 1) é um dos principais pigmento amarelo de açafrão

Curcuma longa

Linn. Cúrcuma é uma especiaria comum em alimentos asiáticos e tem uma longa história de uso medicinal nos países asiáticos. A curcumina tem amplas funções biológicas e farmacológicas incluindo anticâncer, anti-inflamatória e antioxidante [6-8]. A curcumina foi avaliado em ensaios clínicos para o tratamento de doenças do fígado, a artrite reumatóide, as doenças infecciosas e cancros [9, 10]. Apesar dos seus efeitos biológicos promissores em estudos pré-clínicos, a utilidade clínica da curcumina é diminuída pela sua fraca biodisponibilidade [11]. Embora muitos análogos de curcumina foram desenvolvidos para melhorar a eficácia terapêutica, a biodisponibilidade e efeitos secundários tóxicos destes compostos necessitam de mais estudos [12-18]. Combinando a curcumina com outros agentes anticancerígenos é uma estratégia eficaz para melhorar a sua eficácia anticancerígena, e os estudos de facto anteriores mostraram que as combinações de curcumina com outros agentes anticancerígenos melhoraram eficácias anticancerígenos [19-21].

α -Tomatine (Fig 1) é um naturalmente ocorreu glycoalkaloid esteróides no tomate (

Lycopersicon esculentum

). tomates verdes imaturos conter até 500 mg α-tomatina /kg de peso frutas frescas. O composto é parcialmente degradadas como o tomate amadurece até que os níveis de maturidade em tomates vermelhos são cerca de 5 mg /kg de peso frutas frescas [22]. Em plantas, α-tomatina pode fornecer defesa contra fungos patogénicos, bactérias e vírus [22]. As atividades anticancerígenas de α-tomatina e seus mecanismos de ação têm sido estudados nos últimos anos. Em estudos in vitro demonstraram que α-tomatina inibiu o crescimento de células cancerosas humanas diferentes [23-25]. Estudos recentes também mostraram que α-tomatina inibiu o crescimento de tumores da mama e da próstata em ratinhos [26, 27]. Uma combinação de α-tomatina e paclitaxel foi encontrada para melhorar sinergicamente apoptose de células cancerosas da próstata humanos [28].

Existe um interesse crescente na utilização de uma combinação de baixas doses de agentes anti-cancro que diferem nos seus modos de acção em vez de administração de um agente único, a uma dose elevada. Combinações de agentes anti-cancerígenos que têm diferentes mecanismos de acção pode ter efeito sinergético na inibição do crescimento e indução de apoptose em células de cancro da próstata. Embora o efeito inibidor de α-tomatina ou curcumina no cancro da próstata tinha sido estudada, nenhum estudo examinou o efeito combinado destes dois agentes sobre as células de cancro da próstata em cultura in vitro e cultivadas como tumores de xenoenxerto in vivo. Estudos mostraram que os efeitos da curcumina e α-tomatina sobre as células cancerosas foram associados com a inibição do NF-kB activação [7, 17, 24, 26]. Colocámos a hipótese de que a combinação de baixas concentrações de curcumina e α-tomatina sinergicamente irá inibir a activação de NF-kB que conduz à inibição do crescimento forte e indução de apoptose em células de cancro da próstata. O presente estudo foi, portanto, concebido para explorar o efeito da α-tomatina em combinação com curcumina em baixas concentrações no crescimento e apoptose em células cancerosas humanas da próstata. foram determinados os efeitos de α-tomatina e curcumina em combinação em vias moleculares relacionados NF-kB e. O nosso estudo forneceu a primeira evidência de que uma combinação de baixas concentrações de α-tomatina curcumina e fortemente inibida células de cancro da próstata em cultura in vitro e cultivadas como tumores de xenoenxertos em ratinhos imunodeficientes.

Materiais e Métodos

cultura de células e reagentes

RWPE-1, LNCaP, VCaP e células PC-3 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, EUA). A curcumina, α-tomatina, propileno-glicol, polissorbato 80, álcool benzílico, etanol e DMSO eram da Sigma (St. Louis, MO). Matrigel foi obtido a partir de BD Biosciences (Bedford, MA). RPMI-1640 de cultura de tecidos, penicilina-estreptomicina, L-glutamina e soro fetal de bovino (FBS) foram da Gibco (Grand Island, NY). células RWPE-1 foram mantidas em meio de queratinócito isento de soro (K-SFM; 17005-042) de Gibco (Grand Island, NY). LNCaP, VCaP e células PC-3 foram mantidas em meio de cultura RPMI-1640 contendo FBS a 10% que foi suplementado com penicilina (100 unidades /ml) -streptomycin (100 ug /ml) e L-glutamina (300 ug /ml). As células cultivadas foram cultivadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 e foram passadas duas vezes por semana.

Determinação do número de células viáveis ​​

O número de viável células depois de cada tratamento foi determinada utilizando um hemacitómetro com um microscópio de luz (Nikon Optiphot, Japão). A viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de exclusão de azul de tripano, a qual foi feito pela mistura de 80 ul de suspensão de células e 20 ul de solução de azul de tripano a 0,4% durante 2 min. células azuis foram contados como as células mortas e as células que não absorvem corante foram contados como células vivas.

Avaliação das células em apoptose

A apoptose foi determinada pela avaliação morfológica em células coradas com iodeto de propídio ( PI) [29]. As células apoptóticas foram identificados por características morfológicas clássicos, incluindo a condensação nuclear, encolhimento da célula, e formação de corpos apoptóticos [29]. A apoptose também foi determinada pela anexina V /PI ensaio de dupla marcação usando fluoresceinisothiocyanate (ITCF) marcado com Anexina V /kit de detecção de apoptose PI (BD Bioscience, San Jose, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as células após o tratamento foram recolhidos, lavados em solução salina tamponada com fosfato frio (PBS) duas vezes, coradas com corantes para anexina V e PI conjugados com FITC. A externalização de phoshotidylserine ea permeabilidade ao PI foram avaliadas por FACS Calibur citómetro de fluxo (BD Bioscience, San Jose, CA). Os dados de 10.000 eventos fechados por amostra foram recolhidos. As células em estágios iniciais de apoptose foram positivamente coradas com anexina V. células no final de apoptose foram positivamente coradas com ambos anexina V e PI.

Western blot análise

Após o tratamento, foram preparados os lisados ​​celulares como descrito anteriormente [30]. As proteínas foram submetidas a electroforese de sódio dodecil sulfato de gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e transferidos para uma membrana de nitrocelulose. Depois de bloquear os sítios de ligação não específicos com tampão de bloqueio, a membrana foi incubada durante a noite a 4 ° C com os anticorpos primários (# 4051 de fósforo-Akt e # 4376 de fósforo-ERK1 /2, tanto a partir de Cell Signaling Co., Beverly, MA; 05 -729 para Bcl-2 de Millipore Co., Billerica, MA). A β-actina foi utilizado como um controlo de carga. Após a remoção do anticorpo primário, a membrana foi lavada três vezes com TBS (PBS contendo 0,05% de Tween 20) de tampão à temperatura ambiente e depois incubadas com anticorpo secundário conjugado com fluorocromo (Santa Cruz Biotechnology Inc., CA). A membrana foi então lavada com TBS três vezes. detecção de final foi feita com o sistema de imageamento infravermelho Li-Cor Odyssey (Li-Cor Biotecnologia, Lincoln, NE).

NF-kB-dependente gene repórter ensaio de expressão

atividade transcricional NF-kB foi medida pelo ensaio de expressão do gene repórter de NF-kB-luciferase. Um constructo de luciferase de NF-kB foi transfectado estavelmente em células PC-3 e um único clone estável, PC-3 /N [17], foi utilizado no presente estudo. Em resumo, 3-PC /N células foram tratadas com a curcumina ou α-tomatina sozinho ou em combinação, durante 24 h, e as actividades de NF-kB-luciferase foram medidos utilizando os kits de ensaio de luciferase de Promega (Madison, WI, EUA). Após os tratamentos, as células foram lavadas com fosfato arrefecido com gelo tamponado com solução salina (PBS) e colhidas em 1 x tampão de lise repórter. Após centrifugação, alíquotas de 10 ul dos sobrenadantes foram medidos por actividade de luciferase usando um luminómetro da Turner Designs Instrumento (Sunnyvale, CA, EUA). A actividade de luciferase foi normalizada contra concentrações conhecidas de proteína e expressa como percentagem da actividade da luciferase nas células de controlo, as quais foram tratadas com DMSO solvente. O nível de proteína foi determinada pela Bio-Rad Protein Assay Kits (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante.

formação e crescimento de tumores PC-3 em ratinhos imunodeficientes

Homem ratinhos imunodeficientes combinados graves (SCID) (6-7 semanas de idade) foram obtidos a partir de Taco Farms Inc (Germantown, NY). Os animais foram alojados em gaiolas microisolator cobertas de filtro estéril e fornecida com comida esterilizada e água. O cancro da próstata PC-3 de células (2 x 10

6 células /0,1 mL /murganho) em suspensão em 50% de Matrigel (Collaborative Research, Bedford, MA) em meio RPMI 1640 foram injectados subcutaneamente no flanco direito dos ratos. Após cerca de 4 semanas, os ratinhos com tumores de xenoenxerto estabelecidos foram injectados com veículo, α-tomatina (5 mg /kg), curcumina (5 mg /kg), ou α-tomatina (5 mg /kg) + curcumina (5 mg /kg ) uma vez a cada três dias durante 30 dias. Cada grupo tinha 9 ratos e todos os animais receberam o mesmo volume de veículo (5 ul /g de peso corporal), que consistia em propileno glicol, polissorbato 80, álcool benzílico, etanol e água (40: 0,5: 1: 10: 48,5). O tamanho do tumor (comprimento x largura) e peso corporal foram medidos a cada terceiro dia. No final do estudo, os ratinhos foram sacrificados, os tumores foram excisados, pesados ​​e colocados em formalina tamponada com fosfato, à temperatura ambiente durante 48 h e, em seguida, colocados em etanol durante 48 h antes de se prepararem secções de parafina, como descrito anteriormente [31]. O estudo animal foi conduzido de acordo com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Instituto Nacional de Saúde. O protocolo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Rutgers (RU02-001). Este protocolo aprovado o nosso estudo animal presente, utilizando o modelo de rato de xenotransplante SCID para determinar os efeitos das naturalmente ocorreram compostos (α-tomatina e curcumina) sobre o crescimento de tumores de próstata.

Imunohistoquímica

coloração imuno-histoquímica de proliferação de antigénio nuclear celular (PCNA) foi usada para determinar a proliferação das células de tumor PC-3. Em resumo, prepararam-se secções de parafina de tecidos tumorais e processadas para coloração imuno-histoquímica. As secções de tumor foram incubadas com um anticorpo primário PCNA (MAB424, Millipore Corp. Billerica, MA, EUA) durante 1 h à temperatura ambiente. Depois de lavada com salina tamponada com fosfato (PBS), as secções foram incubadas com um anticorpo secundário biotinilado durante 30 min, seguido por incubação com uma solução de conjugado avidina-peroxidase de rábano silvestre durante 30 min, utilizando o kit Elite ABC (PK-6100, Vector Laboratories, Burlingame, CA, EUA). coloração com PCNA em células tumorais (cor castanha no núcleo) foram examinados sob um microscópio (Nikon Optiphot, Nikon, Tokyo, Japão). Pelo menos 1000 células foram contadas para cada seção.

Análise estatística

O efeito sinérgico potencial da α-tomatina ou curcumina foi avaliada pelo método isobole [32], usando a equação Ac /Ae + Bc /Be = índice de combinação (CI). AC e BC representam a concentração da droga A e B de drogas usadas na combinação, e Ae e Be representam a concentração da droga A e B que produziram a mesma magnitude do efeito, quando administrados sozinhos. Se é CI 1, então as drogas são considerados para agir sinergicamente. Se o IC é 1 = 1 ou, então as drogas agem em um antagonista ou aditivo maneira, respectivamente. O modelo de análise de variância (ANOVA) com ajuste de Tukey-Kramer foi utilizado para a comparação de apoptose em PC-3 de células entre os diferentes grupos de tratamento, e para a comparação do peso do corpo, o tamanho do tumor, o peso do tumor e a proliferação do tumor nos animais entre as diferentes os grupos de tratamento no final da experiência.

resultados

α-Tomatina curcumina e inibir o crescimento de células de cancro da próstata

Em estudos iniciais, os efeitos de α-tomatina ou foram determinadas a curcumina sozinho em diferentes células cancerosas da próstata. cancro da próstata humano LNCaP, VCaP (dependente de androgénio-) e células PC-3 (independente de androgénios) foram tratadas com diferentes concentrações de α-tomatina e curcumina durante 72 h. A viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de exclusão de azul de tripano. Como mostrado na Fig 2A, o tratamento de diferentes células de cancro da próstata com α-tomatina, resultou numa diminuição dependente da concentração no número de células viáveis. O tratamento das células com a curcumina, também resultou num decréscimo dependente da concentração do número de células viáveis ​​(Fig 2B). Os efeitos da curcumina e α-tomatina no crescimento celular foram semelhantes entre as linhas de células de cancro da próstata três testados. Como mostrado na Fig 2C, α-tomatina e curcumina em combinação teve efeito inibidor mais potente sobre LNCaP, VCaP e células PC-3. O índice de combinação (Cl) para IC

50 foi calculada como 0,69, 0,72 e 0,48 para as LNCaP, VCaP e células PC-3, respectivamente. Este resultado indica que a combinação de α-tomatina curcumina e inibe sinergisticamente o crescimento de células de cancro da próstata em cultura. A curcumina e α-tomatina sozinho ou em combinação tinha um pequeno efeito inibitório sobre o crescimento de epiteliais da próstata RWPE-1 de células não tumorigénicas (Fig 2C)

próstata humano LNCaP (células cancerosas, VCaP e PC-3. e) não tumorigénicas células epiteliais da próstata (RWPE-1) foram semeadas a uma densidade de 0,2 x 10

5 células /ml em placas de cultura de tecidos de 35 mm e incubou-se durante 24 h. As células foram então tratadas com várias concentrações de α-tomatina e curcumina por si só ou em combinação, durante 72 h. As células viáveis ​​foi determinado pelo ensaio de exclusão de azul de tripano. a viabilidade celular (A) Percentagem em várias linhas de células tratadas com α-tomatina. a viabilidade celular (B) por cento nas várias linhas de células tratadas com a curcumina. a viabilidade das células (C) Percentagem nas várias linhas de células tratadas com α-tomatina (1 uM) e curcumina (5 ^ M) sozinho ou em combinação. Cada valor representa a média ± SE a partir de três experiências separadas.

α-Tomatina e curcumina induzir a apoptose em PC-3 células

O efeito da α-tomatina e curcumina na indução de apoptose na próstata células cancerosas foram determinados utilizando avaliação morfológica e da anexina V /PI dupla marcação. Como mostrado na Tabela 1, o tratamento de cancro da próstata LNCaP, VCaP e células PC-3 com α-tomatina ou curcumina resultou em pequeno aumento no número de células apoptóticas. Combinações de α-tomatina e curcumina teve efeito estimulador mais potente sobre a apoptose do que qualquer um dos agentes utilizados isoladamente. A curcumina e α-tomatina sozinho ou em combinação tinha um pequeno efeito sobre a estimulação da apoptose a moderados em células RWPE-1 não tumorigénicas epiteliais da próstata (Tabela 1). A análise estatística mostrou que a sinergia α-tomatina curcumina e tinha um forte efeito sinérgico sobre células PC-3 (IC = 0,77) do que em células LNCaP (IC = 0,90) e VCaP (IC = 0,96) células. Uma vez que a combinação de α-tomatina e curcumina teve um efeito mais forte sinérgico na indução de apoptose nas células PC-3 andrógeno-independente, nós escolhemos a linha PC-3 para mais

in vitro

e

in vivo

estudos. A indução de apoptose em células PC-3 tratadas com α-tomatina e curcumina foi também determinada em experiências utilizando o anexina V /PI dupla coloração. Nestas análises, as células nas fases iniciais de apoptose foram coradas positivamente com Anexina V, enquanto que as células em estádios tardios de apoptose foram coradas positivamente com Anexina V e tanto PI. Figura 3A mostra um resultado representativo de análise citómetro de fluxo. Como mostrado na Fig 3B, α-tomatina (1 uM) ou curcumina (5 uM) teve pequeno efeito moderado sobre a estimulação da apoptose, e a combinação dos dois agentes provocou um aumento substancial na apoptose. A análise estatística usando ANOVA com o teste de comparação múltipla de Tukey-Krama mostrou que a percentagem de células apoptóticas no grupo de combinação foi significativamente mais elevado do que no grupo tratado com α-tomatina (

P

0,001) e que no grupo tratado com a curcumina (

P

0,001).

PC-3 foram inoculadas a uma densidade de 0,5 x 10

5 células /ml em placas de cultura de tecidos de 100 mm e incubou-se durante 24 h. As células foram então tratadas com α-tomatina e curcumina por si só ou em combinação, durante 48 h. A apoptose foi determinada pelo ensaio de anexina V /PI coloração dupla utilizando o kit marcado com FITC anexina V /PI apoptose de detecção e análise de citómetro de fluxo. (A) resultado Representante da análise citómetro de fluxo é mostrado. (B) porcentagem de células em fase inicial apoptóticos (esquerda), fase tardia células em apoptose (meio) e células em apoptose total (direita). Cada valor representa a média ± SE a partir de três experiências separadas.

Efeito inibidor de α-tomatina e curcumina na NF-kB e seu alvo a jusante Bcl-2

Um ensaio de expressão do gene repórter de luciferase foi usado para determinar o efeito de α-tomatina e curcumina na activação de NF-kB. PC-3 /N é uma linha celular derivada da transfecção estável de células PC-3 com um constructo de luciferase de NF-kB [17]. /N células foram tratadas com α-tomatina e curcumina por si só ou em combinação, durante 24 h de 3-PC. Tratamento de /N células com α-tomatina (1-5? M) ou curcumina (5-20 uM) PC-3 sozinho resultou em diminuições na actividade de luciferase em forma dependente da concentração (Figura 4). Concentrações mais baixas de α-tomatina (1 uM) ou curcumina (5 ou 10 uM) tinha pequena a moderada efeitos inibidores sobre a actividade da luciferase, e as combinações de α-tomatina (1 uM) e curcumina (5 ou 10 uM) tinha muito mais forte efeitos do que qualquer agente isoladamente (Fig 4). A análise estatística mostrou que a sinergia α-tomatina e curcumina em combinação teve um efeito sinérgico na redução da actividade da luciferase de NF-kB (IC = 0,56). O efeito de α-tomatina e /ou curcumina sobre o nível de proteína anti-apoptótica de Bcl-2, que é um alvo a jusante de NF-kB foi determinada por análise de Western blot. O tratamento com α-tomatina ou curcumina por si só teve pouco ou nenhum efeito sobre o nível de Bcl-2, enquanto a combinação teve um forte efeito inibidor sobre a expressão desta proteína (Figura 5). A medição da densidade da banda revelou que o nível de Bcl-2 em relação ao controlo (1.00) foi de 0,89 em células tratadas com a curcumina, 0,92 em células tratadas com α-tomatina e 0,41 em células tratadas com a combinação de α-tomatina ou curcumina (Fig 5).

3-PC /N células foram semeadas a uma densidade de 0,2 x 10

5 células /ml de meio em placas de 12 poços e incubou-se durante 24 h. As células foram então tratadas com sozinho ou em combinação com a curcumina durante 24 h α-tomatina. A actividade transcricional de NF-kB foi medida por um ensaio de actividade de luciferase. Cada valor representa a média ± DP de três experiências separadas.

As células foram semeadas a uma densidade de 1 x 10

5 células /ml de meio em placas de cultura de 100 mm e incubou-se durante 24 h . As células foram então tratadas com α-tomatina ou curcumina isoladamente e em combinação, durante 24 h (para a análise de fósforo e de fósforo-Akt-ERK1 /2) e 48 horas (para análise de Bcl-2). Os níveis de proteína Bcl-2, fosfo-Akt e fosfo-ERK1 /2 foi determinado por análise de Western blot. A densidade da banda foi medida e normalizada para a actina.

Efeitos da α-tomatina e curcumina sobre o nível de fosfo-Akt e fosfo-ERK1 /2

O nível de ERK1 activada /2 e AKT em células PC-3 foi avaliado por análise de Western blot utilizando anticorpos anti-fosfo-ERK1 /2 e fosfo-Akt. O tratamento de células PC-3 com α-tomatina (1 fiM) resultou em uma moderada a forte diminuição do nível de fosfo-Akt, enquanto curcumina (5 ^ M) sozinho teve pouco ou nenhum efeito (Figura 5). Uma combinação de α-tomatina curcumina e teve um efeito potente sobre a diminuir o nível de fosfo-Akt. Medição da densidade banda mostrou que o nível de fosfo-Akt em relação ao controlo (1.00) foi de 0,99 em células tratadas com a curcumina, 0,51 em células tratadas com α-tomatina e 0,26 em células tratadas com a combinação de α-tomatina e curcumina (Fig 5 ). Tratamento de PC-3 de células com α-tomatina (1 uM) ou curcumina (5 ^ M) sozinho resultou em pequeno a diminuição moderada do nível de fosfo-ERK1 /2, e a combinação de α-tomatina (1 uM) e curcumina (5 mM) causou uma diminuição mais forte no nível de fosfo-ERK1 /2 do que qualquer dos agentes sozinho (Figura 5). O nível de fosfo-ERK1 em relação ao controlo (1,00) conforme determinado por medição da densidade da banda foi de 0,66 em células tratadas com a curcumina, 0,75 em células tratadas com α-tomatina e 0,31 em células tratadas com a combinação de α-tomatina e curcumina (Fig 5). O nível de fosfo-ERK-2 em relação ao controlo (1.00) foi de 0,58 em células tratadas com a curcumina, 0,69 em células tratadas com α-tomatina e 0,30 em células tratadas com a combinação de α-tomatina e curcumina (Fig 5).

Efeitos de α-tomatina curcumina e no crescimento de tumores PC-3 em ratinhos SCID

ratinhos SCID que possuem tumores PC-3 de xenoenxerto foram tratados com injecções IP com veículo (5 ul /g de peso corporal) , α-tomatina (5 mg /kg), curcumina (5 mg /kg), ou α-tomatina (5 mg /kg) + curcumina (5 mg /kg) três vezes por semana durante 30 dias. Como mostrado na Fig 6A, o tratamento com α-tomatina ou curcumina por si só teve um efeito inibidor moderado no crescimento de tumores PC-3, enquanto a combinação teve um efeito potente sobre a inibição do crescimento dos tumores. A média ± E.P. por cento do tamanho do tumor inicial, no final do experimento foi de 277,6 ± 18,6 para o grupo de controlo, 217,3 ± 10,5 para o grupo tratado com α-tomatina, 207,3 ± 15,6 para o grupo tratado com a curcumina, 151,2 ± 9,6 para a combinação-tratada grupo. A análise estatística usando ANOVA com o teste de comparações múltiplas de Tukey-Krama mostraram diferenças estatisticamente significativas no tamanho médio do tumor entre o grupo controle e do grupo tratado com α-tomatina (

p Art 0,05), entre o grupo controle e no grupo tratado com curcumina (

p Art 0,01), e entre o grupo controle e do grupo tratado com a combinação (

p Art 0,001). O tamanho médio do tumor no grupo de combinação foi significativamente menor do que no grupo tratado com α-tomatina (

P

0,05) e que no grupo tratado com a curcumina (

P

0,05).

ratinhos SCID machos foram injectados por via subcutânea com células PC-3 (2 × 10

6 células /0,1 ml) em suspensão em 50% de Matrigel em meio RPMI. Após cerca de 4 semanas, os ratinhos com tumores PC-3 de xenoenxerto (0,6-1,0 cm de largura e 0,6-1,0 cm de comprimento) foram injectados IP com veículo, α-tomatina (5 mg /kg de peso corporal), curcumina (5 mg /kg de corpo peso), e uma combinação de α-tomatina (5 mg /kg de peso corporal) e curcumina (5 mg /kg de peso corporal) uma vez a cada três dias durante 30 dias. a coloração imuno-histoquímica de PCNA foi realizado para determinar o efeito dos diversos tratamentos sobre a proliferação de células tumorais. (A) O tamanho do tumor foi expresso como uma percentagem do tamanho do tumor inicial. (B) O peso (g) de cada tumor foi medido no final da experiência em ratinhos após o sacrifício. (C) O peso corporal foi expressa como percentagem do peso corporal inicial. (D) Percentagem de células positivas para PCNA em tumores de animais tratados com veículo, α-tomatina, curcumina ou a combinação de α-tomatina e curcumina. micrografias representativas da coloração imuno-histoquímica de PCNA nos tumores do grupo de controlo (E), o grupo tratado com α-tomatina (F), o grupo tratado com a curcumina (L) e o grupo tratado com a combinação (H) são mostrados. Setas pretas indicam coloração com PCNA positivos e setas brancas indicam PCNA positivo negativo.

O peso de cada tumor foi também medido em cada rato, no final da experiência após o sacrifício. O peso do tumor de ratinhos individuais em cada grupo de tratamento é apresentado na Fig 6B. A média ± E.P. para o peso do tumor (g) foi de 0,69 ± 0,05 para o grupo de controlo, 0,52 ± 0,04 para o grupo tratado com α-tomatina, 0,50 ± 0,04 para o grupo tratado com a curcumina, 0,33 ± 0,04 para o grupo tratado com a combinação. A análise estatística usando ANOVA com o teste de comparação múltipla de Tukey-Krama mostrou que o peso médio do tumor no grupo de combinação foi significativamente mais baixa do que no grupo tratado com α-tomatina (

P

0,05) e em que tratados com curcumina grupo (

p Art 0,05). Obteve-se um bom relacionamento entre o tamanho do tumor (medida de animais vivos antes do sacrifício) e peso do tumor (medida após o sacrifício) em ratinhos individuais (

r

= 0,804). O efeito dos diversos tratamentos sobre o peso corporal é mostrado na Fig 6C. A análise estatística usando ANOVA com o teste de comparação múltipla de Tukey-Krama mostrou que as diferenças na percentagem de peso corporal inicial entre o grupo de controlo e qualquer do grupo de tratamento não foram estatisticamente significativas (

P

0,05).

efeitos de α-tomatina curcumina e sobre a proliferação de tumores PC-3

os efeitos de α-tomatina e curcumina sobre a proliferação de tumores PC-3 foi investigada através da determinação da expressão de antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) em células tumorais. As secções de parafina de PC-3 tumores foram coradas com anticorpo PCNA. Como mostrado na Fig 6D, o tratamento dos ratinhos com α-tomatina ou curcumina por si só reduziu o número de células PCNA positivas nos tumores. O tratamento combinado com α-tomatina curcumina e teve um efeito mais potente sobre a diminuição do número de células PCNA positivas do que qualquer um dos agentes utilizados isoladamente (Figura 6D). As diferenças no número de células positivas para PCNA foram estatisticamente significativas entre o grupo tratado com a combinação e o grupo tratado com α-tomatina (

P

0,01), e entre o grupo tratado com a combinação e a curcumin- grupo tratado (

P

0,01). Uma boa correlação entre células positivas PCNA e peso do tumor em ratos indivíduo foi encontrado (

r

= 0,72).

Discussão

Embora estudos anteriores mostraram que α-tomatina ou curcumina células inibidas de câncer de próstata [17, 26, 28, 33, 34], os efeitos e os mecanismos desses dois agentes em combinação sobre o crescimento e apoptose de células cancerosas da próstata

in vitro

e

in vivo

não têm sido relatados. No presente estudo, foi testada a nossa hipótese de que a baixas concentrações de curcumina e α-tomatina em combinação sinergicamente irá inibir a activação de NF-kB que conduz à inibição do crescimento forte e indução de apoptose em células de cancro da próstata. O nosso estudo mostrou que α-tomatina e curcumina sinergicamente em combinação inibiu o crescimento e a apoptose induzida em células PC-3 de cancro da próstata, e estes efeitos foram associados com a sinergia dos dois compostos em diminuir a actividade de NF-kB. Estudos anteriores mostraram que uma concentração mais elevada de curcumina foi necessária para inibir o crescimento de células de cancro da próstata (IC

50 ≈ 20 uM) [16, 35]. No entanto, a biodisponibilidade da curcumina é baixa [11]. Uma estratégia eficaz é combinar uma baixa concentração de curcumina com outro agente anti-cancro. As combinações de baixas doses dos agentes anticancerígenos que actuam por mecanismos diferentes podem ser mais eficazes com menos toxicidade do que os compostos individuais em doses mais elevadas. No nosso estudo, verificou-se que uma baixa concentração de curcumina (5 uM), em combinação com uma baixa concentração de α-tomatina (1 uM) sinergicamente inibiu o crescimento de células de cancro da próstata em cultura. Além disso, esta combinação inibiu fortemente o crescimento de tumores PC-3 de xenoenxerto em ratinhos SCID. Para o melhor de nosso conhecimento, este é o primeiro relatório indicando um efeito combinado forte de baixas concentrações de α-tomatina e curcumina em células de câncer de próstata.

O fator de transcrição NF-kB é um importante regulador para o crescimento celular e sobrevivência em uma variedade de células, incluindo células de cancro da próstata [36-38]. NF-kB foi mostrado para ser constitutivamente activado no cancro da próstata invasivo [39-41]. A activação do NF-kB está relacionado com a progressão do cancro da próstata, devido à regulação transcricional dos seus genes responsivos [41]. Além disso, a activação de NF-kB prevê um elevado risco de recidiva nos pacientes com doença localizada [40, 42]. Portanto, o NF-kB pode servir como um alvo terapêutico para o tratamento do cancro da próstata. Curcumina a concentrações mais elevadas (20-50 uM) foi demonstrado inibir a activação do NF-kB [17, 43].