Humana
Abstract
Ambos S100A14 e S100A16 são membros da família de proteínas S100 multifuncional. A formação de homo /heterodímeros é considerado como um dos principais mecanismos de proteínas S100 para executar as suas diversas funções celulares. Ao empregar uma tela clássica de levedura de dois híbridos (Y-2 H), identificou-se S100A16 como o parceiro de interacção única de S100A14. Essa interação foi verificada por meio de co-imunoprecipitação, dupla imunofluorescência indireta e imunomarcação dupla de espécimes de carcinoma epidermóide de boca e mucosa oral normal. O significado funcional desta interacção foi examinada pelo emprego retroviral mediada por sobre-expressão e knock-down destas proteínas em várias linhas celulares de cancro. A sobre-expressão e knock-down de S100A14 levou a concomitante para cima e para baixo-regulação da proteína S100A16 nas linhas celulares examinadas. No entanto, não houve aumento da regulação do ARNm em cima S100A16 S100A14 sobre-expressão, o que indica que a modulação da expressão S100A16 não foi devido à actividade de transcrição reforçada mas possivelmente por regulação pós-transcricional. Em contrário, a sobre-expressão de S100A16 não esteve associada com a sobre-regulação de ARNm S100A14 nem a sua proteína, sugerindo uma regulação unidireccional entre S100A14 e S100A16. tratamento com ciclo-heximida celular inibidor de síntese de proteínas demonstraram uma degradação intracelular dependente do tempo de ambas as proteínas S100A16 e S100A14. Além disso, a regulação do S100A16 e S100A14 degradação foi encontrado para ser independente dos clássicos proteossomo e lisossomais vias de degradação de proteínas. Será, portanto, mais estudos necessários para compreender o significado funcional desta interação e os mecanismos de como S100A14 está envolvido na regulação da expressão S100A16
Citation:. Sapkota D, Costea DE, Ibrahim SO, Johannessen AC, Bruland O (2013) Interage S100A14 com S100A16 e regula a sua expressão em células cancerosas humanas. PLoS ONE 8 (9): e76058. doi: 10.1371 /journal.pone.0076058
editor: Zhihua Liu, da Academia Chinesa de Ciências Médicas, China
Recebido: 14 Março, 2013; Aceito: 20 de agosto de 2013; Publicação: 27 de setembro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Sapkota et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este estudo foi financiado pela Universidade de Bergen (fundo de pós-doutoramento, DS) e Bergen Fundação de Investigação médica (DEC). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
A família de proteínas S100 é um grupo multifuncional de proteínas de ligação de cálcio EF-mão. Esta família consiste de pequenas proteínas ácidas (10-12 kDa) que são expressas apenas em vertebrados de um modo específico de células e tecidos. Até à data, a proteína S100 25 membros foram descritas em seres humanos. Os membros da proteína S100 foram mostrados para regular um número de processos biológicos como o ciclo celular, motilidade celular, a transdução de sinal, a fosforilação da proteína, transcrição, a sobrevivência celular e apoptose, relacionados com o desenvolvimento normal e a carcinogénese [1,2]. Apesar destes diversos papéis funcionais, as proteínas S100 não possuem quaisquer actividades enzimáticas para explicar as suas actividades celulares [3,4]. Um dos mecanismos para as suas funções celulares variadas, é a capacidade da maioria das proteínas S100 interajam directamente com uma série de outras proteínas celulares, modulando assim as suas funções [3]. Vários membros de proteínas S100 podem formar homodímeros /oligómeros (por exemplo: S100A4 [5], S100B [6]) ou heterodímeros (por exemplo: as interacções entre S100A8 e S100A9 [7], entre S100A4 e S100A1 [8], entre S100B e S100A6 [6]) e esses homo formação /heterodimer- é considerado importante para as suas funções celulares.
S100A14 é uma adição recente para a família de proteínas S100 [9,10]. A expressão diferencial de S100A14 foi avaliado num número de cancros humanos [9,11]. Recentemente, relatou um papel de S100A14 na regulação da proliferação e invasão de carcinomas de células escamosas orais (epidermóide estudados) [12,13]. S100A14 foi encontrado para modular a expressão de várias moléculas, incluindo p21, MMP1 e a MMP9 em células-derivadas CEB [12,13]. Além disso, o papel biológico de esta proteína foi relatada em outros cancros humanos, tais como esófago [14] e os cancros do cólon [15]. No entanto, o mecanismo preciso e sinalização molecular de S100A14 no cancro humano não é totalmente compreendido. Sendo predominantemente uma proteína membranosa [12] com o local de N-miristoilação de terminal-N [9], pode-se especular que S100A14 pode interagir com outras proteínas potencialmente envolvidas na transdução de sinal. Por conseguinte, S100A14 foi mostrado para interagir de um modo dependente de cálcio com nucleobindin [10], uma proteína sugerido para ser envolvido na transdução de sinal acoplado à proteína G [16]. No entanto, não foi examinada a capacidade de formar heterodímeros S100A14 para com outras proteínas S100. Neste estudo, mostramos que S100A14 interage com uma outra proteína S100, o S100A16, e modula a sua expressão em linhas celulares de cancro humano.
Materiais e Métodos
cultura celular e tratamentos
As células escamosas orais derivadas de carcinoma de linhas celulares: CaLH3 [17], H357 [18], VB6 [19] e OSCC1 [13] foram cultivadas como descrito anteriormente [12]. células HeLa (ATCC, CCL-2
TM) foram rotineiramente mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (cat no: D6429, Sigma) suplementado com FCS a 10%. Todas as linhas celulares foram cultivadas em ambiente humidificado com 5% de CO
2 a 37 ° C. Vinte e quatro horas antes do tratamento com inibidores, 1,0×10
5 a 1.5×10
5 células por poço foram plaqueadas em placas de 6 poços. As células foram tratadas com 0, 50, 100 ou 150 ^ M de inibidor proteossomal MG-132 (cat no: C2211, Sigma) durante 5 horas e 10; 0, 50, 100 ou 150 cloroquina inibidor uM lisossomal (cat no: C6628, Sigma) durante 24 horas e 200 ug /ml de cicloheximida inibidor de síntese de proteínas (cat no: # 239763, Calbiochem) durante 0, 3, 5, 7 e 8 horas. Após os tratamentos, as células foram lisadas com tampão RIPA e 1X usado para imunoblotting. A expressão da proteína S100A16 foi calculado em relação à expressão de níveis de GAPDH (utilizando o software multi calibre, Versão 3.2, Fujifilm Corporation) e representados graficamente como a proteína S100A16 por cento restantes após tratamento ciclo-heximida (dados não mostrados). S100A16 meia-vida (
t
1/2) foi calculado usando o GraphPad Prism 5.03 para Windows (GraphPad Software, San Diego, Califórnia, EUA, www.graphpad.com).
dois Yeast ecrã híbrido (ecrã Y-2H)
as sequências de codificação de S100A14 humana foram fundidos em grelha com o domínio GAL4 DNA de ligação do vector pGBT9 para gerar construção isca pGBT9-S100A14. serviço de triagem Y-2H foi comprado de German Cancer Research Center, Heidelberg, Alemanha. Resumidamente, construção pGBT9-S100A14 foi co-transfectado com bibliotecas de queratinócitos de cDNA humana em
Saccharomyces cerevisiae
. Os clones positivos foram identificados por selecção TRP1 a 0 mM de 3-aminotriazol. Todos os clones positivos foram sequenciados pelo seqüenciamento Sanger. Os detalhes da construção isca pGBT9-S100A14 e protocolos de rastreio Y-2H estão disponíveis mediante solicitação.
Co-imunoprecipitação (Co-PI)
células CaLH3 foram lisadas em tampão de lise gelado ( 1X tampão RIPA, cat no: 89901, Pierce Biotechnology), suplementado com protease (kit de Halt cocktail inibidor de protease, cat no: 78410, Pierce Biotechnology) e fosfatase (cocktail inibidor de fosfatase 2, gato sem p 5726, Sigma) inibidores. Os extractos celulares foram pré-aclarados por incubação com proteína A /G PLUS-Agarose (cat no: sc-2003, Santa Cruz) durante 30 minutos. Quinhentos microgramas de extracto de células pré-aclarados foi incubada com 3 ^ g de anticorpo policlonal de coelho anti-humano-S100A14 (cat no: 10489-1-AP, Proteintech) ou anticorpo anti-humano policlonal de coelho S100A16 (11456-1-AP, Proteintech) para uma hora a 4 ° C sobre uma roda rotativa, na presença de CaCl 0-2 mM
2 ou CaCl 2 mM de
2 com 5 mM de EDTA. Apenas lisado (sem anticorpo) e anticorpo anti-soro policlonal de MMP9 (gato n °: SC-10737, Santa Cruz; isotipo IgG) foram utilizados como controlos para a co-IP. Em seguida, 70 mL de ressuspenso Proteína A /G PLUS-Agarose (cat no: sc-2003, Santa Cruz) foi adicionado à mistura lisado-anticorpo e incubadas durante a noite a 4 ° C numa roda rotativa. Após incubação, as esferas foram centrifugadas a 1000 x g durante 5 minutos a 4 ° C e o sobrenadante foi descartado. As esferas foram lavadas 4 vezes com PBS, ressuspenderam-se e ferve-se a 90 4 ° C durante 5 min em tampão de amostra 30 uL de SDS e imunotransf com anticorpo policlonal de coelho anti (11456-1-AP, Proteintech, Chicago, IL, EUA, 1 S100A16 humano- : 500 diluições) ou anticorpo policlonal de coelho anti-humano S100A14 (10.489-1-AP, Proteintech, 1: 1000 diluições)
vetores Construção e transfecção de expressão e shRNA
S100A14 vetor de expressão. foi construído como descrito anteriormente [12]. ADNc humano que codifica S100A16 foi amplificado utilizando os pares de iniciadores (F: 5 ‘-ATCCCGCGGCAGGGAGATGTCAGACTGCTA-3′ e R: 5’-TGAGGATCCCTAGCTGCTGCTCTGCTG-3 ‘) e subclonado no vector de expressão retroviral pRetroX-IRES-ZsGreen1 (Clontech Laboratories, Inc., CA , EUA). shRNA segmentação
S100A14
ARNm foi construído utilizando os seguintes oligonucleótidos: shRNA1 (F: 5′-GATCCCCTTGTGTAAGAGCCAAAGAATTCAAGAGATTCTTTGGCTCTTACACAATTTTTGGAAA-3 ‘; R: 5′- AATTTTTCCAAAAATTGTGTAAGAGCCAAAGAATCTCTTGAATTCTTTGGCTCTTACACAAGGG-3′), shRNA2 (F: 5’-GATCCCCAGGGTCTTTAAGAACCTACTTCAAGAGA GTAGGTTCTTAAAGACCCTTTTTTGGAAA- 3 ‘; R: 5′- AATTTTTCCAAAAAAGGGTCTTTAAGAACCTAC TCTCTTGAAGTAGGTTCTTAAAGACCCTGGG-3′), shRNA3 (F: 5’-GATCCCCGAACCTACTTCCTAATCTCTTCAAGAGAGAGATTAGGAAGTAGGTTCTTTTTGGAAA-3 ‘; R: 5′- AATTTTTCCAAAAA GAACCTACTTCCTAATCTCTCTCTTGAAGAGATTAGGAAGTAGGTTCGGG-3’). Os oligonucleótidos foram recombinados e inserido no ARNi-Ready pSIREN-RetroQ-DsRed-Express vector de expressão (cat. No: 632487, Clonetech). shRNA segmentação
gene LacZ foi utilizada como um controlo para a S100A14-shRNAs. linhas celulares de cancro foram infectadas com os derivados de retrovírus embalagem células (Phoenix A), escolhidas (GFP /DsRed como um marcador), que se propagam, verificados para a sobre-expressão e knockdown das respectivas proteínas e usado para ensaios funcionais.
extracção de ARN, a síntese de ADNc e quantitativa de RT-PCT (qRT-PCR)
o ARN total foi extraído das linhas celulares de cancro utilizando RNeasy tecido fibroso protocolo Mini kit (cat no: 74704, Qiagen Inc. , Valência, CA, EUA). Seguindo as instruções dos fabricantes, a 600 nanogramas de RNA total foi convertido em cDNA utilizando-High Capacity cDNA Archive sistema Kit (cat não: 4.368.814, Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Todas as amplificações qRT-PCR foram realizadas em Sequence Detector ABI Prism 7900 HT (Applied Biosystems, Foster City, EUA) como descrito anteriormente [12]. ensaio TaqMan para
S100A16
(Hs00293488_m1) e verde SYBR baseado qRT-PCR (utilizando os mesmos pares de iniciadores que para a construção do vector de expressão S100A14) foi realizada para quantificar
S100A16
e
S100A14
mRNAs nas linhagens de células cancerosas. Comparativo 2
método -ΔΔ Ct foi utilizado para quantificar a expressão de mRNA relativo.
Immunoblot
Vinte 5-40 mg de proteína foi resolvido em NuPAGE® Novex 4-12% ou 10 % gel Bis-TrisTris (Life Technologies, NY, EUA) em NuPAGE® MOPS /MES SDS tampão de corrida (Life Technologies, NY, EUA) e imunologicamente com coelho policlonal anti-humana S100A14 (10.489-1-AP, Proteintech, Chicago, IL, EUA, 1: 1000 diluições), anticorpo policlonal de coelho anti-humano-S100A16 (11456-1-AP, Proteintech, Chicago, IL, EUA, 1: 500 diluições monoclonal de ratinho) e anti-p53 humano (sc-263, Santa Cruz Biotechnologies, CA, EUA, 1: 1000 diluições) seguindo o protocolo padrão de transferência de western. Anti-GAPDH (SC-25778, Santa Cruz, 1: 5000 diluições) foi utilizada como um controlo de carga. As manchas foram visualizadas usando quimioluminescência aumentada (Supersignal
® West Pico; Pierce Biotechnology, Rockford, IL, EUA) e as imagens foram detectados em um scanner Fujifilm Las-4000
Double imunofluorescência indireta (DIF)
o uso de carcinoma epidermóide estudados e seus correspondentes mucosa normal para DIF e imuno-histoquímica foi aprovada pelo Comité Regional de Medicina e Saúde de Ética em Pesquisa, Western-Noruega. consentimento escrito foi obtido a partir do participante do estudo. Cinco uM secções de carcinoma epidermóide estudados e os seus correspondentes de mucosa normal foram de-parafinado, re-hidratadas de acordo com procedimentos padrão e a recuperação de epítopo induzida pelo calor foi realizada em tampão Tris-EDTA (pH 9,0) usando microondas (cat no: NN-L564W, Panasonic, Osaka , Japão). Em seguida, foi aplicado primeiro anticorpo primário (o anticorpo policlonal de coelho anti-S100A16, 11456-1-AP, Proteintech, 1:50 diluições) durante 1 hora à temperatura ambiente e lavou-se. As amostras foram incubadas com fragmento Fab de cabra anti-IgG de coelho (cat no 111-007-003, Jackson ImmunoResearch, 1:50 diluições) durante 2 horas, para permitir a comutação da IgG de coelho de cabra Fab [20]. Em seguida, as amostras foram incubadas com anti-rato GoatDyLight 488IgG (cat no 205-485-108, Jackson ImmunoResearch, 1:50 diluições) anticorpo secundário durante 1 hora, lavadas, bloqueadas com soro de cabra a 10% durante 1 hora e o segundo anticorpo primário , policlonal de coelho anti-S100A14 (cat no: 10489-1-AP, Proteintech, 1: 600 diluições), foi aplicado durante 1 hora à temperatura ambiente. Após a lavagem, o anticorpo secundário de cabra anti-coelho Alexa Fluor
® 568 (cat no: A-11011, Invitrogen, 1: 200 diluições) foi aplicada durante 1 hora, lavadas e os lâminas foram montadas em Prolongar
® ouro reagente antifade com DAPI (cat não: P36935, Invitrogen). As amostras foram examinadas usando Leica TCS SP2 AOBS (Leica Microsystems, Alemanha) microscópio confocal laser.
simples e dupla imuno-histoquímica (IHQ)
simples e dupla IHC foram realizadas nos cortes seriados de carcinoma epidermóide estudados e mucosa normal correspondente. IHC único para S100A16 e S100A14 foi realizada como descrito anteriormente [12]. Para dupla IHC, cinco uM secções foram de-parafinado, re-hidratadas de acordo com procedimentos padrão e a recuperação de epítopo induzida pelo calor foi realizada em tampão Tris-EDTA (pH 9,0) usando microondas (cat: NN-L564W, Panasonic, Osaka, Japão) . Após bloqueio com bloqueio da peroxidase e soro de cabra a 10%, as secções foram incubadas com anticorpo policlonal de coelho anti-S100A16 (cat no: 11456-1-AP, Proteintech, diluições de 1: 200) durante 1 hora à temperatura ambiente, lavou-se e anti-coelho secundário anticorpo conjugado com peroxidase de rábano polímero marcado (cat no: K4011, Dako, Golstrup, DK) foi aplicado e a reacção foi visualizada utilizando IMMPACT VIP (cat no: SK-4605, Vectorlabs, Califórnia, EUA) como substrato da enzima, resultando numa produto de reacção púrpura. Para evitar reactividade cruzada com a reação imunohistoquímica subsequente, os anticorpos das primeiras reacções foram desnaturadas por aquecimento das amostras em pH 6,0 Alvo Retrieval Buffer (cat não: S1699, DAKO, Golstrup, DK) usando microondas (1000 watts durante 2 minutos e 250 watts para cinco minutos e meio; NN-L564W, Panasonic, Osaka, Japão) [21]. Em seguida, as secções foram incubadas com peroxidase de bloco e soro de cabra a 10%, uma vez mais e o segundo anticorpo primário (soro policlonal de coelho anti-S100A14, 10489-1-AP, Proteintech, diluições de 1: 1400) foi aplicado e lavado. Depois disso, o anticorpo secundário anti-coelho conjugado com peroxidase de rábano polímero marcado (cat no: K4011, Dako, Golstrup, DK) foi aplicado e visualizada com IMMPACT SG (cat no: SK-4705, Vectorlabs, Califórnia, EUA), resultando numa cinza produto da reacção. Os espécimes foram então contrastadas com hematoxilina (cat não: S3301, DAKO, Golstrup, DK), desidratadas e montadas com meio de montagem EuKit. As amostras foram examinadas usando Leica DMLB microscópio.
Estatísticas
Os dados são expressos como média ± erro padrão da média (SEM). Para as análises estatísticas, Student’s-
t
teste (emparelhado) foi realizada utilizando GraphPad Prism 5.03 para Windows (GraphPad Software, San Diego, Califórnia, EUA, www.graphpad.com), com o nível de significância de 5% .
Resultados
S100A16 foi identificado como um parceiro de interação de S100A14 ambos
in vivo
nas células de levedura e
in vitro
na Câncer bucal células derivadas
Para identificar interagindo parceiros de S100A14, uma biblioteca de cDNA dos queratinócitos humanos foi rastreada com a isca pGBT9-S100A14 construir em
Saccharomyces cerevisiae
. Dos 54 clones positivos sequenciados, S100A16 humano foi identificado 53 vezes. DCAF8 foi identificado como sendo um parceiro de interacção positiva falsa de S100A14. A interacção entre as proteínas e S100A14 S100A16 foi verificada por meio de co-imunoprecipi tacão usando o cancro oral, derivado CaLH3-linha celular (Figura 1A). Embora relatórios anteriores mostraram interacção reforçada entre outras proteínas S100 na presença de quantidades crescentes de Ca
2 + concentrações, não foi possível detectar o aumento da imunoprecipitação entre S100A14 e S100A16 com o aumento do Ca
2 + concentrações (0,5 e 2 mM de CaCl
2) (Figura 1A). No entanto, não se observou interacção entre S100A14 e S100A16 quando 5 mM de ião de metal bivalente quelante EDTA foi utilizado juntamente com 2 mM de CaCl
2 (Figura 1A). ensaio de co-imunoprecipitação reversa, utilizando anticorpo específico para S100A16 confirmou ainda mais a interacção entre S100A14 e S100A16 proteínas (Figura 1B).
Quinhentos microgramas de extracto de células pré-purificadas de células foi incubado com CaLH3 S100A14 anti-anticorpo em a presença de CaCl 0-2 mM
2 ou 2 mM CaCl
2 com EDTA 5 mM (a) ou anticorpo anti-S100A16 (B), seguido por incubação com proteína a /G PLUS-Agarose. Os complexos imunitários foram coradas imunologicamente com anti-S100A16 (A) ou anticorpo anti-S100A14 (B). Apenas lisado (sem anticorpo) e anticorpo anti-MMP9 foram utilizados como controlos para a co-IP. (A) M, marcador de peso molecular; pista 1, entrada; pista 2, a apenas lisado; faixa 3, anticorpo de controlo anti-MMP9; pistas 4-7 (S100A14 anticorpo anti-): Pista 4, 0 mM CaCl
2; pista 5, CaCl 0,5 mM
2; pista 6, 2 mM de CaCl
2; pista 7, CaCl 2 mM de
2 com 5 mM de EDTA. (B) A pista 1, entrada; pista 2, a apenas lisado; faixa 3, anticorpo de controlo anti-MMP9; pista 4, o anticorpo anti-S100A16 com 0 mM CaCl
2.
S100A14 co-localiza com S100A16 de espécimes de carcinoma epidermóide estudados e mucosa oral normal
DIF e dupla IHC foram realizada em epidermóide estudados e mucosa normal correspondente a examinar a localização sub-celular de S100A14 e S100A16. DIF mostrou co-localização de proteínas membranosas e S100A16 S100A14 nas células epiteliais da mucosa oral tanto normal (Figura 2A1-A4) e CEB (Figura 2B1-B4). Paralelamente a estes resultados, a co-localização membranosa destas proteínas foi também observada nas secções seriadas de mucosa oral normal (Figura 2C1-C3) e em da ilha invasora de CEB (lesão bem diferenciados) (Figura 2D1-D3) por simples e dupla IHC.
localização celular da S100A14 e S100A16 foi examinado através da realização de DIF e IHC nas seções de formol fixa e parafina CCEO incorporado e tecidos da mucosa oral normal. Predominantemente de localização membranoso de S100A16 (verde), S100A14 (vermelho) e S100A16 /A14 (amarelo) foi visualizado nas células epiteliais da mucosa normal (A1-A4) e CEB (B1-B4) tecidos por DIF (Epth, epitélio; CT , tecido conjuntivo). Da mesma forma, com IHC simples e duplas nos cortes seriados, expressão predominantemente membranoso de S100A16 (roxo), S100A14 (cinza) e S100A16 /A14 (cor mista) foi detectado na mucosa normal (C1-C3) e no CCEO (D1 -D3).
proteína S100A16 mas não a expressão do mRNA é regulada por S100A14 em diferentes linhagens de células de câncer humano
o significado biológico da interação entre S100A14 e S100A16 foi próxima examinado por sobre-expressando S100A14 num número de linhagens de células cancerosas humanas (CaLH3, VB6, H357, OSCC1 e HeLa) utilizando uma estratégia de expressão do gene retroviral mediado. Os níveis de proteína S100A16 foram encontrados para ser aumentada em todas as linhas celulares examinadas após a expressão excessiva de S100A14 (Figura 3A). Além disso, shRNA mediada knock-down de S100A14 foi associado com a supressão da proteína S100A16 em CaLH3 e linhas celulares OSCC1 (Figura 3B). No entanto, não houve um aumento nos níveis de expressão de ARNm de S100A16 nestes S100A14 que sobre-expressam linhas celulares de cancro (Figura 3C).
(A) retroviral mediada sobre-expressão de S100A14 foi associada com up- concomitante regulação da proteína S100A16 em CaLH3, VB6, H357, OSCC1 e linhagens de células HeLa (-, construção de controlo; +, S100A14 construção de expressão). (B) Além disso, shRNA mediada knock-down de S100A14 em linhas celulares CaLH3 e OSCC1 foi associado com a regulação negativa da proteína S100A16 (-, construção de controlo; +, S100A14 shRNA constrói). (C) No entanto, não houve qualquer efeito nos níveis de
S100A16
expressão de mRNA por sobre-expressando S100A14 em CaLH3, VB6, e linhagens de células H357.
S100A14
e
S100A16
níveis de expressão de mRNA foram normalizados para
GAPDH
expressão de mRNA. As barras de erro representam SEM de 3 repetições biológicas feitos em 3 repetições técnicas. Student’s-
t
teste (emparelhado) foi realizada para análise estatística.
S100A16 não regula a expressão de
S100A14
mRNA ou proteína no cell- câncer humano linhas
próxima examinar se a sobre-expressão S100A16 também está associada com o concomitante alteração na expressão de S100A14 em linhas celulares de cancro. Não houve alteração apreciável nem no ARNm (Figura 4A) nem os níveis de proteína (Figura 4b) de S100A14 seguintes a expressão excessiva de S100A16 utilizando construções de expressão retrovirais.
Não houve efeito no ARNm (A) ou proteína (B) os níveis de expressão de S100A14 retroviral mediada por sobre-expressão de S100A16 em CaLH3 e linhagens de células H357 (-, construção de controlo; +, S100A16 construção de expressão).
S100A14
e
S100A16
níveis de expressão de mRNA foram normalizados para
GAPDH
expressão de mRNA. As barras de erro representam SEM de 3 repetições biológicas feitos em 3 repetições técnicas. Student’s-
t
teste (emparelhado) foi realizada para análise estatística.
proteínas Ambos S100A16 e S100A14 são degradados intracelularmente pelo mecanismo (s) independente do proteossomo e lisossomais vias
Usando o tratamento ciclo-heximida, a degradação dependente do tempo de S100A16 e S100A14 foi observada tanto no controlo e S100A14 sobre-expressando células CaLH3 (Figura 5A). Não houve uma diferença significativa na meia-vida S100A16 (
t
1/2) entre o controle eo S100A14 sobre-expressando células CaLH3 (~ 4,8 horas versus ~ 5,0 horas) (Figura 5A). Proteossómica lisossomais e vias estão envolvidas na degradação da maioria das proteínas intracelulares. O inibidor de proteossoma MG-132 bloqueia eficazmente a actividade proteolítica do proteassoma [22] e o inibidor de cloroquina inibe lisossomal hidrolases lisossomais pela redução da acidificação de compartimentos lisossomais endossomal /[23]. Ao tratar as células HeLa CaLH3 e com proteossómica (MG-132) e do lisossoma inibidores (cloroquina), o próximo examinou se estas vias foram envolvidos na degradação de S100A16. Não houve aumento significativo nos níveis de S100A16 foi observada após a inibição do proteossoma (dados durante 10 horas o tratamento com MG-132 não mostrado) (Figura 5B) ou vias lisossomais (Figura 5C). O nível de p53, utilizado como um controlo positivo para as experiências de inibição proteossómica, aumentou como esperado com o tratamento da MG-132 (Figura 5B). Além disso, nenhum apreciável aumento da regulação do S100A16 e S100A14 foi observada quer no controlo ou na S100A14 sobre-expressando células CaLH3 com MG-132 (Figura 5D) ou tratamentos cloroquina (Figura 5E).
(A ) células CaLH3 sobre-expressão de controle e S100A14 foram tratadas com cicloheximida inibidor de síntese de proteínas em um tempo de curso (0, 3, 5, 7 e 8 horas) e toda a lisados celulares foram coradas imunologicamente com anti-S100A16 e -S100A14 anticorpos. S100A16 expressão relativa (normalizada para a expressão da proteína GAPDH) foi representada graficamente contra o tempo-curso e meia-vida (
t
1/2) foi calculada para ambos o controlo e S100A14 sobre-expressando células CaLH3 (dados não mostrados). -, Construção de controlo; +, S100A16 construção de expressão. Ciclo, ciclo-heximida.
(B) linhas celulares CaLH3 e HeLa foram tratados com várias concentrações de inibidor de proteossoma MG-132 (0-150 uM) durante 5 e 10 horas (dados durante 10 horas não mostrado) e Os lisados de células inteiras foram coradas imunologicamente com anti-S100A16 -p53 e anticorpos. O tratamento com MG-132 está associada com a sobre-regulação de p53 (utilizado como um controlo positivo para as experiências de inibição proteossómica), mas não em ambas as S100A16 as linhas celulares.
(C) CaLH3 HeLa e linhas celulares foram tratados com várias concentrações de cloroquina inibidor lisossomal (0-150 uM) durante 24 horas e os lisados celulares totais foram coradas imunologicamente com o anticorpo anti-S100A16. tratamento cloroquina não está associado com a mudança na expressão S100A16 em ambas as linhas de células. As concentrações superiores a 50 uM de cloroquina resultou na morte de células HeLa excessiva e, por conseguinte, não usado na experiência. Cloro, cloroquina.
(D) Controlo e S100A14 sobre-expressando células CaLH3 foram tratados com várias concentrações de inibidor de proteossoma MG-132 (0-150 uM) durante 5 horas e os lisados celulares totais foram coradas imunologicamente com anti- e S100A16 -S100A14 anticorpos.
(e) de controlo e S100A14 sobre-expressando células CaLH3 foram tratados com várias concentrações de cloroquina inibidor lisossomal (0-150 uM) durante 24 horas e os lisados celulares totais foram coradas imunologicamente com anti- e S100A16 -S100A14 anticorpos. Cloro, cloroquina.
Discussão
Apesar dos diversos papéis funcionais desempenhados pelas proteínas S100, estas proteínas não possuem qualquer atividade enzimática para explicar as suas funções celulares diferentes [3,4 ]. Um dos mecanismos pelos quais as proteínas S100 exercem as suas funções celulares variadas é através de interagir com e modulando as funções de outras proteínas efectoras. Recentemente, nós [12,13] e outros [14,15] demonstraram um papel funcional de S100A14 na carcinogênese humana. Envolvimento de S100A14 na regulação da proliferação de células cancerígenas oral e invasão, por modulação da expressão de várias moléculas, incluindo p21, MMP1 e MMP9, foi relatado por nossos estudos recentes [12,13]. Esses achados nos levou a investigar potenciais parceiros de interação de S100A14 que poderia modulam suas funções celulares. Utilizando a tela Y-2H, identificamos S100A16, outro membro da família de proteínas S100, como o único parceiro de interacção verdadeira de S100A14. Esta descoberta foi surpreendente por diversas razões. Em primeiro lugar, considerando suas múltiplas funções na tumorigênese com modulação concomitante de expressão de várias outras moléculas, S100A14 era esperado para interagir com muitas proteínas celulares para executar suas funções diversas. Em segundo lugar, a presença do local de N-miristoilação de terminal-N da proteína S100A14 sugere que esta proteína pode interagir com outras proteínas potencialmente envolvidas na transdução de sinal [9]. Em terceiro lugar, S100A14 já foi mostrado para interagir com outras proteínas celulares, tais como nucleobindin [10] e RAGE [14], mas estes proteínas não foram detectadas no ecrã de corrente Y-2H. No entanto, os resultados de nosso atual ecrã Y-2H são consistentes com anteriores telas Y-2H para diferentes proteínas S100. Semelhantes aos nossos achados, interagindo parceiros para outras proteínas S100 de telas anteriores Y-2H também são amplamente dominado pela isoforma S100 proteína (s) (revisto em 24). Uma das razões sugeridas para S100 isoforma interacção dominados em Y-2H poderia ser uma função de Ca intracelular rigidamente controlado
2+ (200 nM) em células de levedura [25], que é muito abaixo do cálcio
K
d valores de muitas proteínas S100 (10-50 um) e que poderiam limitar a interação entre S100 presa e seus parceiros de interação não-S100 que exigem rigorosa Ca
2 + concentração para a interação ocorra. No entanto, em contraste com muitas outras proteínas S100, as análises estruturais sugerem que tanto S100A14 e S100A16 são de baixa afinidade Ca
2+ ligantes de iões com alterações conformacionais mínima após ligação com Ca
2+ [26,27] e, portanto, estrita Ca
2 + concentração pode não ser necessário para a interação entre essas duas proteínas. Na verdade, através do aumento do Ca
2 + concentração, não foi observado aumento imunoprecipitação entre S100A14 e S100A16 no estudo atual (Figura 1A). No entanto, não foi detectada nenhuma interação entre S100A14 e S100A16 quando 5mM de metal bivalente ion quelante EDTA foi utilizado (Figura 1A). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que a interacção entre S100A14 e S100A16 é dependente dos níveis basais de Ca
2+ e, possivelmente, outros iões metálicos divalentes nas células e aumento da concentração de Ca
2+ não necessariamente melhorar a interação, possivelmente porque ambos S100A14 e S100A16 são pobres Ca
2 + pastas com conformação semi-aberto, mesmo em apo-estado e este conformação pode não necessariamente mudar, mesmo após a ligação Ca
2 + íons.
consistente com os resultados de Y-2H e de co-imunoprecipitação, foi observada co-expressão localizada de S100A14 e S100A16 nas epidermóide estudados e mucosa normal (Figura 2) correspondente, indicando um possível significado funcional desta interacção. De facto, a sobre-expressão e knock-down de S100A14 em várias linhas celulares de cancro foi associada com concomitante para cima e a sub-regulação de proteína S100A16 (Figura 3A e B), mas não de ARNm (Figura 3C). Estes resultados indicam que S100A14 regula a expressão de S100A16 não ao nível da transcrição, mas possivelmente por pós-transcricional ou regulamento translacional. Ao contrário, nenhum efeito apreciável foi observada tanto no ARNm e os níveis proteicos de S100A14 quando S100A16 foi sobre-expresso em linhas celulares de cancro (Figura 4A e B), sugerindo uma regulação unidireccional entre S100A14 e S100A16 onde apenas S100A14 regula a abundância de proteínas de S100A16. Semelhante a S100A14, estudos recentes têm demonstrado a expressão diferencial de S100A16 em diferentes malignidades humanas, sugerindo um papel desta proteína em cancros humanos [28]. Considerando o papel de S100A14 na proliferação de células de cancro oral e invasão [12,13] e a sua capacidade para regular a expressão de S100A16, pode ser especulado que o heterodimero S100A14 \\ S100A16 pode ter um significado funcional em células cancerosas humanas.
Tendo observado um aumento apenas na proteína S100A16 e não em
S100A16
expressão de mRNA quando S100A14 era sobre-expressa em células cancerosas, especulamos que S100A14 pode estar envolvido na regulação da degradação da proteína S100A16.