Abstract

O genoma humano contém seis genes que codificam proteínas validado

in vitro

como activadores específicos das pequenas GTPases “proteína relacionada com Ras Ral-a” e “proteína relacionada com Ras Ral-B”, genericamente chamados factores de troca de nucleótidos de guanina (RAL-RalGEF). proteínas Ral são importantes contribuintes para Ras sinalização oncogénica, e

RAS

oncogenes são importantes em humanos não-pequenas células do pulmão Carcinoma (NSCLC). Portanto, neste trabalho, a contribuição RalGEF características oncogénicos e não oncogénicos de linhas de células NSCLC humanas, como de ancoragem dependente e independente do crescimento, sobrevivência celular, e a proliferação, foi investigada. Entre todos RalGEF humana, silenciamento de

RGL1

e

RALGPS1

não teve nenhum efeito detectável. No entanto, o silenciamento de qualquer

RGL2

,

RGL3

,

RALGDS

ou, em maior medida,

RALGPS2

crescimento da população de células inibidas em dependentes de ancoragem e condições independentes (até 90 e 80%, respectivamente).

RALGPS2

silenciamento também causou um aumento do número de células apoptóticas, até 45% da população de células em células transformadas BZR brônquicas. Em H1299 e A549, duas linhas celulares de NSCLC,

RALGPS2

silenciamento causou uma prisão de células em G0 /G1 de fase do ciclo celular. Além disso, foi associada com a modulação de importantes reguladores do ciclo celular: a proteína E3 ubiquitina ligase fase-S de proteína associada-quinase 2 (Skp2) foi fortemente regulada para baixo (tanto em ARNm e os níveis de proteína), e os seus alvos, a célula ciclo de inibidores de p27 e p21, foram-regulada. Estes efeitos moleculares não foram imitada por silenciar

RALA

,

RALB

, ou ambos. No entanto,

RALB

silenciamento causou uma inibição modesta da progressão do ciclo celular, que por H1299 células foi associado com a regulação da ciclina D1. Em conclusão,

RALGPS2

está implicado no controle da progressão do ciclo celular e sobrevivência no

in vitro

crescimento de linhas celulares de NSCLC. Esta função é largamente independente da Ral GTPases e associado a modulação da Skp2, p27 e p21 reguladores do ciclo celular

Citation:. O. Santos A, Parrini MC, Camonis J (2016) RalGPS2 é essencial para a sobrevivência e celular a progressão do ciclo das células cancerosas do pulmão, independentemente dos seus Estabelecido Substratos Ral GTPases. PLoS ONE 11 (5): e0154840. doi: 10.1371 /journal.pone.0154840

Autor: David J. Reiner, Texas A M University Health Science Center, United States |

Recebido: 13 Janeiro, 2016; Aceito: 20 de abril de 2016; Publicado em: 05 de maio de 2016

Direitos de autor: © 2016 O. Santos et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. o salário de AOS foi apoiado por uma bolsa da “Fondation de France” (Ref Engt 2008005019, https://www.fondationdefrance.org/) e um bolsa do “Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale” (INSERM, https://www.inserm.fr/), França, como “Soutien pour la formation à la recherche en translationnelle cancerologie” (Convenção n ° 201103) . O trabalho foi apoiado por subsídios da “Fondation de France” (JC: Ref Engt 2008005019), “Association pour la Recherche sur le Cancer” (JC: SFI20111203931; MCP: SFI20121205710, https://www.fondation-arc.org /), “Ligue Nacional contre le Cancer” (JC: RS12 /75-62, MCP: RS14 /75-54, https://www.ligue-cancer.net/) e pela Associação Christelle Bouillot (http: //bouillot-christelle.fr/). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução proteínas

Ras são pequenas GTPases frequentemente mutados no câncer humano. Eles têm muitas efectores a jusante, incluindo as pequenas GTPases “proteína relacionada com Ras Ral-A” (rala) e “proteína relacionada com Ras Ral-B” (RALB), que são activadas por factores de nucleótidos guanina (Troca RalGEF). A via RalGEF-Ral ganhou atenção especial após a descoberta de que a expressão de uma forma mutante da GTPase HRAS que especificamente e exclusivamente activa desta via de sinalização é suficiente para a transformação induzida por Ras de células humanas [1]. Existem seis factores de troca de nucleótidos de guanina Ral-específicos. Quatro deles, o Ral dissociação nucleótido guanina estimulador (RalGDS), o RAL nucleótido guanina dissociação estimuladores-like 1, 2 e -como -como 3 (RalGDS-like 1, -como 2 e 3 -como ou alternativamente RGL1, RGL2 e RGL3), abrigam Ras vinculativos domínios e, portanto, pode sinalizar directamente a jusante os proto-oncogenes Ras em relação aos GTPases Ral. Além disso, o factor de troca do nucleótido guanina Ral com o domínio PH e motivo de ligação de domínio SH3 1 (RalGPS1) e Ral factor de troca do nucleótido guanina com o domínio PH e motivo de ligação de domínio SH3 2 (RalGPS2) são dois Ras-independente RalGEF [2] . Ras-dependentes RalGEF (revisto em [3]) foram mais estudados do que RalGEF as Ras-independente, que funciona conhecidos estão limitados a citocinese de células HeLa [4] e diferenciação feocromocitoma de rato sob estímulo Fator de Crescimento Nervoso [5]. Além disso, apesar de extenso trabalho sobre rala e RALB GTPases contribuição para o cancro humano [6], apenas recentemente o seu papel no cancro do pulmão, frequentemente abrigando ras oncogénicas, tem sido relatada [7,8]. No entanto, o papel RalGEF em humanos não-pequenas células do pulmão Carcinoma (NSCLC) permanece desconhecida.

Neste trabalho, a contribuição dos seis genes RalGEF para a sobrevivência humana NSCLC de células, proliferação e características transformadas foi investigada. A principal estratégia era para silenciar sistematicamente cada RalGEF em linhas celulares de NSCLC de rolamento diferentes mutações de Ras (Tabela 1) e para estudar as contribuições funcionais de cada gene RalGEF. Desta forma, fomos capazes de descobrir funções insuspeitas de um determinado RalGEF, a proteína RalGPS2 na sobrevivência celular e transição de fase do ciclo celular G1-S.

Materiais e Métodos

celular linhas e cultura

HeLa eo NSCLC humano linhas celulares H23, H1299, A549 e H838, eram da American Type Culture Collection (ATCC, catálogo números de CCL-2, CRL-5800, CRL-5803, CCL -185, CRL-5844, respectivamente) e foram cultivadas de acordo com as recomendações do fornecedor. A linha celular HeLa humana foi cultivada em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (GIBCO, ref. 41966-029 Invitrogen) suplementado com FBS inactivado por calor a 10%, e 2 mM de L-Glutamina. linhas celulares de NSCLC foram cultivadas em meio RPMI-Glutamax (Gibco, ref. 61870-010, Invitrogen) suplementado com 10% de soro fetal de bovino inactivado pelo calor (FBS, MP Biomedicals, Ref. 092910154), 4,5 g /l de glucose (Ref. G8769 , Sigma) e 1 mM de piruvato de sódio (ref.15070-063, Invitrogen). Todas as células foram mantidas em condições de crescimento exponencial a 37 ° C numa atmosfera humidificada (90%), contendo 5% de CO

2. Rotineiramente, sem antibióticos foram adicionados ao meio de cultura e as culturas foram confirmados para ser livre de contaminação por micoplasma por reação em cadeia da polimerase (PCR) (VenorGeM Classic, ref. 11-1100).

células renais embrionárias humanas que expressam estavelmente o região precoce de SV40, a subunidade catalítica da telomerase hTERT HEK-HT (HekHT) e HEK-HT-Ras

G12V células (HekRasV12) foram gentilmente cedidas por Christopher Contador [9,10] e foram cultivadas em DMEM suplementado com 10 % de FBS inactivado pelo calor, 2 mM de L-glutamina, e antibióticos de selecção (higromicina 100 jig /mL, neomicina a 400 ug /ml, e no caso de HekRasV12 também puromicina 0,5 ng /ml).

BEAS 2B e BZR foram adquiridos a partir de ATCC (catálogo números CRL-9609 e CRL-9483, respectivamente) e foram cultivadas em meio LHC-9 (GIBCO, ref. 12680-013, Invitrogen) em placas revestidas (sem qualquer adição de BSA) . A solução de revestimento era constituída por 0,01 mg /mL de fibronectina (Sigma, Ref. F0895, Sigma-Aldrich) e 0,03 mg /mL de colagénio de tipo I (ref. 207050357, Institut de Biotech., França) em meio basal LHC com 0,01 mg /ml de BSA (Sigma). Para as células de divisão, ou o plaqueamento para as experiências, as células foram descoladas utilizando Accutase Solução (SIGMA, Ref. A6964, Sigma-Aldrich), centrifugadas e ressuspensas em meio fresco.

oligonucleótidos siRNA e transfecção de células

SiRNA foram comprados na maior parte da Eurogentec SA (Bélgica) sob a forma de cadeias duplas de recozido dessalinizada, seca ou em solução. A sequência de controlo siRNA (ON-TARGETplus Non-targeting siRNA # 1, com o nome Sint na forma abreviada) sempre foi comprado de Dharmacon, (Thermo Fisher Scientific, EUA). As sequências alvo estão descritos na Tabela 2. As concentrações de Stock -siRNA foram sempre foi confirmada através da medição solução absorvância a 260 nm, utilizando o coeficiente de extinção calculado pelo website da Dharmacon para cada híbrido siRNA (https://www.thermoscientificbio.com/custom- modificada com siRNA /), diluída em tampão de siARN (KCl 300 mM, HEPES 30 mM, pH 7,5, MgCl 1,0 mM

2 -de 5x solução tampão comprado de Dharmacon, EUA) e aliquotadas para minimizar a ciclos de congelação /descongelação repetidas. Em algumas experiências foram utilizados bancos de siRNAs, que consistiram em misturas de quantidades equimolares de 3 oligonucleótidos.

Os oligonucleótidos siRNA foram adicionados às células em forma de lipoplexos 5X preparadas de OPTIMEM (Invitrogen) com um reagente de transfecção comercial (Lipofectamina RNAiMAX, ref. 13778030, Invitrogen), alcançar a concentração final optimizada para cada linha de células (normalmente 10 nM ou 12 nM). A proporção de reagente de transfecção para ARNsi era ou um uL: 10 pmol ou 1 ul: 12 pmol, em todos os outros aspectos preparados de acordo com as instruções do fabricante. fatores experimentais foram otimizados para cada linha de células a fim de ter toxicidade transfecção mínimo (diferença entre não tratada e as células Sint-tratado) efeito de controle positivo e máximo (siPLK1).

resazurina ensaio de redução

Células foram plaqueadas a noite antes da transfecção em placas de 96 poços, a uma densidade optimizada para cada linha de células que garantida sub-confluência no ponto de tempo final. Não tratados, controles Sint e siPLK1 estavam presentes em cada placa. As condições óptimas foram aqueles onde, em média, a redução resazurina relativa de células tratadas com sint (sequência de controlo não-Targeting) foi acima de 75%, e de células tratadas com siPLK1 foi de 10% ou menos. Para a transfecção, o meio foi substituído por 64 ul de meio completo fresco, sem antibióticos e ARNsi: lipoplexos Lipofectamina RNAiMax foram adicionadas em 16 ul, a poços em quadruplicado. Meio fresco foi adicionado às cavidades em 24 ou 48 h após a transfecção. No ponto de tempo final (72 h para Hela, 96h para A549, H1299, HekHT e HekRasV12, e 120h para H23 células) o meio foi substituído por 200 ul de meio RPMI sem vermelho de fenol, contendo resazurina (SIGMA

®, Sigma-Aldrich Chemie GmbH) a 10 ug /ml e incubou-se a 37 ° C durante 2 h-4 h. A fluorescência foi lida com um leitor de placas a comprimentos de onda de 540 nm (excitação) e 620 nm (emissão), e os resultados foram expressos como percentagem do sinal de fluorescência das células não tratadas, após a subtracção de fundo.

Western blots

as células foram plaqueadas em placas de 6 poços durante a noite e antes da transfecção, o meio foi substituído por 2 ml de meio de crescimento fresco completo (sem antibióticos). As células foram tratadas com 0,5 ml de lipoplexos 5X de ARNip conforme descrito na secção anterior. 48 h a 96 h as células após a transfecção foram lavadas com solução salina de tampão fosfato sem cálcio e lisadas com tampão de lise Triton (1% de Triton X-100, MgCl 5 mM de

2, 150 mM de NaCl, 50 mM de Tris, pH 7,4) suplementado com inibidores de protease comprimido (Ref. 11873580001 Roche) de acordo com procedimentos padrão, ou directamente lisadas com 2X Laemmli tampão (Tris-HCl 62,5 mM, glicerol 15%, SDS 4%, azul de bromofenol a 0,01%, DTT 200 mM, pH 6,8) suplementado com inibidores de fosfatase e fervida. amostras de proteínas solúveis a partir de lisados ​​obtidos com Triton foi quantificada utilizando o kit de ensaio de proteína BCA (Pierce, Ref. 23225, Thermo Scientific), depois diluiu-se em tampão de lise para a mesma concentração entre tubos, tampão Laemmli adicionado a concentração 1X, e fervida. Os lisados ​​de tampão Laemmli foram quantificadas utilizando uma proteína turbidimétrico quantificação do doseamento (Ref. 740.967,250, Machery-Nagel) e diluída para concentrações equivalentes. As amostras foram carregadas em pré-moldado (4-15% ou nenhum “kD” geles de poliacrilamida de gradiente, Bio-Rad) ou em recém-fundido 10 ou 12% de poliacrilamida geles. Após a electroforese, as proteínas foram transferidas para uma membrana de transferência de nitrocelulose de 0,2 pM (Whatman). A seguir, foram utilizados os anticorpos primários e diluições: de ratinho anti-adaptina α (Ref 610502, BD Biosciences, 1:. 1000), de ratinho anti-rala (Ref 610222, BD Biosciences, 1:. 1000), de ratinho anti-actina (Ref . A5441, Sigma-Aldrich, 1: 10000), de coelho anti-RALB (Ref 3523, Cell Signaling, 1:. 500), de ratinho anti PARP clivada (Ref 552597, BD Pharmingen, 1:. 1000), de coelho anti-Ciclina D1 (Ref 2922, sinalização celular., 1: 1000), de ratinho anti-ciclina D3 (Ref 2936, sinalização celular., 1: 2000), de ratinho anti-p21 (Ref 2946, sinalização celular., 1: 1000), de coelho anti-p27 (Ref. sc-527, Santa Cruz, 1: 1000) (Ref. sc-7164, Santa Cruz, 1: 1000), de coelho anti-Skp2. Foram utilizados anticorpos secundários conjugados apropriados tanto para visualização de borrões por detecção de quimioluminescência aumentada (ocidental relâmpago

® Plus-ECL, PerkinElmer) ou LICOR Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR Biosciences).

real Quantitative tempo de transcrição reversa-PCR

as células foram plaqueadas a noite antes da transfecção e foram transfectadas, como descrito para análise de Western blot. No tempo indicado, o sobrenadante foi removido e as células foram lisadas com 350 ul de tampão de RTL RNeasy

® Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hildon, Alemanha) com extemporaneamente adicionado beta-mercaptoetanol, e mantidos a -80 ° C. O ARN total foi isolado com o RNeasy

® Mini Kit, de acordo com as instruções do fabricante, incluindo a eliminação de ADN genómico. A absorvância a 260 nm, e 260 /230-260 /280 rácios nm, foram utilizados para quantificar e determinar a qualidade do RNA isolado. 1 ug de ARN foi transcrito de forma inversa utilizando o iScript

™ cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad Laboratories) de acordo com o protocolo do fabricante. Quantitativa transcrição reversa-PCR em tempo real (qPCR) foi realizada utilizando quer os iniciadores específicos (adquirido na Sigma Proligo, Tabela 3) e SYBR Green mistura de PCR Master (Ref. 4367659, Applied Biosystems), ou conjuntos de sondas Taqman (Applied Biosystems, Tabela 4) e Taqman PCR master Mix (Applied Biosystems). As reacções foram realizadas em 25 ul (SYBR verde) ou 20 ul (Taqman) do volume final usando o termociclador Chromo4 (Bio-Rad Laboratories). A temperatura de emparelhamento e extensão foi de 60 ° C e os iniciadores foram a 300 nm. Em ensaios de SYBR Green o protocolo curva de fusão foi iniciado imediatamente após a amplificação para confirmar a especificidade da reacção. A percentagem de cada ARNm foi calculada pelo método Pfaffl [11] utilizando

beta-2-microglobulina

como gene de referência. eficiência Primer foi determinada experimentalmente a partir de curvas de calibração incluídos, pelo menos nas três primeiras reações, e um valor médio de eficiência foi utilizada nas outras vezes.

Trypan azul exclusão ensaio

as células foram plaqueadas em placas de 6 cavidades e foram transfectadas com ARNsi como descrito acima. Em cada intervalo de 24 h, ambos os sobrenadantes e as células foram descoladas com tripsina e recolhidas em tubos cónicos, centrifugado, em seguida, as células foram ressuspensas em aproximadamente 0,7 ml de meio fresco. As células viáveis ​​e não viáveis ​​foram contadas utilizando um contador de células automaticamente Vi-celular (Backman) que determina a viabilidade celular por exclusão com azul de tripano.

Anchorage crescimento independente

H1299 células foram plaqueadas em placas de 6 poços e transfectadas com ARNsi como descrito acima. No dia seguinte (aproximadamente 20 horas mais tarde), não aderente placas de 6 poços (de plástico não tratado ainda revestida com 0,01% de Pluronic, Sigma-Aldrich), foram revestidas com 2 ml de 0,75% de agarose de baixa temperatura de fusão (Sigma-Aldrich), preparado por mistura de volumes iguais de 1,5% de agarose preparada em água e meio completo 2X sem vermelho de fenol, e deixou-se solidificar à temperatura ambiente. Antes da utilização, a temperatura muito baixa de fusão de agarose a 0,75% foi preparada e mantida num banho de água a 37 ° C. As células foram recolhidas com Accutase, contadas, diluídas para a mesma concentração (25.000 /mL) e distribuído em tubos de polipropileno de 5 ml (0,8 ml por tubo). Uma alíquota da mesma suspensão de células foi distribuída em paralelo para replicar poços de placas de 96 poços em branco para confirmar entrada por ensaio CellTiter Glo (Ref. G7571, Promega). 3,2 ml de 0,75% de agarose foi cuidadosamente mas cuidadosamente misturado com as células e 1 ml /poço foi imediatamente colocadas em placas em triplicado. Após solidificação da agarose, meio adicional (sem vermelho de fenol) foi adicionado às cavidades, as placas foram transferidas para a incubadora de células e do meio líquido sobre o topo cuidadosamente substituído a cada 2-3 dias.

Após 14 dias, o meio foi removido, e 0,3 ml de uma solução de MTT a 0,05% em PBS foi adicionado a cada poço. As placas foram incubadas durante 30 min a 1 h a 37 ° C e, em seguida, digitalizado em alta resolução (Epson perfeição V700 de imagem) e colónias contadas utilizando o software ImageJ.

a distribuição do ciclo celular e da avaliação da caspase-3 activa por fluxo citometria

as células foram plaqueadas em placas de 12 cavidades e foram transfectadas com ARNsi como descrito acima. Às 72 horas pós-transfecção, os sobrenadantes foram recolhidos em tubos de 15 ml e colocar no gelo. As células foram colhidas com Accutase e adicionado a cada tubo respectivo sobrenadante. Os tubos foram centrifugados a 4 ° C, e os sedimentos celulares foram ressuspensos em PBS contendo 0,05% de BSA. As células foram fixadas e permeabilizadas através da adição de pré-arrefecida até -20 ° C 70% gota a gota às células de etanol, em seguida, mantidos em gelo durante pelo menos 30 min. As células foram lavadas com PBS, em seguida, com PBS contendo 0,05% de BSA, e ressuspenderam-se em 0,25 a 0,4 ml de PBS contendo 0,05% de BSA mais iodeto de propídio (50 ug /mL). RNase (5 ul de uma concentração de estoque de 10 mg /ml) e 6 uL de anticorpo anti-caspase-3 activa (Ref 559341, BD Biosciences) foram adicionados a 0,2 ml de células marcadas com o iodeto de propídio em 5 mL de tubos FACS, incubadas protegido da luz e à temperatura ambiente durante um mínimo de cerca de 15 min e analisados ​​por citometria de fluxo (BD ™ LSRII, BD Biosciences), ou mantidas a 4 ° C e adquirido este último o mesmo dia. Os dados foram analisados ​​no caso do Active Caspase-3 com FlowJo Software (Flojo, LLC), ou, no caso da distribuição do ciclo celular, com ModFit LT ™ (casa Verity Software).

Ral-GTP Pull baixo

as células foram plaqueadas em placas de 15 cm e colhidas ao mesmo tempo a monocamada de células foi inferior a 70-80% confluentes. Uma placa de cada vez, em ambiente frio, em gelo, as células foram lavadas uma vez com PBS gelado. As células foram lisadas com tampão de lise (1 ml, Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, NP40 a 1%, glicerol 15%, NaCl 200 mM, MgCl2 5 mM, suplementado com inibidores de protease) e os lisados ​​foram clarificados por centrifugação (2 min a 10000 rpm, em câmara fria). Os sobrenadantes foram aliquotadas em 3 tubos (para a quantificação de proteínas, manchas de Western e de entrada pull-down experiências), em seguida, imediatamente congelados em azoto líquido.

Glutation esferas magnéticas (Pierce # 88822) foram lavadas 3 vezes com 3 vezes de o seu volume de tampão de lavagem a (Tris-HCl 125 mM, pH 8, NaCl 150 mM, suplementado antes da utilização com inibidores de protease), incubado durante 30 min a 1 h, no mesmo tampão numa roda rotativa, a 4 ° C com lisados de

E

.

coli

células que expressam Ral domínio de ligação a partir da SEC5 (GST-SEC5-RBD, RBD sendo o N-terminal 1-99 aa de SEC5) [12,13], e novamente lavados 3 vezes com lavagem de fusão com o GST tampão A. em seguida, as esferas foram ressuspensas em tampão de lise e dividido em diferentes microtubos (esferas 40 ul de leito por microtubo)

.

Cada lisado foi descongelado e a quantidade desejada de proteína foi incubada durante 45 min a 1 h com a GST -Sec5-RBD-esferas na roda de rotação a 4 ° C. As pérolas foram então rapidamente lavadas duas vezes com 0,5 ml de tampão de lavagem B (Tris-HCl 25 mM, NaCl 40 mM, MgCl2 a 30 mM, pH 7,5). Em seguida, 15 ul de 2X tampão de amostra Laemmli foram adicionados a contas, que foram então cozidos 2 min, e imediatamente congelados ou carregados em gel.

Resultados e Discussão

RGL2, RGL3, RalGDS e RalGPS2 são requerida para in vitro ancoragem-dependente e independente de ancoragem de crescimento da população de células

começamos avaliando a necessidade de cada um dos seis RalGEF para o

in vitro

proliferação e /ou sobrevivência de quatro humana linhagens de células NSCLC abrigando diferentes mutações Ras (A549, H23, H1299, H838), em comparação com outras linhas de células onde as proteínas Ral e RalGEF foram estudados no passado: HeLa (câncer de colo do útero), HEK-HT-HRAS

G12V (linha de células transformadas, de agora em diante chamado HekRasV12) e seu par isogênico HEK-HT (linha celular imortalizada, aqui também chamado HekHT) [10]. Os detalhes sobre a histologia do tecido e estado de mutação Ras de linhas celulares utilizadas neste trabalho são apresentados na Tabela 1.

Eficiências dos oligonucleótidos de ARNsi contra o RalGEF (duas a três siRNAs por genes) foram confirmadas por qPCR (S1 Fig ): a expressão de ARNm alvo foi inferior a 30% do nível endógeno para todas as sequências de siRNA, às 72 horas pós-transfecção, confirmada em pelo menos duas linhas celulares independentes

o ensaio de redução de resazurina metabólica foi usada para medir a célula. crescimento populacional. Para cada linha celular, as condições de transfecção e a duração do período de cultura de células foram seleccionadas por assegurando: 1- células que não atingiram confluência durante o ensaio; 2- que o efeito inibidor do crescimento de um não-targeting siRNA (Sint, o controlo negativo) foi mínima ( 15-20%) em comparação com células não submetidos a transfecção (células não tratadas); e 3- que o efeito inibidor do crescimento de um ARNsi contra um controlo positivo, (escolhemos a quinase polo-like 1) era máxima (≥ 90%). Usando este ensaio, observou-se que

RGL1

e

RalGPS1

mRNA silenciamento não teve nenhum efeito detectável no crescimento da população de células (Fig 1A e 1E, respectivamente), sugerindo que eles são dispensáveis ​​para o crescimento da população celular , impactando substancialmente nem a sobrevivência nem a proliferação dessas células. No entanto, a persistência destas duas proteínas, devido à estabilidade de alta proteína não pode ser descartada, uma vez que não poderia seguir deterioração de proteína ao longo do tempo devido à indisponibilidade de anticorpos específicos. Esgotamento de RGL2, RGL3 ou RalGDS induzida inibição do crescimento parcial (variando de 12 a 70%, em comparação com sint, Fig 1B, 1C e 1D). Curiosamente, o silenciamento dos genes Ras-independente RalGEF

RALGPS2

induzida uma forte inibição do crescimento da população celular, em todas as linhas celulares de NSCLC testadas (até 90%, Figura 1F). Além disso, este efeito não era específico de linhas celulares de NSCLC, uma vez que também foi observada em linhas de células com origem em rim (HekHT /HekRrasV12) e colo do útero (HeLa), e numa linha de células não-transformadas (HekHT). A independência em relação à presença de um gene Ras activado que se poderia esperar para uma Ras-independente RalGEF.

(A-F) o crescimento da população celular em aderência foi medida usando o ensaio de redução de resazurina, e é expressa como percentagem de células não tratadas (não transfectadas) (média ± sEM,). Avaliou-se a partir de 72 a 120 h após a transfecção de células, dependendo da condição optimizada para cada linha de célula individual. Cada painel representa o efeito de silenciamento de um RalGEF com dois ou três oligonucleótidos siRNA independentes: (A)

RGL1

; (B)

RGL2

; (C)

RGL3

; (D)

RALGDS

; (E)

RALGPS1

; (F)

RALGPS2

. O efeito de cada siRNA foi estatisticamente em comparação com o efeito obtido com Sint por Two-way ANOVA e Bonferroni pós-testes (*

p

≤ 0,05, **

p

≤ 0,01, ***

p

≤ 0,001;

n

= 2 a 4 valores médios obtidos em experiências independentes, cada um feito em poços em quadruplicado). crescimento (G) Anchorage-independente de células H1299 foi avaliada ao longo de 14 dias e é expressa como o número de colónias relativamente significativo no que diz respeito a células tratadas com Sint. Os dados foram coletados a partir de experimentos independentes, onde siPLK1 (controle positivo) nenhum ou muito poucas colónias originaram. (H) Imagens ilustrativas de H1299 colónias em agarose aos 14 dias de crescimento após sint, siPLK1, siRalGPS2 # 231, e da piscina siRalGPS2, como indicado. A comparação estatística foi realizada por ANOVA com pós-teste de Dunnett. (*

p

≤ 0,05, **

p

≤ 0,01, ***

p

≤ 0,001;

n

= 2 (siRGL1 e siRALGPS1 ), 3 (siRalGPS1 e siRalGPS2) ou 4 (siRGL2, siRGL3 e siRalGDS) experiências independentes, cada um realizado em poços em triplicado.

Contrariamente às células imortalizadas, as células transformadas exibem a capacidade para sobreviver e proliferar em condições de crescimento independente de ancoragem. o efeito do esgotamento RalGEF no crescimento independente de ancoragem foi testado ao marcar o número de colônias de células H1299 em meio de agarose gelificado. Enquanto

RGL1

e

RALGPS1

silenciamento estiveste nenhum efeito detectável,

RGL2

,

RGL3

,

RALGDS

e

RALGPS2

transitória silenciar crescimento independente de ancoragem substancialmente inibida de células H1299, em paralelo com as observações feita em condições de aderência (Fig 1G). Curiosamente, o efeito inibidor de

RGL3

e

RALGDS

silenciamento do crescimento independente da ancoragem foi mais pronunciada (cerca de 75% de inibição) do que o efeito observado sobre aderente As células (cerca de 45% e de inibição de crescimento de 35%). Desde

RALGPS2

silenciamento exibido o fenótipo mais forte, toda a continuação dos trabalhos focados em RalGPS2.

RalGPS2 é necessário para a sobrevivência de células in vitro

Após o esgotamento dos RalGPS2 uma elevada percentagem do população de células exibido sinais fenotípicos de morte celular: células arredondamento para cima, destacando e formação de bolhas (S2 Fig). Além disso, o ensaio de exclusão com Trypan Blue demonstrou que a forte inibição do crescimento nos dias 3 e 4 após a transfecção de células H1299 (Figura 2A) foi, pelo menos, parcialmente devido a uma redução de 10 a 20% de viabilidade celular (figura 2B). Portanto, RalGPS2 é necessário para a sobrevivência da célula. Além disso, as células foram provavelmente morrer através da apoptose, tal como indicado pelo aumento de 10 a 15% do número de células com a caspase-3 activada tal como analisado por citometria de fluxo em células H1299 (Figura 2C), e detecção de clivada Poli [ADP-ribose ] polimerases (PARP) em Western Blot de células A549 (S3 Fig). A depleção de efeito RalGPS2 na apoptose foi estudada num HRAS

contexto G12V oncogene ao silenciar a sua expressão no par isogênico de linhas de células bronquiais BEAS-2B (imortalizado) e BZR (BEAS-2B expressando HRAS

G12V) . Curiosamente, caspase-3 ativação sobre o esgotamento RalGPS2 em células BZR foi cerca de 2 vezes mais frequente do que no isogênico imortalizada humana celular epitelial brônquica BEAS-2B (Fig 2D). Este resultado é sugestivo de HRAs

GV12 sensibilização induzida pelo oncogene de células para RalGPS2 para a sobrevivência, embora o efeito global sobre a população de células, avaliada por resazurina ensaio de redução, foi semelhante (S4 Fig), como para o outro par isogênico ( HekHT e HekRasV12, Figura 1).

(a) o número de células viáveis ​​e H1299 (B) a percentagem de viabilidade após a indução de RalGPS2-depleção foram obtidos diariamente durante quatro dias, com o ensaio de exclusão de azul de tripano e comparados estatisticamente por ANOVA de duas vias e Bonferroni pós-testes (*

p

≤ 0,05, ***

p

≤ 0,001;

n

= 2 experimentos independentes, cada uma em triplicado ). (C) A proporção de células que albergam a caspase-3 activa foi avaliada 72 horas pós-transfecção com siRalGPS2, por citometria de fluxo, em células H1299 e (D) no par isogénica do imortalizada BEAS-2B e HRAS

G12V células BZR -transformed. A significância estatística foi avaliada, respectivamente, pelo one-way ANOVA com pós-teste de Dunnett, **

p

≤ 0,01 e ***

p

≤ 0,001,

n

= 4 ou 5 experimentos independentes (C); e two-way ANOVA com Bonferroni pós-teste,

### p ≤ 0,001,

n

= 2 ou 3 experimentos independentes (D).

efeitos silenciar RALGPS2 ir além Rala e RALB

em seguida, pedimos até que ponto proteínas Ral estão implicados RalGPS2 jusante no crescimento da população e sobrevivência celular.

RALA

silenciamento não teve efeito sobre o crescimento da população celular (excepto para uma inibição do crescimento parcial 20% em apenas uma linha celular, H1299, dos seis testado), enquanto que em cima depleção RALB houve uma inibição parcial do crescimento em cinco das seis linhas celulares testadas (24 a 38% diferença média de Sint, Fig 3A), embora menos substancial do que o que foi observado por silenciar

RALGPS2

nas mesmas células (61 a 96% da diferença média Sint em linhas celulares de cancro do pulmão, 41 para 62% diferença média de Sint em linhas celulares de cancro não-pulmonares, Fig 1F). Além disso, em contraste com o papel estabelecido da RALB na sobrevivência celular [14], não observamos apoptose após depleção RALB Em nenhum linhas celulares de pulmão A549, nem H1299, tal como analisado por activação da caspase-3 (Fig 3B) e PARP clivada (Fig 3C). Estes resultados indicaram que a inibição do crescimento populacional induzida por

RALB

silenciamento não foi devido à morte das células, pelo menos, nestas duas linhas celulares de NSCLC, e levantada a possibilidade de que

RALB

silenciamento pode afectar células a progressão do ciclo, conforme foram abordadas na seção seguinte.

(a) o crescimento da população celular foi avaliada em linhas celulares indicadas no gráfico por resazurina redução de 72-120 h pós-transfecção, e expressa como percentagem de redução resazurina relativamente às células não tratadas. O efeito de cada siRNA foi estatisticamente em comparação com o efeito obtido com sint (controle negativo) por Two-way ANOVA e Bonferroni pós-testes (*

p

≤ 0,05, **

p

≤ 0,01, ***

p

≤ 0,001;

n

= 2 ou 3 experimentos independentes, cada uma a média obtida a partir de poços em quadruplicado). (B) a activação de caspase-3 foi avaliada por análise de citometria de fluxo 72 h pós-transfecção e é expressa como a percentagem da população de células com staning positivo. A significância estatística foi avaliada por ANOVA de uma via com pós-teste de Dunnett, mas nenhum se significância (

n

= 3 experimentos independentes). (C) Western blot das linhas celulares e pontos de tempo indicados mostram Rala e RALB regulação baixa proteína, clivada Poly [ADP-ribose] polimerases (Cl. PARP) imunodetecção e actina ou adaptina controle de carregamento.

trabalho de laboratório recente de Theodorescu mostrou que, em linhas celulares de cancro do pulmão, o efeito de silenciar

RALA

e /ou

RALB

é a linha celular dependente, e, provavelmente, dependente do tipo de mutação Ras presente [7] . Em consonância com este tipo de célula variabilidade, pudemos observar um aumento moderado da PARP clivada em Western blot com HeLa e linhas celulares H23 câncer de pulmão, mas não com A549 e linhas de células H1299 (Fig 3C), sugerindo que a morte celular pode certamente contribuir para