Abstract

O cancro é um problema de saúde pública mundial. Nos Estados Unidos sozinho, 1 em cada 4 mortes é devido ao câncer e para 2013 um total de 1,660,290 novos casos de câncer e 580,350 mortes relacionadas ao câncer são projetadas. perfilamento completas de múltiplos genomas de cancro revelou uma paisagem genético altamente complexo em que um grande número de genes alterados, variando de tumor para tumor, o impacto vias biológicas principais e processos. Isto tem implicações para o direccionamento terapêutico de sinalização redes no desenvolvimento de tratamentos para cancros específicos. O factor de transcrição NFkB é constitutivamente activa num certo número de tumores sólidos e hematológicos, e muitas vias de sinalização envolvidos no cancro são provavelmente ligado à activação de NFkB. Um mediador importante da actividade de NFkB é quinase activada por TGF-p 1 (TAK1). Aqui, nós identificamos TAK1 como uma nova proteína interagindo e alvo de receptor do fator de crescimento de fibroblastos 3 atividade (FGFR3) tirosina quinase. Demonstramos ainda que a activação de mutações em FGFR3 associados com ambos mieloma múltiplo e cancro da bexiga pode modular a expressão de genes que regulam a sinalização de NFkB, e promover tanto a actividade de transcrição NFkB e adesão celular de uma forma dependente da expressão de TAK1 em ambos os tipos celulares de cancro. Nossos resultados sugerem TAK1 como um potencial alvo terapêutico para cancros associados-FGFR3, e outras doenças malignas em que TAK1 contribui para a activação NFkB constitutiva

Citation:. Salazar L, Kashiwada T, Krejci P, Meyer AN, Casale M, hallowell M, et al. (2014) Fibroblasto Crescimento Receptor do Factor de 3 interage com e ativa TGF-quinase ativada 1 de fosforilação de tirosina e NFkB Sinalização em mieloma múltiplo e cancro de bexiga. PLoS ONE 9 (1): e86470. doi: 10.1371 /journal.pone.0086470

editor: Hari K. Koul, Louisiana State University Health Sciences Center, Estados Unidos da América

Recebido: 19 Agosto, 2013; Aceito: 09 de dezembro de 2013; Publicação: 23 de janeiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Salazar et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Multiple Myeloma Research, Cancer Center Chao Família Comprehensive na UCI, Elsa U. Pardee Foundation, Ministério da Educação, Juventude e Desportos da República Checa (KONTAKT LH12004), Czech Science Foundation (P305 /11/0752). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro é uma doença complexa decorrente da aquisição de mutações somáticas que desregular sinalização vias centrais para a proliferação e sobrevivência celular, angiogênese e metástase. A desregulação da via de sinalização de FGFR3 tem sido implicado em vários tipos de cancro, carcinoma urotelial mais notavelmente célula (UC) e mieloma múltiplo (MM). carcinomas de células uroteliais representam mais de 90% dos cancros da bexiga, que têm uma incidência mundial de mais de 350.000 novos casos anuais e classificar como a terceira doença maligna mais comum em homens e a décima mais comum nas mulheres nos Estados Unidos [1]. Superexpressão ou ativação de mutação do FGFR3 é a alteração genética mais frequente em UC (Avaliado em [2]). Mieloma múltiplo, um câncer das células B diferenciadas terminalmente, é o segundo câncer hematológico mais comum com uma estimativa Sociedade Americana de Câncer de 22.350 novos casos para 2013. Entre os casos de MM com o pior prognóstico são aqueles 15% com o t (4; 14) translocação, que tem como alvo tanto o FGFR3 e MMSET (revisto em [3] – [5]). Estudos recentes indicam que esta translocação pode ser o maior clone no diagnóstico ou, pelo contrário, observou-se apenas com o tempo de recidiva [6]. No entanto, o mecanismo subjacente a agressividade do t (4; 14) mieloma permanece pouco clara e a contribuição relativa de FGFR3 e MMSET como oncogenes putativos é controversa, pois 25% do t (4; 14) tumores não têm expressão FGFR3. A aquisição de mutações de ativação FGFR3 (5-10% de t (4; 14) dos casos), com a progressão da doença indica um papel para FGFR3 em MM patogênese e estudos iniciais demonstram o potencial oncogênico de mutante activado FGFR3 [4]. Também foi demonstrado mais recentemente que o de tipo selvagem de FGFR3, como é expresso na maioria t-FGFR3 positiva (4; 14) tumores, pode contribuir para a oncogénese células B [7]. Além disso, uma grande quantidade de dados pré-clínicos demonstram a eficácia dos inibidores da tirosina-cinase do receptor e anticorpos neutralizantes contra células que expressam MM mutações de activação de FGFR3 e receptor de tipo selvagem (revisto em [3] – [5]). Da mesma forma, a inibição do FGFR3 pode induzir a paragem do ciclo celular e /ou apoptose em UC [8] [9], ambos

in vitro

e

in vivo

, fornecendo validação que FGFR3 e vias de sinalização a jusante representar alvos terapêuticos potencialmente importantes para o tratamento de cancros associados-FGFR3.

FGFR3 é um de quatro receptores de tirosina-quinase que medeiam os efeitos do FGF em diversos processos celulares, incluindo a proliferação, diferenciação, migração e. A activação dos receptores desencadeia vias de transdução de sinais envolvidos na oncogénese, incluindo a Ras /ERK /MAPK, PLCy /PKC, PI3K, e vias STAT [10]. Evidências mais recentes indicam que a sinalização do receptor FGF também pode ativar NFkB [11], [12], a activação aberrante de que é frequentemente observada em cancro humano [13], [14] e estreitamente correlacionada com características de câncer [15]. Um intermediário chave na sinalização de NFkB, cinase TGFp-activada 1 (TAK1), funções a jusante de várias vias de sinalização, a sobrevivência das células regulação, diferenciação e respostas inflamatórias [16], e permanece como um IKK-quinase chave da via de NFkB canónica [ ,,,0],17]. Química e inibição genética de TAK1 promove a apoptose em tumores de pele [18] e um subconjunto de cancros do cólon [19], bem como diminuir chemoresistance em células de câncer de mama e de cólon [20] e chemoresistance ea actividade NFkB em células de câncer de pâncreas na cultura [ ,,,0],21]. Além disso, a supressão da sinalização TAK1 reduz a ativação de NFkB na cabeça humana e do pescoço escamoso linhas de células de carcinoma de células [22], as células de carcinoma do ovário [23], e linhas celulares de cancro da mama [24], e bloqueia a adesão de células do cancro da mama, invasão e metástase in vitro [25]. TAK1 não foi investigado no contexto de MM ou câncer de bexiga; no entanto, é alvo a jusante, NFkB, emergiu como um dos mais potentes motores de tumorigênese em MM, com até 82% de amostras MM expressando moléculas de ativação da assinatura [26], [27]. Consistente com este papel chave oncogénica, vários fármacos que são eficazes contra MM, incluindo bortezomib, talidomida, e lenalidomida, a activação de NFkB bloco (revisto em [28]). Na UC, supressão da actividade NFkB potencializa os efeitos apoptóticos de agentes e citocinas quimioterápicos [29], [30].

Usando uma combinação de levedura de dois híbridos e rastreio genético microarray juntamente com análise de sistemas via, identificamos TAK1 como um romance interagente e alvo da actividade da tirosina quinase FGFR3. Demonstramos ainda um papel para TAK1 como um regulador positivo da actividade de NFkB jusante de FGFR3 em ambos mieloma múltiplo e carcinoma urotelial, dois cancros com envolvimento FGFR3 demonstrado [10], [31], com efeitos moduladores sobre a adesão celular.

Métodos

Cultura de células e Transfecção

FGFR3-negativo (RPMI-8226) e do tipo selvagem (LP1) linhas celulares MM humana foram obtidos a partir da Colecção alemã de Microrganismos e culturas celulares [DSMZ; Braunschweig, Alemanha]; FGFR3 MM mutante células (KMS-11; Y373C) derivados de um paciente MM e estabelecidas a Kawasaki Medical School [32], foram generosamente fornecidos pelo Dr. P Leif Bergsagel. A linha celular de cancro da bexiga FGFR3 mutante, MGHU3 (Y375C), uma gentil oferta do Dr. Margaret Knowles (Universidade de Leeds, Leeds, Reino Unido), foi derivado de um grau de um tumor [33]. culas do MM e UC foram mantidas em meio RPMI 1640 (Hyclone; Thermo Scientific, Rockford, IL) e as células HeLa e HEK293 (ATCC) em DMEM (Hyclone), ambos os meios complementados com soro bovino fetal a 10% (Invitrogen). transfecção transiente de células HeLa e HEK293 foi conseguida utilizando Lipofectamina 2000 (Life Technologies; Grand Island, NY) de acordo com o protocolo do fabricante e MM e UC linhas transfectadas utilizando o sistema de néon (Life Technologies). Seguindo o procedimento do fabricante, 1 × 10

6 UC ou 2 × 10

6 MM células foram suspensas em solução de suspensão de 100 ul contendo 5 ug siRNA (Dharmacon) ou plasmídeo e pulsou no âmbito do programa 3 para UC e um programa de 15 ( KMS-11) ou 20 (RPMI-8226) para células MM.

anticorpos e reagentes

anticorpo FGFR3 (B-9, C-15) e /2/4 anticorpos FGFR1 foram de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). Os anticorpos para TAK1, ERK, fosfo-ERK, fosfo-tirosina (4G10), p65 e p84 eram da Millipore (Billerica, MA), como foi IgG de coelho normal. FGF1 humano recombinante foi obtido a partir de R D Systems (Minneapolis, MN) e PD173074 a partir de Sigma (St. Louis, MO). Non-segmentação e siRNA específico da TAK1 (ambos ON-TARGETplus SMART-piscina) foram adquiridos de Dharmacon (Thermo Scientific). O colagénio tipo IV humano foi da Sigma.

Construções O plasmídeo

Untagged ou C-terminalmente construções FGFR3 FLAG-etiquetada tem sido descrito anteriormente [34], assim como construções para FGFR2, e -4 [ ,,,0],35], [36]. O vector que expressa FGFR1 foi gerado por clonagem de comprimento completo humana FGFR1 ORF no vector pcDNA3.1 (Life Technologies), de acordo com o protocolo do fabricante. TAK1 murino marcada com HA foi gentilmente cedido pelo Dr. Hiroaki Sakurai (Universidade de Toyama, Toyama, Japão). NF-kB-Luc era da Agilent Technologies (Santa Clara, CA), e controle PRL-TK

Renilla

da Promega (Madison, WI).

levedura 2-hybrid

Uma tela de levedura de dois híbridos foi efectuada tal como previamente descrito [37]. Resumidamente, as sequências de constitutivamente activa (K650E) dos FGFR3 domínio citoplasmático de aminoácidos 399-806) humanos de tipo selvagem ou foram fundidos com o domínio de ligação de LexA-ADN no plasmídeo pBTM116 e utilizado para pesquisar uma biblioteca de proteínas de fusão de condrócitos humanos com a codificação domínio de activação de Gal4 (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA) na linhagem L40 de

Saccharomyces cerevisiae

. Os transformantes foram cultivadas 3-4 dias em meios selectivos e as colónias resultantes submetidos a um ensaio de filtro de elevador β-galactosidase. Subsequente domínio de mapeamento foi realizado da mesma forma, usando sequências citoplasmática de domínio truncadas FGFR3 como isca, emparelhado com sequências TAK1 full-length ou C-terminal como presa.

imunoprecipitação e análise Immunoblot

As células foram lavadas em PBS frio contendo ortovanadato de sódio 1% e lisaram-se em tampão de Nonidet P-40 a 1% de lise (20 mMTris-HCl, pH 7,5, NaCl 137 mM, 1% de Nonidet P-40, EDTA 5 mM, NaF 50 mM, 1 mM ortovanadato de sódio, fluoreto de fenilmetilsulfonilo 1 mM, 10 ug /ml de aprotinina). Os lisados ​​foram pré-limpo com esferas de proteína A-Sepharose (Millipore) e as imunoprecipitações realizada durante a noite com anticorpo de 2 ug. Os imunoprecipitados foram lavados 3 vezes com tampão de lise, fervida 5 min em tampão de amostra e resolvidas por 10% SDS-PAGE. As membranas foram bloqueadas com tampão de bloqueio A partir do bloco (Thermo Scientific) e sondaram-se como indicado. A ligação do anticorpo foi detectada utilizando SuperSignal West Pico ou SuperSignal Oeste Dura substrato quimioluminescente (Thermo Scientific). Para retestará com outros anticorpos, as membranas foram despojados de anticorpos ligados usando a Restauração do tampão de extracção (Thermo Scientific). Onde indicado, densitometria foi realizada utilizando o ImageJ. Deve notar-se que os co-imunoprecipitações de Figura 1E foram realizadas utilizando 30 ul de Dynabeads lavada (Life Technologies), em vez de esferas de proteína A-Sepharose e sem um passo de preclear, mas foram tratadas de outro modo como descrito acima.

( a) Esquema de domínios FGFR3 e TAK1 utilizado para a levedura de dois híbridos de rastreio e subsequente mapeamento da interacção em levedura. (B) endógena TAK1 interage com cinase morta (K508M), de tipo selvagem, e constitutivamente activa (K650E) FGFR3 em células HeLa. Os valores numéricos representam a proporção de co-precipitado com FGFR3 TAK1. (C) FGFR3 e TAK1 (tanto endógena) interagem em LP1 (FGFR3WT) e KMS-11 (FGFR3Y373C) várias linhas de células de mieloma. A linha 8226 é negativo para FGFR3. (D) endógena TAK1 interage com FGFR3 em células de cancro da bexiga MGHU3 transfectadas com o tipo selvagem FGFR3. MGHU3 também expressam o FGFR3 ativando mutação, Y375C. (E) TAK1 (endógeno) interage com sobre-expresso de FGFR1, -2, -4 e em células HEK293. TAK1 no lisado total de transf-FGFR1 é detectável após uma exposição mais prolongada (dados não mostrados). Para todas as manchas (B-E), imunoprecipi tacões foram realizadas a partir de lisado total de 1 mg utilizando o anticorpo indicado. As manchas foram sondadas para o primeiro parceiro de interacção a ser testado, em seguida, despojado e re-sondados para a proteína imunoprecipitada. 20? G de lisado total foram sondados para controlar de forma semelhante para a expressão e carregamento. A seta indica TAK1. Várias bandas FGFR3 representam vários intermediários de glicosilação e aparecem como publicado anteriormente [45], [85]. Quatro experimentos independentes foram realizadas para cada painel.

Análise Espectrometria de Massa

HEK293 células foram transfectadas com plasmídeos de expressão para TAK1 e constitutivamente activo (K650E) FGFR3. Após 24 horas, prepararam-se lisados ​​de células, como descrito [38], [39]. TAK1 complexos imunes foram precipitados com anticorpo anti-TAK1 a 4 ° C durante a noite, recolhido com proteína A-Sepharose durante um período adicional de 2 horas, e depois digerido com tripsina. Os péptidos foram analisados ​​pela Facilidade Proteomics do-Burnham Sanford Medical Research Institute usando afinidade de metal cromatografia //espectrometria de imobilizado nano-cromatografia líquida de ionização electrospray de massa (IMAC /nano-LC /ESI-MS) [38], [39].

FGFR3

In-vitro

Kinase Assay

Os ensaios FGFR3 quinase foram realizadas como descrito anteriormente [40]. Resumidamente, as reacções da cinase foram realizados em 50 ul de tampão de quinase (60 mMHepes-NaOH pH 7,5, MgCl 3 mM de

, MnCl2 3 mM de

2, 3 ^ M de Na

3VO

4, 1,2 mM DTT) suplementado com 2,5 ug de PEG, ATP 100 ^ M e TAK1 humana recombinante (500 ng; Abnova, Taipei, Taiwan) como um substrato. O ativo FGFR3 domínio intracelular recombinante (397-End; SignalChem, Richmond, CA) foi utilizado em 300 ng por reacção

Procedimentos Microarray e análise

As células foram transfectadas com 5 jig não-alvo. ou específicos de TAK1 siRNA e deixados a recuperar durante a noite. No dia seguinte, as células permaneceram sem tratamento ou receberam 100 nM PD173074 durante 48 horas, antes do isolamento do ARN. Cada tratamento foi preparada tal como amostras em triplicado. O ARN total foi processado tal como recomendado pela Affymetrix, Inc. Em resumo, o ARN foi isolado utilizando TRIzol (Life Technologies) e passada através de colunas de centrifugação RNeasy (Qiagen, Valencia, CA) para limpar ainda mais. O Mecanismo de DNA UCI Microarray Núcleo então quantificada RNA total por NanoDrop (Thermo Scientific) e testados para a pureza usando o Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies). O kit de expressão Ambion WT (Life Technologies) foi usado para preparar amostras de ARN para a análise do transcriptoma de microarray todo. Dois ug do rotulados, cDNA de cadeia simples fragmentada foi então hibridizado para sondar se põe sobre uma matriz Humano AffymetrixGeneChip 1.0ST. Arrays foram escaneados usando o Scanner GeneChip 3000 7 G e consola de comandos Software v. 3.2.3. Os resultados estão disponíveis através da Expressão Gênica Omnibus (GEO) repositório (número de acesso GSE52452)

Os dados foram importados para Partek Genomics Suite Versão 6.6 do software com as seguintes operações que está sendo feito para preparar os dados para análise estatística:. 1) RMA correcção de fundo, 2) Quantile Normalização, 3) Log base 2 transformação, e 4) Resumo da Sonda define usando valor médio. A análise estatística consistiu de ANOVA de uma via com uma única variável categórica, e as listas de genes foram gerados por esses genes com fold-change magnitude 2 e p-valor, com uma taxa de descoberta de falsas (FDR). 0,05

listas de genes foram então importados para Ingenuity Análise de Sistemas Pathway software (IPA), que tem funções de geração de redes de genes, classificação genes em várias categorias funcionais e outros, e para sobrepor genes em vias de sinalização conhecidos, coloração por mudança vezes ou algum outro valor.

RT-PCR quantitativo

O ARN total foi isolado a partir de células e MGHU3 KMS-11 utilizando TRIzol (Life Technologies) e passada através de colunas de centrifugação RNeasy (Qiagen) para limpar ainda mais. a síntese de ADNc aleatórias-preparado foi realizada em ARN total de 1 ug utilizando o kit Superscript III RT (Life Technologies). Todos os pares de iniciadores foram intrão-medindo e um controlo sem RT foi incluído. pares de primers foram os seguintes: reverter actina AGGTGTGGTGCCAGATTTTC e encaminhar GGCATGGGTCAGAAGGATT, GAPDH reverter GCCAGTGGACTCCACGAC e CAACTACATGGTTTACATG frente, DFNA5

reverter

CAGGTTCAGCTTGACCTTCC e

frente

ACCAATTTCCGAGTCCAGTG, GSTA1 CCGTGCATTGAAGTAGTGGA e ACGGTGACAGCGTTTAACAA frente reverso, PSCA reverter GTTCTTCTTGCCCACGTAGT e frente CAGGTGAGCAACGAGGAC, BAMBI reverter GAAGTCAGCTCCTGCACCTT e encaminhar TGCACGATGTTCTCTCTCCT, TNFAIP3 reverter CGCTGTTTTCCTGCCATTTC e encaminhar GATAGAAATCCCCGTCCAAGG, SGK1 reverter TGTCAGCAGTCTGGAAAGAGAAGT e encaminhar CGGAATGTTCTGTTGAAGAATGTG.

NFkB luciferase Assay

As células foram transfectadas com 5 jig não-segmentação ou TAK1 siRNAs espec�icos. Vinte e quatro horas mais tarde, as células foram transfectadas com NF-kB-Luc e de controlo de pRL-TK

Renilla

numa proporção de 03:01 e foram deixados a recuperar durante 24 horas. Onde indicado, as células foram simultaneamente transfectadas com os plasmídeos indicados FGFR3. As células foram então privadas de soro durante a noite, seguido por um tratamento de 8 horas com 40 ng /ml de FGF1. A actividade de luciferase foi detectada utilizando um ensaio de repórter de luciferase dupla (Promega Madison, WI). Diferenças na atividade NFkB seguintes TAK1 silenciamento sob cada condição de tratamento foram analisados ​​estatisticamente utilizando um teste t de duas caudas não pareado.

celular Fracionamento

células MGHU3 foram transfectadas com 5 jig não-segmentação ou TAK1 siRNAs espec�icos. Quarenta e oito horas mais tarde, as células foram privadas de soro durante a noite, depois tratou-se com 40 ng FGF1 /mL para 0, 5 ou 60 minutos. As células foram recolhidas depois fraccionado, utilizando um protocolo adaptado de [41].

A adesão celular Assay

As células foram transfectadas com 5 jig não-segmentação ou siRNA específico da TAK1 e permitiu recuperar durante a noite. No dia seguinte, as células permaneceram sem tratamento ou receberam 50 nM PD173074 durante 48 horas antes do plaqueamento do ensaio de adesão. As células tratadas com FGF1 estavam durante a noite e tratada com ligando 1 hora antes do plaqueamento e durante toda a duração do ensaio privadas de soro. ensaios de adesão foram realizados 72 horas pós-transfecção. Resumidamente, placas de noventa e seis poços foram revestidas durante a noite a 4 ° C com 1 ug /mL de colagénio IV, bloqueadas com BSA a 1% durante 1 hora a 37 ° C, e lavadas duas vezes com PBS e uma vez com meio isento de soro. As células foram recolhidas e semeadas a 5 x 10

4 nas placas pré-revestidas, na presença de tratamento indicado. As células foram deixadas aderir 3 horas a 37 ° C, os poços foram lavados 3 vezes com PBS para remover as células não aderentes, e aderência determinados após 4 horas de incubação com Calcein-AM (Life Technologies), medindo a intensidade de fluorescência a Ex /Em 490 /520 nm. A análise estatística das diferenças na adesão celular seguintes TAK1 silenciamento sob cada condição de tratamento foi realizada utilizando um teste t de duas caudas não pareado.

Resultados

Interage FGFR3 com TAK1

A identificação de interações proteína pode fornecer informações importantes sobre vias de sinalização específicas e identificar novos potenciais alvos terapêuticos. Em MM, o papel específico de FGFR3 ectopicamente expressa em um subconjunto de casos permanece controversa, enquanto que no cancro da bexiga, FGFR3 foi recentemente implicada como um importante fator de proliferação [42]. Pegamos uma abordagem sistemática para obter uma melhor compreensão do FGFR3 sinalização em cancros associados, através da identificação de novas interações proteína FGFR3 usando um ensaio de levedura dois híbridos (Y2H). O domínio citoplasmático de FGFR3 humano (aminoácidos 399-806), que contém a sequência de tipo selvagem ou a mutação K650E fortemente activação, foi utilizado como isco para pesquisar uma biblioteca de ADNc humana primária de condrócitos (Fig. 1A), como descrito [37]. Esta biblioteca foi escolhida como o FGFR3 é altamente expresso em condrócitos, e a mutação K650E fortemente activação, presente num subconjunto de ambos MM e UC [43], está presente no domínio de tirosina cinase intracelular. As interacções potenciais foram identificados pelo ensaio β-galactosidase elevador filtro, sequenciado, e re-testados para interacção em levedura. Entre as interacções identificadas foram as proteínas de transdução de sinal, incluindo a subunidade reguladora p85 de PI3-quinase [37], e TAK1. O plasmídeo de levedura presa consistiu dos aminoácidos do terminal C de 138 TAK1 (aminoácidos 441-579), indicando que esta região de TAK1 está envolvido na ligação de FGFR3. Nós também definido por Y2H usando construções do domínio de FGFR3 (Fig. 1A), que a região que abrange a segunda metade do domínio tirosina-quinase do FGFR3, contendo a ansa de activação do receptor e a cauda C-terminal de FGFR3 (aminoácidos 589-806) , é suficiente para a interacção FGFR3-TAK1. Para confirmar a interacção FGFR3-TAK1 em células de mamíferos e, mais especificamente, linhas celulares de cancro associada-FGFR3, construções de FGFR3, incluindo humanos de tipo selvagem, de cinase morta e sequências constitutivamente activa (K650E), foram expressos transitoriamente em células HeLa. TAK1 co-imunoprecipitada com todas as sequências testadas FGFR3; demonstrando que FGFR3 e TAK1 interagir em células de mamíferos e que a activação do receptor não é requerida (Figura 1B). FGFR3 endógeno em dois t (4; 14) de linhas celulares de MM, LP-1 (em peso) e KMS-11 (Y373C) [44], [45], também interagiu com TAK1 por co-imunoprecipitação (Figura 1C). Como observamos níveis de FGFR3 foram consideravelmente menores em MGHU3 do que as linhas MM, FGFR3

WT foi sobre-expresso para a detecção adequada de uma interação TAK1-FGFR3 em MGHU3 (Figura 1D). Note-se que as células MGHU3 UC realizar a mesma mutação FGFR3 como o KMS-11 células MM. Uma interacção FGFR3-TAK1 também foi avaliada em células de UC RT-112, que expressam uma truncado de tipo selvagem FGFR3 (aminoácidos 1-758) em fusão com a transformação de ácido espiral enrolada (3) TACC3 sequências (resíduos 433-838) [46 ]. Fomos incapazes de detectar de forma convincente a interacção nesta linha, apoiando ainda mais a importância de FGFR3 sequências C-terminais na interacção com TAK1 (dados não mostrados). Finalmente, também utilizada espectrometria de massa para caracterizar proteínas recuperadas em imunoprecipitados TAK1. Após expressão de ambos ativados FGFR3-K650E e TAK1 em células HEK293, imunoprecipitados TAK1 foram analisados ​​por espectrometria de afinidade do metal imobilizado A cromatografia /nano-cromatografia líquida /electropulverização de massa de ionização (IMAC /nano-LC /ESI-MS) [38], [39 ]. Em três amostras independentes, para além de uma cobertura significativa de Taki como esperado, os péptidos derivados de FGFR3, representando a cobertura de 48% no total foram identificados sem ambiguidade, como apresentado na Tabela 1. Em conjunto, estes resultados fornecem evidência de uma interacção entre o novo e o FGFR3 TAK1 que faz não requerem a activação do receptor. Há precedência para isso com o adaptador FRS2, que interage com receptores de FGF constitutivamente, mas apenas activa a sinalização a jusante (ERK /MAPK) mediante activação do receptor [47]. Demonstramos ainda que FGFR1, 2 e 4 expresso transitoriamente em células HEK293, também interagir com TAK1 (Figura 1E), sugerindo que a interacção é amplamente relevante para a sinalização do receptor de FGF.

FGFR3 pode fosforilar Tirosina TAK1

in vitro

activação TAK1 exige Ser /Tre na fosforilação múltiplos resíduos no circuito de activação (revisto em [48], [49]). Embora a fosforilação de tirosina de TAK1 não foi previamente relatada, FGFR3 funciona como uma cinase de tirosina; Portanto, avaliamos a possibilidade de que FGFR3 pode tirosina fosforilar TAK1. Com efeito, verificou-se que foi TAK1 tirosina fosforilada em células HEK293 que expressam transitoriamente activo constitutivamente FGFR3 (K650E), mas não o receptor de cinase morta (K508M), indicando que FGFR3 activado pode, quer directamente ou indirectamente tirosina fosforilar TAK1 (Figura 2A). TAK1 fosforilação da tirosina foi ainda observado num ensaio de cinase isento de células utilizando TAK1 recombinante e o domínio intracelular de cinase activa de FGFR3, indicando que TAK1 pode ser um alvo directo de FGFR3 actividade de tirosina-quinase (Figura 2B).

HEK293 células (a) transfectadas com FGFR3

K508M ou FGFR3

K650E. Vinte e quatro horas após a transfecção, as células foram lisadas e imunoprecipitadas TAK1 de 1 mg de lisado total. Os imunoprecipitados foram separados por SDS-PAGE, transferidas, e sondados com anticorpo 4G10. A seta indica TAK1. Representante de seis experimentos. (B) Um ensaio de cinase isento de células foi realizada utilizando TAK1 humana recombinante tem um substrato para FGFR3 humano recombinante (domínio de tirosina-quinase). A fosforilação da tirosina foi visualizado por imunotransf erência com o anticorpo 4G10. Representante de quatro experimentos.

Gene Expression análise identifica NFkB como um Hub de sinalização para FGFR3 e TAK1 Integração

TAK1 é um mediador chave da cascatas de sinalização que levam à ativação da NFkB e AP factores de transcrição -1, que cada modulam a expressão de genes envolvidos na oncogénese e apoptose (revisto em [16], [50]). Para começar a investigar a integração de TAK1 e FGFR3 sinalização em células cancerosas, foi realizada uma análise de microarray comparativa da expressão do gene na linha celular de cancro MGHU3 bexiga, que expressa o Y375C FGFR3 activação mutação e exibe fortes respostas ao PD173074 específico de receptor de FGF inibidor como avaliado por fosforilação de ERK [9]. Para identificar genes que são dependentes de ambos os sinais de FGFR3 e TAK1, MGHU3 células foram transfectadas com os não-específica ou segmentação-TAK1 siRNA, e cada subconjunto ainda tratados com PD173074, ou controlo de veículo. Uma maneira ANOVA com a mudança vezes magnitude 2 e p-valor, com FDR 0,05 foi utilizado para gerar listas de genes. TAK1 siRNA contra amostras não-targeting siRNA rendeu 39 alterações genéticas que refletem genes específicos TAK1 na presença de sinalização de FGFR3. TAK1 siARN mais PD173074 contra amostras não segmentação de siRNA mais PD173074 produziu 105 mudanças de genes que reflectem genes específicos TAK1 na ausência de sinalização de FGFR3. Para distinguir as alterações que dependem tanto FGFR3 e TAK1, genes que mostram alterações genéticas estatisticamente significativos que derivam de TAK1 knockdown apenas na presença de FGFR3 sinalização, mas não na sua ausência foram selecionados. Sobrepostas genes a partir do conjunto de 105 TAK1 alterações genéticas na ausência de sinalização FGFR3 foram removidos a partir das alterações do gene 39 TAK1, na presença de actividade de FGFR3. Os 13 genes únicos que permaneceu como significativamente alterados nestas condições representam genes que reflictam tanto TAK1 e FGFR3 sinalização (Tabela 2).

Nós escolhemos 6 genes da lista de 13 para validação com base em sua relevância no cancro, e descobriram que as alterações observadas foram reprodutíveis por qPCR, tanto em MGHU3 e a linha MM KMS-11 tratadas com TAK1 knockdown e /ou inibição do receptor de FGF, como descrito anteriormente para a análise de micro-arranjo (Tabela 2). A única excepção é GSTA1, que tem níveis muito baixos de expressão em células de MM. Finalmente, a entrada da lista dos 13 genes em Ingenuity Sistemas Pathway Analysis Tool (IPA) resultou em uma rede de um único gene (rede de marcar 40) com um grande centro em torno de NFkB (Figura 3). Estes resultados sugerem um cruzamento crítico entre FGFR3 e sinalização TAK1 que possa ter impacto activação NFkB e, assim, patogênese do câncer em cancros associados-FGFR3. Um segundo cubo centrada em torno de PI3K é consistente com os nossos resultados anteriores que mostram a interacção entre o FGFR3 e a subunidade reguladora p85 de PI3K [37].

O 13 FGFR3 único e genes dependentes TAK1 (Tabela 1) foram avaliadas por Engenho Análise via software (IPA), produzindo uma única rede (pontuação rede de 40) contendo os principais centros no NFkB e PI3K. formas moleculares do IPA incluem: Complexo /grupo (NFkB, PI3K), fator de citocina /crescimento (IKBKG, SGK1), enzima (ACSL1, GSTA1, MGAT4A, PDXP, TNFAIP3, UBC), canal iônico (SCNNIG), regulador de transcrição (TEAD1, VGLL1), transportador (SLC6A8, SLC15A1, SLC15A2, SLC38A3) e outros (ARRB1, BAMBI, DFNA5, FSH, GST Classe A, HDGFRP2, ins1, insulina, MT2A, PKC (s), PSCA, RPAIN, TRIM31, ZFAND5) . Relações IPA: linhas contínuas indicam interação direta; linhas tracejadas indicam a interação indireta; setas cheias indicam “age sobre”; as setas abertas indicam “transloca-se para”; – | indica “inibe” e – | ▸ indica “age sobre e inibe. Verde /vermelho indica genes down /up-regulamentada no microarray (Tabela 1).

Activado FGFR3 Positivamente Regula NFkB Atividade através TAK1

A ativação do NFkB contribui para MM patogênese, melhorando o crescimento, sobrevivência e metástases (revisto em [28]), e também promove a sobrevivência de células de cancro da bexiga [29], [30]. Com base no potencial importância da atividade NFkB e perfil de expressão gênica resultados que implicam sinalização de NFkB como um alvo para a interação FGFR3 e TAK1, avaliou a contribuição combinada de FGFR3 e TAK1 à actividade NFkB em células cancerosas utilizando um ensaio de repórter NFkB-luciferase. Como se mostra na avaliação inicial das linhas de MM (Figura 4A), a expressão de mutantes de FGFR3 constitutivamente activa aumentou dramaticamente a actividade de transcrição NFkB. Para determinar se TAK1 é necessário para a activação de NFkB através de FGFR3, siRNA knockdown de TAK1 foi avaliado em linhas MM e UC que expressam FGFR3 endógena. Em todas as linhas, quer expressando de tipo selvagem ou mutante de FGFR3, observamos significativamente reduzida activação NFkB seguinte knockdown de TAK1 (Figuras 4 B, C). A adição de ligando aumentada este efeito em células MGHU3, provavelmente por activação de outros receptores de FGF [42]. Como um teste final de activação NFkB, avaliou-se a localização nuclear da subunidade p65 de NFkB activo. MGHU3 células foram testados e mostraram um aumento na p65 nuclear por tratamento ligando FGF1, e os níveis de p65 nuclear foram diminuídos mediante TAK1 knockdown, que é consistente com os dados de luciferase de NFkB (Figura 4D). Notavelmente, TAK1 não é necessário para a principal via de sinalização MAPK FGFR3-responsivo, conforme evidenciado pela incapacidade dos TAK1 knockdown para alterar a fosforilação de ERK pela FGFR3 (Figura 4E).