Abstract

Fundo

PI3K /AKT via de sinalização é aberrante ativa e peças um papel crítico para a progressão do ciclo celular de células humana mesotelioma pleural maligno (MME).

AKT é uma das principais alvos celulares de perifosina, um romance alquilfosfolípido bio-disponível que tem exibido uma actividade anti-proliferativa in vitro significativo e in vivo em vários sistemas modelo de tumor humano e está actualmente a ser testado em ensaios clínicos.

Métodos

Nós testados atividade perifosine em células mesoteliais humanas e diferentes linhas de células mesotelioma, a fim de fornecer provas de sua eficácia como agente único e terapia combinada.

resultados

Nós demonstramos aqui que perifosine, actualmente a ser avaliado como um agente anti-câncer na fase 1 e 2 ensaios clínicos, causou uma dose redução dependente da ativação de AKT, em concentrações que causam a paragem do crescimento celular mmE. Neste estudo, em primeiro lugar, descrevem que as células MME expressar além de AKT1 também AKT3 e que, ou a, formas de as duas proteínas, revogados inibição miristoilada, constitutivamente activa mediada por perifosina crescimento celular. Além disso, descreve-se aqui um novo mecanismo de perifosina que interfere, a montante de AKT, afectando o EGFR e MET fosforilação. Finalmente, demonstramos um aumento significativo na toxicidade celular quando as células MME foram tratados com perifosine em combinação com a cisplatina.

Conclusões

Este estudo fornece um novo mecanismo de ação do perifosine, inibindo diretamente EGFR /MET-AKT1 /3 eixos, proporcionando uma base racional para uma nova abordagem translacional para o tratamento do MME

Citation:. Pinton G, Manente AG, Angeli G, Mutti L, Moro L (2012) perifosine como um potencial Novel Anti-Cancer agente inibe EGFR /MET-AKT Axis no mesotelioma maligno da pleura. PLoS ONE 7 (5): e36856. doi: 10.1371 /journal.pone.0036856

editor: Aamir Ahmad, Faculdade de Medicina da Wayne State University, Estados Unidos da América

Recebido: 21 de novembro de 2011; Aceito em 15 de abril de 2012; Publicado em: 10 de maio de 2012 |

Direitos de autor: © 2012 Pinton et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O trabalho era suportado por mesotelioma Fundação de Pesquisa Aplicada (MARF conceder 2009), Fondazione Buzzi Unicem e GIME (italiano mesotelioma interesse Group). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

mesotelioma maligno da pleura (MME) é um câncer rapidamente letal associado com a exposição ao amianto que está aumentando em incidência mundial [1], [2]. Desde MME é resistente a terapias convencionais, o prognóstico destes pacientes é fraco, com uma sobrevivência média de 11-12 meses após o diagnóstico [3], [4], por conseguinte, há uma necessidade urgente para uma terapia eficaz.

a activação de múltiplos receptores tirosina-quinase (RTKs) é essencial para a proliferação celular e /ou sobrevivência de células MME. Entre RTKs, MET e EGFR foram pensados ​​para ser dois dos mais significativamente envolvido na proliferação e /ou sobrevivência mmE via PI3-K /AKT sinalização de ativação em cascata. No entanto, um estudo clínico de fase II de erlotinib não mostrou um efeito sobre mmE, embora 96% dos espécimes mostrou positivo pEGFR [5].

A falta de mutação do EGFR em mmE pode ser uma das razões para a falta de responsividade [6]. MET é outro RTK que medeia a activação de várias vias de sinalização, incluindo fosfoinositida 3-quinase (PI3-K) /Akt e Ras /cascatas de cinase de proteína activada por mitogénio [7]. Estudos anteriores demonstraram que o TEM foi expressa e activada na maioria das linhas celulares e espécimes clínicos MME [8], [9]. No entanto, a inibição MET causou a paragem do crescimento em apenas um pequeno subconjunto de linhas celulares MME, independentemente da activação TEM frequente [10]. Em um artigo publicado recentemente Kawaguchi et al. sugerido que a inibição de múltiplos RTKs podem servir para desenvolver uma terapia alvo mais eficaz para os pacientes com o MME [11].

Tal como em outros tipos de cancro entre os sinais RTK activada, a fosfoinositida 3-quinase (PI3K) /Akt , desempenha um papel crítico para a progressão do ciclo celular em células humanas MME [12], [13]. Tem sido relatado que a inibio da actividade de PI3K levou a paragem do ciclo celular significativa e supressão da proliferação celular de diferentes linhas celulares MME [14]. resultados da activação de PI3K na acumulação de fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato e fosfatidilinositol 3,4-bifosfato [15]. Então plecstrina homologia (PH) de domínio que contêm proteínas, incluindo PDK1 e AKT [16], [17] se ligam aos fosfatidilinosit�s fosforilados 3′-OH através deste domínio. Esta ligação provoca a segmentação de AKT para a membrana plasmática e fornece uma conformação favorável para AKT Ser473 e Thr308 fosforilação [18].

A primeira geração de inibidores de PI3K LY294002 e wortmanina incluem, ambas visando o sítio catalítico de P110, que foram utilizados como ferramentas de investigação para elucidar o valor de PI3K como alvo terapêutico [19]. Para as propriedades farmacêuticas un-favoráveis, toxicidade e cross-over inibição de outras quinases de lipídeos e proteínas, eles não foram amplamente utilizados em ensaios clínicos [20].

perifosine [octadecil (1,1-dimetil -piperidinio-4-il) fosfato] é um romance alquilfosfolípido sintético (ALP), uma nova classe de agentes anti-tumor que tem como alvo as membranas celulares de células em proliferação activa e inibe o recrutamento domínio PH da membrana mediada por AKT e activação. Importante, perifosine não afeta diretamente tanto actividade de PI3K ou quinase dependente de fosfatidilinositol 1 (PDK1) [21]. Perifosine exibiu actividade anti-proliferativa significativa

in vitro

e

in vivo

em vários sistemas modelo de tumor humano e está actualmente a ser testado em ensaios clínicos diferentes [22], [23].

O presente estudo investiga um potencial atividade antitumoral do perifosine usando

in vitro

modelos celulares MME, usando perifosine quer por sua própria ou em combinação com medicamentos quimioterápicos estabelecidos. Nós demonstramos que perifosina inibindo simultaneamente reunidas, e a activação do EGFR mesmo na presença de HGF e EGF diminui a proliferação celular e a fosforilação de AKT blocos sem indução de apoptose de linhas celulares MME. Neste estudo, em primeiro lugar, descrevem que as células MME expressar além de AKT1 também AKT3 e que a inibição do crescimento celular induzida perifosina foram restauradas por transfecção de ambos os Akts-miristoiladas constitutivamente, localizadas na membrana plasmática. Além disso, co-tratamento com perifosine aumenta substancialmente efeito citotóxico da cisplatina nas células MME.

Resultados

perifosine alvo de fosforilação de AKT e afeta a proliferação celular mmE induzir prender um G2 /M fases

perifosine tem uma estrutura semelhante à que ocorre naturalmente fosfolípidos que tem sido descrita para interferir principalmente com membranas de células, como as células de tumor em proliferação, Aqui demonstramos que 50% de inibição do crescimento MME-induzida perifosine (IC 50) em 24 horas foi de 23 uM, 14 mM e 7,5 mM para a REN, MSTO211H e MMP, respectivamente, enquanto a toxicidade mínima foi exibido no HMC células mesoteliais normais (Figura 1A). Essas doses foram em linha com concentrações plasmáticas alcançadas

in vivo

(descrito para ser cerca de 16 mM). A Akt é um alvo para o efeito anti-proliferativo de perifosina, portanto, investigaram o efeito deste fármaco no estado de fosforilação de AKT. A Figura 1B mostra que a exposição de células a MME perifosine durante 1 hora causou uma perda dependente da dose de Ser473 fosforilação de AKT, sem afectar a quantidade total de proteína. Esta perda de AKT fosforilação foi observada em todas as linhas celulares testadas na sua concentração IC50 de perifosina. Nós eleito células REN, representante dos tumores epitelióides mais comuns, para caracterizar ainda mais eventos de sinalização primeiros afetados pela perifosine. Em células REN foi demonstrado que o tratamento com diferentes doses de perifosina durante 24 horas provocou uma paragem do ciclo celular com uma significativa acumulação progressiva na G2 /M fases (Figura 2A). Ambas as sub-G1 escolher e clivagem da poli (ADP-ribose) polimerase não eram evidentes após incubação com doses crescentes de perifosina durante 24 h, indicando que nenhuma morte celular por apoptose dependente da caspase ocorreu (Figura 2B). Além disso, os efeitos de perifosina aumentou com o tempo de tratamento que conduz todas as células expostas a 23? M de morrer por 72 horas (Figura 2C). Resultados semelhantes foram obtidos em células MSTO211-H (Figura S1).

A, efeito da perifosine sobre a viabilidade da HMC e três linhas diferentes de células MME (REN, MSTO211-H e MMP) após 24 horas de tratamento em as concentrações indicadas.

Pontos

, significa SD ± de três medições individuais. células B, ren, MSTO211-H e MMP foram tratados com as doses indicadas de perifosina durante 1 hora. As células foram lisadas, e quantidades iguais de proteína foram separadas por SDS-PAGE, transferidos para membrana de nitrocelulose, sondado com AKT específica-fosfo e re-sondada com anticorpos panAKT como descrito em “Materiais e Métodos”. Representativos de três experiências independentes.

a, células REN foram tratados com diferentes doses de perifosine por 24 horas. Após os tratamentos, as células foram coradas com iodeto de propidio tal como descrito em “Materiais e Métodos” e analisadas quanto ao teor de ADN celular por citometria de fluxo. Os dados apresentados na tabela representam a média ± SD (n = 3) da percentagem de células em cada fase do ciclo celular, * p≤0.005, ** p≤0.001. B, REN, as células foram tratadas com as doses indicadas de perifosina durante 24 horas. As células foram lisadas, e quantidades iguais de proteína foram separadas por SDS-PAGE, transferidos para membrana de nitrocelulose, sondado com um anticorpo anti-PARP1 específica e tubulina para o carregamento igual. Representativos de três experiências independentes. C, Efeito de perifosina sobre a viabilidade das células REN foi testada às 24, 48 e 72 horas de tratamento, nas concentrações indicadas.

Pontos

, significa SD ± de três medições individuais

A forma activa constitutiva da AKT sobre-vem inibição perifosine

AKT compreende três isoformas intimamente relacionadas:. AKT 1, 2 AKT e AKT 3, codificada por três genes diferentes [24]. Como o anticorpo fosfo-não discrimina entre as três isoformas, no presente estudo, AKT 1, AKT e AKT 2 3 foi investigada a expressão em células REN. Os dados apresentados na Figura 3A e 3B mostram que as células expressam REN AKT1 e AKT3, enquanto AKT2 ARNm não foi evidenciada (resultados semelhantes em células MSTO211-H estão apresentados na Figura S1).

A, AKT1, 2, 3 e actina como controlo de expressão de ARNm em células A549 e REN foi avaliada por RT-PCR como descrito em em “material e Métodos” secção. B, AKT1 e 3 a expressão da proteína foi avaliada por análise de transferência de Western em células REN com anticorpos específicos de isoforma, tubulina blot confirmou o carregamento igual. Representativos de três experiências independentes. C, as células foram transfectadas com REN 1 ug /placa de plasmídeo que codifica para a forma activada constitutiva de AKT, Myr-AKT1 ou 3. 24 horas após a transfecção as células REN foram tratadas com 23? M perifosina durante 1 hora, em seguida, foram lisadas e quantidades iguais de proteínas foram submetidas a SDS-PAGE seguido por imuno-mancha com anticorpos específicos para AKT fosforilado, o HA para confirmar a transfecção e a tubulina para o carregamento igual. D, o efeito de perifosina em células transfectadas com Myr- AKT1 ou 3, também foi avaliada na proliferação celular. REN células foram transfectadas com 1 ug /placa de plasmídeo que codifica Myr-AKT1 ou 3 e 24 horas pós transfecção foram tratadas com 23? M perifosina durante 24 horas. No final do tratamento de contagem de células viáveis ​​foi determinado.

Pontos

, significa SD ± de três medições individuais. Perifosine marcadamente altera translocação de membrana AKT, por isso, ao lado perguntou se a expressão forçada de um exógena Myr-AKT1 ou Myr-AKT3 poderia revogar o efeito de perifosine on fosfolarização ativando AKT e crescimento celular. Dados contraditórios estão disponíveis na literatura sobre a capacidade de um AKT constitutivamente ativa para superar ação perifosine. Enquanto na próstata células cancerosas inibição da fosforilação de Akt estava substancialmente aliviados pela introdução de um Myr-AKT1, que ultrapassou o requisito para o recrutamento membrana mediada por domínio PH, em células de mieloma foi descrito que perifosina superar AKT1 constitutiva altamente activa [25], [26]. Nós transientemente transfectadas células REN quer com um Myr-AKT1 marcada com HA ou Myr-AKT3 e tratou-se-lhes durante 24 horas com a dose CI50 dos perifosina. análise de Western-blot relatado na Figura 3C mostra que a transfecção de ambos Myr-AKT1 e Myr-AKT3 supera a inibição perifosine da fosforilação de AKT em células REN; apenas uma ligeira redução da fosforilação, provavelmente devido ao bloqueio das proteínas endógenas, foi observada. análise de crescimento celular apresentados na Figura 3D mostra que ambos os Myr-Akts transfectadas resgatado perifosina induzida bloco de proliferação celular.

perifosine afecta EGFR e MET sinalização

perifosine é semelhante a fosfolípidos, a principais componentes das membranas celulares e podem modificar a transdução do sinal relacionadas com a membrana. Consistentemente em células de cancro da próstata perifosina foi capaz de determinar uma redução da actividade de AKT, proliferação celular, e para induzir a apoptose após estimulação com 50 ng /mL de EGF, embora não há dados relacionados com a activação do EGFR foram mostrado até agora [27]. Por isso analisamos se perifosine poderia interferir com o ligante mediada ativação do EGFR e MET por imunoprecipitação e Western-blot experimentos. Como mostrado na Figura 4A e 4C em células REN fome, tratou-se 1 hora com perifosina (23 uM) e, em seguida estimuladas durante 10 minutos com 5 ng /mL de EGF ou de HGF ambos o EGFR e MET não foram fosforilados, mesmo na presença dos seus ligandos. Também EGFR e MET sinalização foram significativamente comprometida; Na verdade, também o factor de crescimento fosforilação induzida AKT foi fortemente inibida. Tal como descrito em outros modelos de células [26], as concentrações de análogos de perifosina realmente causou um ligeiro aumento da fosforilação basal ERK1 2 /, enquanto que contrariado induzida por factores de crescimento. O efeito de perifosina também foi avaliada na proliferação celular mediada por factor de crescimento. Como mostrado na Figura 4B e 4D, 23 uM perifosina administrado 24 horas à REN células na presença de EGF ou HGF revogada a proliferação celular induzida por factor de crescimento. De notar dados semelhantes foram observados na linha celular MSTO-211H (Figura S1). Além disso, perifosina foi mais eficaz do que a utilização simples ou combinada de inibidores específicos de EGFR e Met, quer em termos de viabilidade celular do que de activação AKT (dados não mostrados).

perifosine melhora a resposta de células MME para agentes quimioterapêuticos

Para determinar a natureza da interacção entre as perifosina e agentes quimioterapêuticos utilizados actualmente na terapia mmE, examinámos os dados a partir de curvas de resposta à dose por análise de isobolograma. Escolhemos para avaliar os efeitos anti-proliferativos utilizando o IC50 para efeitos de drogas individuais que foram determinados experimentalmente, usando os dados das experiências de dose-resposta como um ponto de partida. Perifosine (de 5 a 20 uM) e cisplatina (IC50: 100 uM) ou pemetrexed (IC50: 22 uM) ou gemcitabina (IC50: 2 nM) foram administradas simultaneamente durante 24 horas à REN células em colture. No final da incubação as células foram tripsinizadas e contadas. isobologramas representativos na Figura 5 indicam que a combinação de cisplatina e perifosina exibida forte citotoxicidade sinérgica em células REN através de uma ampla gama de doses. Além disso, mostrou perifosina aditividade em combinação com gemcitabina tempo parecia para antagonizar o efeito de pemetrexed. Sinergia com a cisplatina também é relatado na linha celular MSTO-211H (Figura S1), mesmo se foi observada diferente sensibilidade aos fármacos.

Discussão

PI3-K sinalização /AKT tem sido demonstrado ter um impacto biológico fundamental na regulação do ciclo celular mmE, anti-apoptose e quimio-resistência. A activação de AKT, como relatado por Altomare et al., Foi observada em 65% dos espécimes mmE mesmo se alterações genéticas parece ser pouco frequente para PI3-K activação /AKT em células MME [12].

Além disso, análise de arranjo de fosfo-RTK mostraram que em células MME a família EGFR, EGFR, ErbB2 ou ErbB3, era frequentemente co-ativado com MET, que sugeriu que o TEM e EGFR activação família pode compensar uns aos outros para a ativação de sinalização a jusante persistente [28]. Na verdade, como relatado em diversos estudos, mesmo se o EGFR e MET foram altamente expressos em mmE, inibidores individuais RTK aplicados em ensaios de fase II não foram suficientes para inibir a proliferação celular mmE, sugerindo que a inibição de múltiplos RTKs podem servir para desenvolver uma forma mais eficaz alvo terapia para pacientes com o MME no futuro [28].

Consideração de PI3K /PDK1 /AKT via de sinalização, como um ponto de convergência dos efeitos relacionados com o fator de crescimento na proliferação celular, como um potencial novo alvo para terapia mmE, conduziu às experiências aqui relatadas.

perifosine [octadecil (1,1-dimetil-piperidinio-4-il) fosfato] é um romance alquilfosfolípido sintética, uma nova classe de agentes anti-tumor que tem como alvo membranas celulares, inibe a activação AKT, e induz a apoptose em células de carcinoma diferentes.

a, B, as células em crescimento exponencial foram REN pré-tratado com 23 uM perifosina durante 1 hora e, em seguida, incubou-se 10 minutos com EGF (5 ng /ml) ou HGF (5 ng /ml). No final da experiência, foram preparados lisados ​​celulares ou imunoprecipitados e analisados ​​por imunotransf erência com anticorpos indicados. Os resultados são representativos de três experiências diferentes. B, D, o efeito de perifosina também foi avaliada na proliferação celular mediada por factor de crescimento. REN células foram tratadas com 23? M perifosina 24 horas na ausência ou na presença de 5 ng /mL de EGF ou de HGF. No final do tratamento de contagem de células viáveis ​​foi determinado.

Pontos

, significa SD ± de três medições individuais.

A, lotes B, C, isobolograma das interações entre perifosine e cisplatina ou gemcitabina ou compostos pemetrexed em células REN. As células (5 × 10

4) foram plaqueadas em meio completo e deixadas a aderir à superfície durante a noite. O meio de plaqueamento foi removido e substituído por meio contendo várias concentrações de perifosina e as doses de CI50 das outras drogas. Para determinar a natureza da interacção entre perifosina e cis-platina ou gemcitabina ou pemetrexed, temos células sobreviventes após 24 horas de incubação da droga. A linha diagonal representa a linha isoeffect da aditividade. Cada ponto é a média determinada a partir de experimentos realizados em triplicado.

Os experimentos apresentados neste trabalho demonstram que perifosine, causou inibição do crescimento celular mmE (IC

50 por 7,5 mM a 23 mM em 24 horas) e interrupção do ciclo celular na fase G2-M, associados com a rápida diminuição da ativação AKT, avaliada pela Ser473 fosforilação quantificação. Como preferencialmente agindo sobre a estrutura da membrana das células em proliferação activa, perifosine resultou apenas ligeiramente tóxico sobre as células mesoteliais normais

A família AKT tem três isoformas altamente homólogas:. AKT 1, AKT 2 e AKT 3, codificadas por três diferentes genes. Todas as três proteínas AKT contêm um domínio N-terminal de homologia plecstrina (PH), um domínio quinase catalítico e um domínio de regulação C-terminal.

Como a os anticorpos anti-AKT nós utilizados não discriminam fosfo-específico e entre as três isoformas, nós mais profundamente investigada a sua expressão em nossas células. Temos primeiro descrevem que as células MME expressar AKT1 e AKT3 e que perifosine interfere com ambos. Considerando o potencial tumorigênese de isoformas AKT, são necessários mais estudos sobre a função deles em mmE. A inibição da fosforilação de AKT e proliferação celular foram substancialmente aliviada pela introdução de um AKT1 constitutiva ativa com ácido mirístico ou 3, que contornou o requisito para o recrutamento de membrana mediada pelo domínio PH, apoiando a hipótese de que perifosine não afeta diretamente a atividade da PI3-K ou phosphoinositide- cinase 1 dependente de (PDK1). Tem sido relatado que perifosina aumenta a actividade antitumoral do cetuximab em células cancerosas PTEN-deficiente e que o tratamento combinado aumentou a inibição da fosforilação de AKT, p44 /42MAPK e p38MAPK, mas compensar a fosforilação da SAPK /JNK, que foi activada por perifosina tratamento sozinho [29]. Além disso, tem sido descrito que perifosina mostrou efeitos sinérgicos com erlotinib restaurando a eficácia contra inibidores de EGFR em CaP [28].

É importante, quando se analisou mais profundamente a resposta de células MME a EGF e HGF que observamos perifosine, provavelmente atuando na estrutura da membrana celular ou afetar interações do receptor ou recrutamento de co-ativadores, revogadas montante para moléculas de sinalização tanto EGFR e MET ligante induzida fosforilação.

Finalmente, testou os efeitos da terapia combinada com perifosine e cisplatina ou pemetrexed ou gemcitabina usando a análise isobolograma. Como evidenciado pela nossa resultados perifosine claramente sinergia com o tratamento com cisplatina e exerceu um efeito aditivo com gemcitabina.

AKT

Em resumo, destacamos, uma quinase multifuncional, cuja activação é associada com a resistência à morte celular e tumorigênese, como um importante alvo de perifosine. Nós demonstramos aqui que inibe tanto perifosina AKT1 do que a fosforilação e activação AKT3 em células em crescimento exponencial em meio contendo soro e depois da estimulação do factor de crescimento. Este último mecanismos proporcionam uma lógica romance considerar perifosina também como um inibidor de multi-alvo, ao passo que a interferência com a localização da membrana adequada de proteínas alvo para a sua fosforilação e activação (em vez da inibição directa da actividade de fosfotransferase dos quinases conhecidas para regular AKT) , parece ser mais um novo mecanismo de ação da droga divulgamos aqui. Embora a eficácia do tratamento combinado entre a cisplatina e perifosine deve ser validado por mais

in vivo

estudos, nossos resultados sublinham perifosine como uma terapia multi-alvo para mmE. Mais interessante, perifosine já foi mostrado para dar resposta parcial e doença estável em pacientes em terapia de segunda linha (dados não publicados gentilmente cedido pelo Keryx Biofarmacêutica).

Materiais e Métodos

culturas de células tratamentos e transfecção

o MME epithelioid linha celular derivada REN que foi utilizada como modelo experimental principais nesta investigação foi gentilmente cedido pelo Dr. SM Albelda (University of Pennsylvania, Filadélfia, PA), MMP foram estabilizadas a partir de derrames pleurais de doentes malignas mesotelioma [30] e culturas HMC-terc primários obtidos a partir de pacientes com insuficiência cardíaca congestiva e imortalizadas por expressão de uma subunidade de telomerase humana [31]. A linha celular derivada MSTO-211H bifásica foi obtido a partir do Istituto Scientifico Tumori (IST) Cell-banco, Génova, Itália. As células foram cultivadas em condições padrão.

Células cultivadas em 80% de confluência em placas de cultura de tecidos foram transientemente transfectadas com pcDNA3 Myr-HA-AKT1 ou plasmídeo que codifica pBABE puroL Myr-HA-AKT3 para myristilated forma constitutivamente activa de Akts de Addgene por o reagente LipofectAMINE como descrito pelo fabricante.

Reagentes e anticorpos

os anticorpos monoclonais específicos para a tirosina fosfo, fosfo-ERK1 (pThr202 e pTyr204) e ERK2 (pThr185 e pTyr187) MAP quinases, e fosfo-Akt AKT1 e AKT3 (pSer473), eram de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Os anticorpos específicos para α-tubulina, PARP1, ERK1 /2, panAKT, Met, EGFR e HA eram de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). de ratinho anti IgG de coelho e anti anticorpos conjugados com peroxidase, factores de crescimento e reagentes químicos eram da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). ECL foi da Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, Suécia). membranas de nitrocelulose e kits de ensaio de proteína foram de Bio-Rad (Hercules, CA). Os meios de cultura, soro, antibióticos e LipofectAMINE foram de Invitrogen (Carlsbad, CA). Perifosine é comercializado e gentilmente fornecida por Keryx biofarmacêutica (Nova Iorque, Nova Iorque).

A lise celular, de imunoprecipitado

As proteínas foram extraídas e imunoprecipitadas e separadas por SDS-PAGE como descrito anteriormente [32] . Após SDS-PAGE, as proteínas foram transferidas para nitrocelulose, reagiram com os anticorpos específicos indicados e, em seguida, detectados com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano e o reagente de ECL chemioluminescent. A análise densitométrica foi efectuada utilizando o GS 250 Molecular Imager (Bio-Rad).

A proliferação celular, tal como determinado por contagem directa

MME células foram semeadas e tratadas em meio completo como acima indicado, foram então tripsinizadas e corados com azul de Tripano. O número de células viáveis ​​foi contado numa câmara de Burker.

análise do ciclo celular

ciclo celular /apoptose análises foram realizadas utilizando coloração com iodeto de propidio, com análise de FACS subsequentes. 5 × 10

5 células /poço foram cultivadas em placas de cultura de tecidos com ou sem tratamento durante 24 horas. Após a incubação, as células aderentes foram desprendidas com tripsina (0,5% de tripsina /EDTA a 0,1% em PBS). células isoladas e suspensas foram colhidas em meio DMEM completo e centrifugado a 500 g durante 10 minutos. As peletes foram lavadas com PBS e fixadas com etanol gelado durante a noite a 75% a 4 ° C, tratou-se com 100 ug /ml de ARNase A, e subsequentemente corados com /mL de iodeto de propídio 25 ug. Em seguida, eles foram analisados ​​usando um citómetro de fluxo FACS (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) e software Modfit (Verity Software House, Inc., Topsham, Maine).

isolamento do RNA e RT-PCR

o RNA total foi extraído da REN, MSTO-211H e celulares A549 linhas posteriores à Trizol Reagente protocolo (Life Technologies, Inc.). A qualidade e quantidade de ARN foi determinada medindo a absorvência do ARN total a 260 e 280 nm. Para obter cDNA foi usado kit de síntese de ADNc a partir de RevertAid Fermentas. Os primers para a expressão da isoforma de Akt foram descritos por Okano et ai. [33] e foram sintetizados por MWG. Os iniciadores foram: 5′-GCTGGACGATAGCTTGGA-3 ‘(sentido Akt1); 5’-GATGACAGATAGCTGGTG-3 ‘(anti-sentido Akt1); 5’-GGCCCCTGATCAGACTCTA-3 ‘(sentido Akt2); 5’-TCCTCAGTCGTGGAGGAGT-3 ‘(anti-sentido Akt2); 5’-GCAAGTGGACGAGAATAAGTCTC-3 ‘(sentido Akt3); e 5’-ACAATGGTGGGCTCATGACTTCC-3 ‘(anti-sentido de Akt3). iniciadores de p-actina foram 5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3 ‘(sentido) e 5′-CTCCTTAAGTCACGCACGATTTC-3’ (anti-sentido). reacções de RT-PCR foi realizada utilizando 2xPCR Master Mix de Fermentas de acordo com procedimentos padrão. Os produtos de PCR foram sujeitos a electroforese num gel de agarose a 1% e visualizado com brometo de etídio. Os primers Akt foram projetados para gerar 383- (Akt1), 276- (Akt2) e 329- (Akt3) produtos pb, respectivamente.

A análise estatística e isobolograma

Os dados são expressos como a média ± SEM. As diferenças entre os valores obtidos em uma população de células tratadas com diferentes condições experimentais foram determinados usando o desemparelhado

t

-test. A

P -valor de 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. A base teórica da isobolograma método foi descrito em estudos anteriores [34], [35].

com base nas curvas de resposta à dose de cisplatina, e gemcitabina pemetrexed, três isobologramas foram construídos através da representação gráfica dos valores de IC50 dos únicos medicamentos no

y

e de perifosine no

x

eixos respectivamente, e foi calculado a combinação teórica dose de aditivo.

Informações de Apoio

Figura S1 .

Análise dos efeitos perifosine em células MSTO-211H. A, efeito de perifosina sobre a viabilidade das células MSTO-211H em 24, 48 e 72 horas de tratamento, nas concentrações indicadas.

Pontos

, significa SD ± de três medições individuais. B, as células em crescimento exponencial MSTO-211H foram pré-tratadas com 20? M perifosina durante 1 hora e, em seguida, incubou-se 10 minutos com EGF (5 ng /ml) ou HGF (5 ng /ml). No fim do experimento, os lisados ​​celulares foram preparados e analisados ​​por imunotransf erência com anticorpos indicados. Os resultados são representativos de três experiências diferentes. C, AKT1, 2 e 3 e actina, como controlo, a expressão de ARNm em células MSTO-211H foi avaliada por RT-PCR como descrito na secção de “Material e Métodos”. D, isobolograma trama das interações entre perifosine e cisplatina nas células MSTO-211H

doi:. 10.1371 /journal.pone.0036856.s001

(TIF)

Reconhecimentos

Agradecemos dott. Peter Sportelli de Keryx Biofarmacêutica por fornecer dados clínicos sobre doentes tratados perifosine.