células
Abstract
Fundo
assassino natural (NK) desempenham um papel importante na imunoterapia anti-tumor. Mas indicou que as células tumorais impactado, possivelmente, sobre as funções normais de células NK através de alguns mecanismos de moléculas no microambiente do tumor.
Materiais e métodos
Nosso estudo analisou a mudança sobre as células NK superfície marcadores (receptores de células NK ) através de imunofluorescência, citometria de fluxo e PCR em tempo real, a função matou a partir de células NK rato baço e /linha de alta humano baixo câncer de pulmão de células por co-cultura. Além disso, nós certificado o resultado acima no modelo de cancro do pulmão de rato SCID.
Resultados
Nós mostramos que a infiltração de células NK na periferia do tumor foi relacionado com o prognóstico dos pacientes com câncer de pulmão. E o número de células NK infiltrando no tecido do cancro do pulmão está intimamente relacionado com os tipos patológicos, tamanho do tumor primário, história de tabagismo e prognóstico dos pacientes com câncer de pulmão. A expressão das células NK inibidor receptores aumentou notavelmente no tumor microambiente, em contrário, a expressão de receptores de células NK activadas diminuir magnificamente.
Conclusões
O tempo de sobrevivência do paciente com câncer de pulmão foi positivamente relacionadas com o grau de infiltração de células NK no câncer de pulmão. Assim, a regulação negativa de NKG2D, Ly49I e a sobre-regulação de NKG2A pode indicar mecanismo de tolerância imunológica e facilitar a metástase no ambiente tumoral. Nossa pesquisa vai oferecer mais teoria para a estratégia clínica sobre imunoterapia tumor
Citation:. Jin S, Deng Y, Hao J-W, Li Y, Liu B, Yu Y, et al. (2014) NK celular fenotípica Modulação em Lung Cancer Ambiente. PLoS ONE 9 (10): e109976. doi: 10.1371 /journal.pone.0109976
editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, China
Recebido: 17 de maio de 2014; Aceito: 13 de setembro de 2014; Publicação: 09 de outubro de 2014
Direitos de autor: © 2014 Jin et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação
Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo Fundo de Investigação jovens das subvenções do Nacional Eleventh-Five-Year-chave Tarefa Projetos de China (No. 2006BAI02A01) , o Programa Nacional 973 (No. 2010CB529405), Tianjin Programa Sistema de Inovação Científica (No. 07SYSYSF05000, 07SYSYJC27900), a Cooperativa Fundação China-Suécia (No. 09ZCZDSF04100), o subsídio da Fundação Nacional Natural Científico da China (Sem 81.201.828), Jovem Fundação Popular da Província de Heilongjiang da China (Sem QC2012C013), Departamento de Saúde da Província de Heilongjiang da China (n 2011-124) e Hospital do Câncer Harbin Medical University grande projecto Foundation (Não: JJZ-2010-01). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer de pulmão é um dos tumores malignos mais comuns no mundo, que tem elevada morbidade e mortalidade e representa cerca de 25,4% de todos os tumores. Tem sido uma tendência ascendente da taxa de incidência nos últimos anos [1] – [4]. Os dados da American Cancer Society divulgados mostram que 222,520 casos de câncer respiratório e 157,300 casos de morte em 2010, o que é em primeiro lugar de morbidade e mortalidade de todos os tumores malignos [5]. A estatísticas clínicos de fase IV do NSCLC na China mostraram que a taxa de sobrevivência 1-, 2-, 3-, 4- e 5-ano era de 44%, 22%, 13%, 9% e 6%, respectivamente, [6]. Actualmente, a ressecção cirúrgica é ainda o método principal para prolongar o tempo de sobrevivência de cancro do pulmão, mas a invasão e metástases de cancro do pulmão é o maior obstáculo para melhorar a eficácia do prognóstico de cancro do pulmão. Para o estudo em profundidade do comportamento maligno câncer de pulmão e se concentrar no tratamento integral de câncer de pulmão metastático, é necessário estabelecer modelo animal apropriado para estudar a recorrência de câncer de pulmão e metástase e sua terapia abrangente.
natural killer (NK ) célula, também conhecidas como linfócitos granulares grandes, é uma célula imunitária independente e não-específica. Não tem qualquer restrição do MHC para alvejar células de reconhecimento e destruição, e pode matar directamente células tumorais e células alvo infectadas com vírus, sem antigénio pré-sensibilizados [7], [8]. Também pode produzir um grande número de citocinas imunitárias-activo para aumentar ou expandir o seu efeito anti-tumoral, que pode ser considerada como a primeira linha do sistema de defesa do hospedeiro [9]. Várias evidências experimentais demonstraram o papel importante das células NK na eliminação de células tumorais. Vivier et ai relataram que a citotoxicidade das células NK partir de sangue periférico foi correlacionada com um risco aumentado do cancro [10]. Além disso, as células NK que se infiltram no tecido do tumor estava associada com bom prognóstico em colorrectal [11], gástrica [12], e pulmão [13] cancros.
Com o desenvolvimento da formação do tumor, as células de tumor maligno e infiltrando células do sistema imunológico e interagir composto do micro-ambiente do tumor. A maioria dos estudos publicados mostrou que um grande número de células do sistema imunológico que se infiltram em tecido tumoral desempenhou um papel importante na melhoria prognóstico de tumores [14], [15]. Mas, como todos sabemos, o prognóstico de doenças malignas associadas ao pulmão é muito terrível, embora há muitas células imunes no pulmão. Queremos saber se existe uma composição diferencial da célula imunológica se infiltrar em áreas de tecido pulmonar malignas e não malignas, e até mesmo pode potencialmente contribuir para este efeito. Esendagli L et.al descobriu que no cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) pacientes, células NK foram quase não encontrados nas regiões dos tecidos malignos, homólogos não-malignas foram selectivamente preenchida por células NK e as células NK apresentaram forte actividade citotóxica ex in vivo [16].
Assim, o impacto da expressão do receptor de célula NK e função pode ser diferente causado pela interacção entre as células NK e do tumor no micro-ambiente do tumor. Ao explorar células NK no corpo e /ou o cancro do pulmão de micro-ambiente, discute a sua distribuição, a expressão do receptor, o estado funcional com invasão do cancro do pulmão, metástases e prognóstico, esclarecer o mecanismo de células NK envolvidos no cancro do pulmão de micro-ambiente do celular e os níveis moleculares.
Materiais e Métodos
amostras de tumores e Ética Declaração
Este estudo foi realizado de acordo com os princípios expressos na Declaração de Helsinki. Todas as amostras de tumor utilizadas neste estudo foram obtidos a partir de Tianjin Instituto do Câncer do Pulmão e do departamento de patologia em Tianjin Medical University Hospital Geral. Todos os pacientes fornecidos consentimento informado por escrito para a recolha de amostras e análise posterior. E o estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Institucional do Hospital Tianjin University Medical Geral.
parafinas Specimen e origem do tecido congelado de câncer de pulmão
Os pacientes serão elegíveis para a participação na fase de indução da estudar se: diagnóstico histológico ou citológico das NSCLC (incluindo o carcinoma espinocelular, adenocarcinoma e carcinoma de grandes células); sem prévia sistêmica quimioterapia, radioterapia e bioterapia para câncer de pulmão antes da cirurgia; nenhuma outra história de câncer; e ≤80 anos de idade.
amostras parafinas Amostras foram coletadas de 84 pacientes com diagnóstico de câncer de pulmão entre January1st 2008 e 31 de janeiro de 2011 (64 homens e 20 mulheres). A idade média dos pacientes foi de 60,7 ± 7,9 anos (variação de 40 a 78 anos). Existem diferentes tipos de patologia: 37 pacientes com carcinoma espinocelular, 37 pacientes de adenocarcinoma e 10 pacientes com carcinoma de células grandes. No momento do diagnóstico, os pacientes foram avaliados de acordo com a AJCC /UICC a sexta edição classificação como segue: Estágio IIA-1 doentes, palco IIB- 4 pacientes, Estágio IIIa-58 pacientes, Stage IIIB-12 pacientes, fase IV-9 pacientes. As amostras foram aplicadas a partir de Tianjin University Medical Departamento de Patologia.
amostras de tecidos congelados foram gerados a partir de 66 amostras cirúrgicas com câncer de pulmão entre 2008 e January1st January1st 2011. Há incluindo 52 homens e 14 mulheres. A idade média dos pacientes foi de 60,5 ± 8,4 anos (variação de 40 a 78 anos). Havia incluindo diferentes tipos de patologia: 28 pacientes com carcinoma espinocelular, 28 pacientes de adenocarcinoma e 10 pacientes com carcinoma de células grandes. Os pacientes foram avaliados de acordo com a AJCC /UICC a sexta edição classificação como segue: Estágio IIA-1 doentes, estádio IIB-4 pacientes, fase III-45 pacientes, estágio IIIB-9 pacientes, fase IV-7 pacientes. As amostras foram aplicadas a partir de Tianjin Instituto de Pesquisa do câncer pulmonar.
Imunofluorescência
análise
imunofenótipos de CD56 e CD16 foram feitas as seguintes. Em resumo, as, secções embebidas em parafina e fixado em formalina (4 uM) foram aquecidos por loiça durante 45 min, em seguida, desparafinados em xileno e re-hidratadas numa série graduada de soluções de etanol. Os cortes foram subsequentemente colocados em solução cítrico-citrato de sódio (pH 7) e de microondas a alta fogo durante 5 min, de lume brando durante 15 minutos, e arrefecimento natural até à temperatura ambiente para recuperar a antigenicidade. A peroxidase endógena foi extinta com 3% H
2O
2 durante 30 min. Após lavagem com PBS, as secções foram incubadas com BSA a 2% durante 2 horas em temperatura ambiente e, em seguida, incubadas com anticorpo de CD56 e CD16 (Santa Cruz, diluída em 1:100) durante a noite a 4 ° C. As secções foram incubadas com anti-ratinho de cabra e anticorpo de cabra anti-ratinho de fluorescência (Santa Cruz, diluída em 1:200) durante 35 min e o DAPI durante 5 min. Após lavagem com PBS quarta vezes, as secções foram montagem por glicerol (pH 9,0). A fluorescência vermelha expressa CD56 +, a fluorescência verde expressa CD16
+, a fluorescência azul expressa núcleo da célula
. Podemos encontrar o CD56
+ e /ou CD16
+ expressar na célula NK. O software de análise de imagem SPOT foi usado no processo de análise. A percentagem de células CD56 e /ou CD16 positivas foi determinada por contagem por secção. A contagem de células NK de campo per view foi pontuada de acordo com os seguintes critérios: +, as contagens de células NK de per view campo 10; ++, As contagens de células NK de per view campo 10, 20; +++, As contagens de células NK de per view campo 20. Todos os campos de acordo com o ponto em três experiências independentes foram calculados.
extracção de ARN, síntese de ADNc, e o isolamento do DNA
O ARN total foi extraído com o reagente de Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com o protocolo do fabricante. O ARN total foi digerido com R-Nase livre Nase D-I (Promega, Madison, EUA) e utilizado para a síntese de ADNc com o sistema de transcriptase reversa (Takara Biotech, Dalian, China).
quantitativo em tempo real PCR
A síntese de cDNA foi realizada como descrito acima. O iniciador específico de ensaio de RT foram os seguintes: NK1.1: 5′-TCTCTTGAATAAACACACAGCAT -3 ‘, NKG2A: 5′-CTGAGAAGGATTTTG -3′, NKG2D: 5’-TTCTCACAGTTCCTCT -3 ‘, LY49I: 5’- -3 TTCTATTCTTGCTTTAG ‘. Os pares de iniciadores e GAPDH pares de iniciadores foram utilizados para Q-PCR com o Kit de SYBR Premix Ex Taq RT-PCR (Takara, Dalian, China) em um Prism 7900 sistema de tempo real ABI (Bio-Rad) com as seguintes condições: 95 ° C durante 30 s, 40 ciclos de amplificação (95 ° C durante 5 s e 60 ° C durante 30 segundos) e um ciclo de fusão de 60 ° C a 95 ° C. Os dados foram analisados utilizando o software ABI PRISM 7900 Manager. Todas as reacções foram realizadas com três repetições técnicas.
celular
Os altos e baixos metástase grande pulmão de células linhas celulares de cancro L9981-Luc e NL9980-Luc de Tianjin Lung Cancer Institute [17], [ ,,,0],18] foram mantidas em meio RPMI 1640 (Hyclone, América) contendo soro de bovino fetal a 10% (FBS), 100 U /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina (Hyclone, América) numa incubadora completamente humidificada (Nuaire, US fluxo automático) a 37 ° C com 5% de CO
2. As células foram mantidas em fase de crescimento exponencial durante as experiências.
modelo SCID
SCID (imunodeficiência combinada grave) ratos comprados de Academia Chinesa de instituições animais ciências médicas foram alojados em animais livre de patógenos instalações. camundongos fêmeas utilizadas foram de 5-7 semanas de idade no início do experimento. ratinhos SCID fêmea (16 animais para cada grupo experimental) foram inoculados subcutaneamente no direito inguen com 2 * 10
6 células em suspensão em 150 ul de PBS. Nove animais do grupo controle não tinha inoculação. Os tamanhos dos tumores foram medidos a cada 7 dias e sua intensidade de fluorescência foram medidos com a verdadeira essência da América do sistema de imagem viva (Xenogen IVIS200). Após 6 semanas de observação, dissecção foi realizada e explantado tumores, pulmões e baço foram removidos para a análise posterior. Estas experiências foram repetidas pelo menos duas vezes para confirmar os resultados. Os protocolos experimentais com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética de Experimentação Animal e os experimentos foram conduzidos de acordo com as Diretrizes para a experimentação animal em Tianjin Medical University Cancer Research Center.
Linfócitos recolher e Citometria de Fluxo detectar
Os pulmões e baços foram polidos em pedaços. Em seguida, os linfócitos recolher foram extraídas com o Meio de separação de linfócitos (Shenzhen, China) de acordo com o protocolo do fabricante. As percentagens de células NK foram avaliados e separados por citometria de fluxo utilizando anticorpos monoclonais (MoAbs) anti-CD3
– FITC /NK1.1
+ PE (BD Phamingen, San Di ego, CA). Durante a análise, o CD3
– foi determinada /NK1.1
+ População. Para determinar a expressão de superfície dos ligandos de célula NK células NK, as células foram então coradas com o anticorpo de cabra anti-ratinho-FITC NK1.1, CD3- Alexa Fluor 647, NKG2A-FITC, PE-NKG2D, Ly49I-PE (BD Phamingen, San Di ego, CA) durante 30 min a 37 ° C no escuro. A análise foi realizada no FACS Ordenar (Becton Dickinson, Mountain View, CA) usando o software celular Quest (Becton Dickinson) e a expressão da superfície celular foi quantificada pelo valor das intensidades de fluorescência médios obtidos com os mAbs específicos.
co-cultura
purificada NK1.1
+ /CD3
– células NK (activado com 100U /ml de IL-2 durante 2 h) a partir de baço de ratinho foram co-cultivadas com cancro do pulmão a linha celular L9981-Luc /NL9980-Luc como (a) 0.25:1, (B) 0.5:1, (C) 01:01 e (D) 02:01 para 24, 48, 72 horas. Após co-cultura, a intensidade de fluorescência das células NK foi medida com a verdadeira essência do sistema de imagem viva da América.
Quantitative PCR em tempo real
RNA foi isolado a partir de tumores explantados via Trizol e reversa transcrito usando escorva especial (Invitrogen). RT-PCR quantitativa foi realizada num instrumento ABI PRISM 7900, utilizando ensaios de SYBR Green. Os iniciadores específicos estão indicados no seguinte (Tabela 1). A amplificação foi realizada como se segue. Após o passo de desnaturação inicial a 95 ° C durante 30 segundos, moldes foram desnaturadas a 95 ° C durante 5 segundos, os iniciadores foram recozidos e extensão de ADN foi realizada a 60 ° C durante 30 segundos (cada ciclo foi repetido 40 vezes). A expressão de genes alvo foi compensado usando a expressão de GAPDH e apresentado pelo rácio de expressão entre as células de controlo não tratadas e células tratadas.
A análise estatística
As experiências foram realizadas três vezes. Os dados são apresentados como valores médios ± SD. A avaliação estatística foi realizada utilizando ANOVA one-way ou teste da soma ranking quando os dados de medição é distribuição de Gauss com o sistema SPSS Software, versão 17.0. Se os dados forem dados de enumeração, foi utilizado o teste do qui-quadrado.
foram considerados estatisticamente significativos valores de P
de menos de 0,05. taxa de sobrevida global foi comparada por curva de sobrevivência de Kaplan-Meier, teste log-rank-sum classificação utilizado entre os grupos.
Resultados
localização de células NK e morfologia característica no cancro do pulmão micro-ambiente
as células NK infiltradas no tecido de cancro do pulmão foram concentradas principalmente no estroma do tumor, que constituem o micro-ambiente do tumor (Figura 1). Em tecidos NSCLC, CD56
+ NK células com 1, 2 e 3 grau de infiltração foram 44,0%, 22,6%, 33,3%, CD16
+ NK células foram 45,2%, 22,6%, 32,1% e CD56
+ CD16
+ NK células foram 45,2%, 23,8%, 31,0%, respectivamente. Não foi observada diferença significativa (
p Art 0,05). entre as células NK com CD56 única positivo, CD16 positivo e único CD56CD16 double positivo no tecido do cancro do pulmão (Tabela 1)
O infiltrado as células NK no tecido de câncer de pulmão foram concentrados principalmente no estroma tumor. As células NK mostra com CD56 positivo único (fluorescência verde), CD16 positivo único (fluorescência vermelha) e CD56CD16 double positivo (fluorescência amarela) no tecido estroma câncer de pulmão.
pacientes com câncer
infiltração de células NK e pulmão patologia clínica característica fisiológica
O grau 1, 2 e 3 com CD56
+ CD16
+ infiltração de células NK foram 24,3%, 32,4%, 43,2%, em carcinomas de células escamosas, e 62,2%, 16,2 %, 21,6% no adenocarcinoma e 50,0%, 10,0%, 40,0% no cancro do pulmão de células grandes, respectivamente. Houve diferença significativa de CD56
+ CD16
+ NK grau de infiltração de células entre diferentes tipos patológicos de câncer de pulmão (
p
= 0,019) (Figura 2, Tabela 2). A expressão de células NK em carcinoma de células escamosas foi significativamente maior do que no adenocarcinoma e carcinoma de grandes células. O grau 1, 2 e 3, com infiltração de células NK foi de 48,1%, 3,7%, 48,1% em pacientes com câncer de pulmão sem história de tabagismo, foram 42,1%, 31,7% e 26,3% em pacientes com história de tabagismo. história de tabagismo de paciente com câncer de pulmão está relacionado ao grau de infiltração de células NK (
p
= 0,011). O grau 1, 2 e 3 com a infiltração de células NK foram 60,6%, 18,4%, 21,1% no cancro T1-T2, e 42,1%, 31,7%, 43,5% no cancro T3-T4, respectivamente. Foi encontrada uma diferença significativa do grau de infiltração de células NK entre o tamanho diferente do tumor (
p
= 0,019) (Tabela 3).
A. Carcinoma do Pulmão escamoso; B. Adenocarcinoma pulmonar; câncer de pulmão de células Grande C.. A expressão das células NK em carcinoma de células escamosas foi significativamente maior do que no adenocarcinoma eo carcinoma de grandes células.
Pacientes com câncer
infiltração de células NK e pulmão prognóstico
A tempo de sobrevivência de paciente com câncer de pulmão foi positivamente relacionada com o grau de infiltração de células NK no câncer de pulmão. Quanto mais infiltração de células NK foram existia, quanto maior o tempo de sobrevida dos pacientes fez (
p
= 0,030) (Figura 3, Tabela 4).
O tempo de sobrevivência do paciente com câncer de pulmão foi positivamente relacionada com o grau de infiltração de células NK no câncer de pulmão. Quanto mais a infiltração de células NK foram existia, quanto mais longo o tempo de sobrevivência de pacientes fez. Os pacientes no grupo de nível 3 têm o tempo de sobrevivência mais longa. Entre três grupos significância estatística estão de saída. (
p
= 0,030)
PCR em tempo real confirmar NK medida infiltração de células do cancro do pulmão
As diferenças de receptores de células NK CD56 e CD16 a expressão de ARNm entre diferentes tipos patológicos de cancro pulmonar foi detectada e verificada por PCR em tempo real. Descobrimos que as células NK fenótipo mRNA em diferentes tipos histológicos de câncer de pulmão têm significância estatística (Figura 4). Isto está de acordo com o resultado da histologia.
células NK receptores CD56 e CD16 fenótipo mRNA em diferentes tipos histológicos de câncer de pulmão têm significância estatística.
metástase Transplantados tumores de pulmão modelos estabelecidos
modelos de metástase tumores de pulmão transplantado foram estabelecidas com sucesso em camundongos SCID com linhas celulares de cancro metastático humanos grandes pulmão de células elevada (L9981) /baixo (NL9980). A metástase do tumor de xenoenxerto foi detectado por imagiologia de fluorescência in vitro (Fig.5a). Comparado com o grupo de baixo metastático (6,84 × 10
6 ± 3,26 x 10
6), o pulmão metástases valor de fluorescência de ratos no grupo de alto-metastático (30,97 × 10
6 ± 14,3 × 10
6) foi notavelmente maior do que no grupo de baixo metastático (
p
= 0,035) (Fig.5B, C, D)
a:. Viver imagens de fluorescência detectar modelo de rato ( à esquerda está o direito inguen tumor por via subcutânea durante 1 semana e no meio é para 6 semanas após a injecção, o certo é que os tumores metástases pulmonares em seis semanas após a inoculação), B:. curva de crescimento de tumor de transplante por via subcutânea em SCID rato, C: metástases pulmonares imagem luminescência do rato portador de tumor in vitro, D:. A comparação entre o valor de luminescência entre tumores e metástases pulmonares transplantados de alta (L9981) /baixo (NL9980) linhas celulares de cancro metastático humanos grandes pulmão de células
modulação fenotípica das células NK no cancro do pulmão micro-ambiente
NK1.1
+ CD3
– células NK em pulmões de grupo de alto-metastático (3,40 ± 0,90) foram significativamente maiores do que isso no baço (0,10 ± 0,06) (
p
= 0,003). NK1.1
+ CD3
– células NK no baço do grupo de alto metástases (0,10 ± 0,06) foram significativamente menores do que no grupo de baixo metástases (1,66 ± 0,82) e grupo controle (3,80 ± 2,05) (
p
= 0,017,
p
= 0,025) (fig.6)
NK1.1
+ CD3
-. células NK em pulmões de alta grupo -metastatic foram significativamente maiores do que no baço (
P
= 0,003). NK1.1
+ CD3
– células NK no baço do grupo de alto metástases (0,10 ± 0,06) foram significativamente menores do que no grupo de baixo metástase (
p
= 0,017) e controle grupo (
p
= 0,025).
nível de expressão NKG2D das células NK do baço no grupo de alto metástases (4,17 ± 0,85) foram notavelmente menor do que no grupo controle (7,80 ± 2,67) (
p
= 0,034) e grupo de baixo metástases (6,00 ± 0,96) (
p
= 0,040) (Fig.7B)
A:. NKG2A nível de células NK a partir de pulmão no grupo de alto-metastático L9981 expressão foram significativamente maiores do que no grupo de baixa metastático grupo e controlo NL9980 (
P
= 0,000). Ly49I nível de expressão do pulmão no grupo de L9981 e NL9980 grupo foi significativamente mais elevada do que no grupo de controlo (
P
= 0,000) B: nível de expressão NKG2D de células NK a partir de baço do grupo L9981 (4,17 ± 0,85) eram notavelmente menor do que no grupo controle (
p
= 0,034) eo grupo NL9980 (
p
= 0,040). nível de expressão Ly49I no grupo NL9980 era notavelmente mais elevada do que no grupo L9981 (
p
= 0,010) e grupo controle (
p
= 0,004). C: nível de expressão NKG2A de células NK a partir de pulmão foi significativamente mais elevada do que a partir do baço no grupo de alto-metastático L9981 (
P
= 0,007) e nível de expressão Ly49I de pulmão era notavelmente regulado para cima do que no baço (
p
= 0,003) D: Não houve diferença significativa de todo o nível de células NK receptores expressão foi existia no grupo de baixa metástase NL9980. E: O nível de expressão de células NK Ly49I do pulmão foi significativamente mais elevada do que a partir do baço no grupo de controlo (
P
= 0,033)
nível de expressão de células NK NKG2A. a partir de pulmão (5,13 ± 2,36) foi significativamente mais elevada do que a partir de baço (1,47 ± 0,68) no grupo de alto-metastático (
P
= 0,007) (Fig.7C). NKG2A nível de expressão de células NK a partir de pulmão no grupo de alto-metastático (5,13 ± 2,36) foram significativamente maiores do que no grupo de baixa metastático (4,70 ± 1,96) e grupo de controlo (0,73 ± 0,26) (
P =
0,000) (Fig.7A).
nível de expressão Ly49I das células NK de pulmão no grupo high-metastático (4,82 ± 1,78) foi notavelmente-regulada do que no baço (1,50 ± 0,10) (
p
= 0,003) (Fig.7C). O nível de expressão de células NK Ly49I do pulmão (2,79 ± 0,40) foi significativamente mais elevada do que a partir do baço (1,13 ± 0,40) no grupo de controlo (
P
= 0,033) (Fig.7E). nível Ly49I expressão das células NK do pulmão no grupo de alto-metastático (4,82 ± 1,78) e grupo de baixo metastático (6,11 ± 2,23) foi significativamente mais elevada do que no grupo de controlo (2,79 ± 0,40) (
p
= 0,000) (Fig.7A). nível de expressão Ly49I das células NK do baço em baixo metastático grupo (3,40 ± 1,00) foi notavelmente maior do que no grupo de alto-metastático (1,50 ± 0,10) (
p
= 0,010) e grupo controle (1,13 ± 0,40) (
p
= 0,004) (Fig.7B).
efeito letal de células NK no cancro do pulmão micro-ambiente
NK1.1
+ CD3
– células NK activadas por IL-2 in vitro têm atividade citotóxica significativa para as células altas /baixas de câncer de pulmão metastático grandes. Foi observada uma diferença significativa entre razão efector-alvo diferente (
p
= 0,005,
p
= 0,017). células NK apresentaram maior actividade citotóxica para NL9980 do que a L9981 na mesma razão efector-alvo (
P
= 0,035) (Tabela 5).
ARNm de receptor de célula NK que expressam em subcutaneamente tumor transplantado de rato
nos tumores transplantados do grupo portador de tumor, nível de expressão NKG2D das células NK em grupo de alto metástase foi significativamente maior do que no grupo de baixo metástase (
p
= 0,018), e o nível de expressão de células NK Ly49I no grupo de alto metástases também foi notavelmente maior do que o grupo de baixa metástase (
P
= 0,001). No entanto, foi existiu nenhuma diferença significativa do nível de expressão NK1.1 e NKG2A das células NK entre o grupo de alto e baixo metástase (
p Art 0,05) (Fig.8)
NKG2D. nível de células NK em grupo L9981 de alta metástase expressão foi significativamente mais elevado do que no grupo de baixa NL9980 metástase (
P
= 0,018), e o nível de expressão de células NK Ly49I no grupo L9981 também foi notavelmente maior do que grupo NL9980 (
p
= 0,001). Não houve diferença significativa do nível de expressão NK1.1 e NKG2A das células NK foi existiu entre o grupo de alto e baixo metástase.
Discussão
Este estudo revelou que as células NK infiltração e células NK mudança de expressão do receptor no ambiente de tumor NSCLC. A nossa investigação, verificou-se que as células NK infiltradas principalmente no estroma do tumor, que constituem o micro-ambiente do tumor. Estas observações estão de acordo com observações anteriores que demonstram que tumor de pulmão micro-ambiente [16]. Além disso, temos a surpresa que o número de células NK infiltrando no tecido do cancro do pulmão está intimamente relacionada com os tipos patológicos, tamanho do tumor primário, história e prognóstico dos doentes com cancro do pulmão de fumar.
Anterior literatura implícito que algumas moléculas que expressam no tumor e alguns meios libertados a partir do tumor normalmente levado a mecanismos de escape de tumores a partir de células NK vigilância imunológica [19], [20]. Há níveis elevados de HLA molecular não-clássica MHC I – E e HLA – G na superfície da célula tumoral. Eles foram NK CD94 de activação de células /NKG2A e de receptor da superfície celular globulina imune transcrição molecular amostra 2 (ILT2) ligando inibidor, que pode conter a função da célula NK danos [21] – [23]. Ao mesmo tempo, as células tumorais podem secretar alguns factores de supressão tumoral inibição da função das células NK, como a IL-10 [24] e TGF-β [25]. Em torno do tumor infiltrando células NK, algumas alterações especiais em alguns outros tumores humanos foram pesquisados. No cancro do rim, célula NK dentro do tumor estava apenas activada pela estimulação de IL-2 pode ter a função de solução de células alvo. E para os mesmos pacientes houve diferenças significativas entre o fenótipo de células NK de sangue periférico com tumor em [26] – [28]. O receptor de superfície da célula NK DNAM-1, 2B4, a expressão reduzida de CD16 em cancro do ovário, o que pode resultar na função de activação das células NK foram seriamente danificadas [29].
A nossa linha de resultado de pesquisa de que o receptor activado de NK células é regulada para baixo e receptor inibitório das células NK é regulada para cima no tumor transplantado e as lesões metastáticas distantes de linhas celulares de cancro de pulmão de células grandes humanos, o que pode ser a principal razão para a capacidade de matar células NK diminuiu.
NKG2D é um receptor para as moléculas relacionadas com a cadeia de MHC de classe I a e B, que são frequentemente expressas pelos cancros epiteliais. Ligadura de NKG2D induz funções efectoras anti-tumorais em ambas as células NK e T. reconhecimento NKG2D desempenha um papel importante na vigilância imunológica de tumores [30], e que NKG2D actua principalmente para desencadear a apoptose mediada por perforina [31]. Nossa pesquisa verificou que o nível de expressão NKG2D das células NK do baço no grupo de alto metástases eram notavelmente menor do que no grupo controle (
p
= 0,034) e grupo de baixo metástase (
p
= 0,040). Nos tumores transplantados de grupo portador de tumor, o nível de expressão de mRNA de células NK NKG2D no grupo de alto metástase foi significativamente maior do que no grupo de baixa metástase (
P
= 0,018).
NKG2A é um inibidor de receptores de NK que tem sido relatado para formar heterodímeros com ligações dissulfureto a CD94 com invariante. O ligando NKG2A tem sido identificada como a HLA-E, um MHC de classe I-b molécula não clássico, que é amplamente distribuída entre vários tecidos, exposições relativamente baixa expressão de superfície, e tem polimorfismo [32] limitada. O receptor inibitório CD94 /NKG2A desempenha um papel importante na lise mediada por células NK activadas de CD4
+ células T [33]. NKG2A nível de expressão de células NK do pulmão foi significativamente mais elevada do que a partir do baço no grupo de alto-metastático (
P
= 0,007). NKG2A nível de expressão de células NK a partir de pulmão no grupo de alto-metastático foram significativamente maiores do que no grupo de baixa metastático e grupo de controlo (
P
= 0,000). Assim, a regulação negativa de NKG2D e a sobre-regulação de NKG2A pode indicar mecanismo de tolerância imunológica e facilitar a metástase no ambiente tumoral.
A interacção de MHC de classe I com os receptores Ly49 prevenir a activação de células NK e, assim a lise da célula alvo. Assim, as células NK utilizar os receptores Ly49 para diferenciar ‘self’ de ‘auto-falta “. A perda de moléculas MHC classe I em células alvo sai da célula NK da inibição mediada por Ly49, permitindo assim que as células NK para mediar a citotoxicidade [34]. O nível de expressão de células NK Ly49I do pulmão foi significativamente mais elevada do que a partir do baço no grupo de controlo (
P
= 0,033). Ly49I nível de expressão das células NK do pulmão no grupo de alto-metastático grupo e de baixo metastático foi significativamente maior do que no grupo de controlo (
P
= 0,000). Nos tumores transplantados de grupo portador de tumor, o nível de expressão de mRNA de células NK Ly49I no grupo de alto metástases também foi notavelmente maior do que o grupo de baixa metástase (
P
= 0,001).
Além disso, uma resistência mais elevada a actividade citotóxica das células NK existem na linha de alta-humano metastático do pulmão de células grandes de células de cancro L9981, que é muito maior do que na linha de baixo metastático do pulmão de células grandes de células de cancro NL9980. Além disso, é possível que outros receptores de células NK alterado no ambiente tumoral. No melanoma, células NK poderia aumentar significativamente a expressão de CD86, e a ligação de CD86 com CTLA4Ig aumentou significativamente a capacidade das células NK para matar células tumorais [35].