Abstract

Os microRNAs (miRNAs) desempenham um importante papel na carcinogênese através da regulação de seus genes-alvo. polimorfismos de nucleotídeo único relacionadas com o miRNA (miR-SNPs) podem afetar locais biogênese e alvo de miRNA e pode alterar a expressão microRNA e funções. Foram examinados 11 miR-SNPs, incluindo 5 em genes microRNA, 3 em sítios de ligação de microRNA e 3 em componentes de máquinas de processamento de microRNA, eo tempo avaliada à recorrência (TTR) de acordo com genótipos de miR-SNP em 175 não pequenas células-cirurgicamente ressecado cancro do pulmão (NSCLC) pacientes. diferenças significativas na TTR foram encontrados de acordo com o

KRT81

rs3660 (mediana de TTR: 20,3 meses para o genótipo CC contra 86,8 meses para o genótipo GG CG ou, p = 0,003) e

XPO5

rs11077 ( TTR mediana: 24,7 meses para o genótipo AA contra 73,1 meses para os genótipos CC AC ou; p = 0,029). Além disso, quando os pacientes foram divididos de acordo com a fase, foram mantidas essas diferenças para pacientes em estágio I (p = 0,002 para

KRT81

rs3660; P 0,001 para

XPO5

rs11077). Quando os pacientes foram divididos em sub-grupos de acordo com a histologia, o efeito da

KRT81

genótipo rs3660 na TTR foi significativa em pacientes com carcinoma de células escamosas (P = 0,004), mas não naqueles com adenocarcinoma. Nas análises multivariadas, o

KRT81

genótipo rs3660 CC (OR = 1,8; P = 0,023) e do

XPO5

rs11077 genótipo AA (OR = 1,77; P = 0,026) surgiram como variáveis ​​independentes influenciando TTR. Imuno-histoquímica em 80 amostras de pulmão mostraram que 95% dos carcinomas de células escamosas eram positivos para KRT81, em comparação com apenas 19% de adenocarcinomas (p 0,0001). Em conclusão, miR-SNPs são uma nova classe de SNPs que podem adicionar informações de prognóstico útil sobre a evolução clínica de pacientes com NSCLC ressecados e pode ser uma ferramenta chave potencial para a seleção de pacientes em estágio de alto risco I. Além disso, KRT81 emergiu como um marcador imuno-histoquímica prometedora para a identificação de carcinoma do pulmão de células escamosas

citação:. Campayo H, Navarro A, Viñolas N, Tejero R, Muñoz C, Diaz T, et al. (2011) um papel duplo para KRT81: A Associated miR-SNP com recorrência em Non-Small-Cell Lung Cancer e um novo marcador de células escamosas Carcinoma do Pulmão. PLoS ONE 6 (7): e22509. doi: 10.1371 /journal.pone.0022509

editor: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos da América

Recebido: 19 Abril, 2011; Aceito: 22 de junho de 2011; Publicação: 25 de julho de 2011

Direitos de autor: © 2011 Campayo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do Hospital Clinic de Barcelona (Premi Fi de residencia Emili Letang) e Fondo de Investigaciones Sanitarias de la Seguridad social FIS-PI09 /00547. Tania Diaz é um companheiro FI apoiado por AGAUR, Generalitat de Catalunya e Fondo Europeo social. Rut Tejero é um companheiro APIF da Universidade de Barcelona. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é a primeira causa de morte por câncer em todo o mundo [1]. Cerca de 85% dos pacientes com o cancro de células não pequenas de pulmão-(NSCLC) e menos do que 30% são diagnosticadas com a doença em fase inicial. O principal tratamento para a doença em estágio inicial é a cirurgia, mas mesmo quando a ressecção cirúrgica completa é possível, 20-75% dos pacientes com NSCLC recaída [2]. Dada esta elevada taxa de recidiva, os biomarcadores para prever o risco de progressão da doença são necessários, especialmente na fase I, em que a quimioterapia adjuvante não é administrado sistematicamente, mas onde pode ser eficaz em determinados subgrupos de pacientes [3].

os microRNAs (miRNAs) são curtas RNAs não-codificantes que regulam a expressão gênica pós-transcricional por ligando-se principalmente para a região 3’untranslated (UTR) do seu mRNA alvo e reprimir a sua tradução. Várias proteínas são ativos na biogênese de miRNAs. Resumidamente, miARNs são traduzidos por uma polimerase de ARN II para longos transcritos primários (pri-miARN) e processados ​​no núcleo pela ARNase III Drosha em pré-miARNs (70-100 nucleótidos); o pré-miARN é transportado para o citoplasma pela XPO5, em que a ARNase III Dicer gera uma molécula duplex de 21-25 nucleótidos de comprimento. Através da associação com o complexo de silenciamento induzido por ARN complexo (RISC), um destes 2 cadeias (a miARN madura) vai guiar RISC para o alvo de ARNm [4], [5]. miARNs desempenham papéis importantes na regulação de tais processos fundamentais, como o desenvolvimento, a proliferação celular, a diferenciação e a apoptose. crescente evidência mostra que miRNAs são expressas de forma aberrante em cancros humanos, incluindo NSCLC [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12], [13], e eles têm sido relacionada com a etiologia e prognóstico de muitos tumores [14]. Dependendo de seus genes-alvo, miRNAs pode atuar como oncogenes ou genes supressores de tumor [15].

Vários mecanismos podem explicar a desregulamentação dos miRNAs observados em câncer, incluindo alterações genômicas (deleções, amplificações, translocações), epigenética alterações, mutações /polimorfismos, desregulação da transcrição e alterações no miRNA biogênese máquinas [14], [16]. polimorfismos de um único nucleótido (SNPs), que pode afectar as funções de miARN, conhecidos como o miR-SNPs, são encontrados em genes de miARN, em miARN locais (na 3 ‘UTR do gene alvo) ou nos componentes da maquinaria de biogénese de miARN ligação [17] . miR-SNPs podem afectar os níveis de expressão de miARN de maneiras diferentes, o que resulta em perda ou ganho de função miARN [18]. SNPs em genes de miARN pode afectar a pri-miARN, pré-sequência de miARN ou madura e miARN pode potencialmente modular o processamento de miARN, alterar os níveis de miARN maduros ou alterar as interacções miARN-ARNm [19], [20]; SNPs que afecta a expressão de proteínas envolvidas na biogénese de miARN pode alterar a miRNAome na célula [21]; e, finalmente, os SNPs em locais de miARN alvo, que são mais frequentes e mais específicos no genoma humano, podem perturbar ou alterar a repressão mediada por miARN de um gene-alvo [22].

Esta nova classe de SNPs abre -se uma nova área de investigação em biologia do cancro e da oncologia clínica, especialmente no estudo de progressão da doença, o prognóstico do paciente e eficácia do tratamento. Recentemente, vários estudos têm mostrado que os SNPs em redes de miARN pode afectar tanto o risco de desenvolvimento de vários cancros [20] e também o prognóstico de muitos tumores [23], [24], [25], [26].

no presente estudo, nós avaliamos 11 SNPs (cinco genes de miRNA, três em sítios de ligação de miRNA, e três em genes de processamento de miRNA) em 175 pacientes com NSCLC cirurgicamente ressecados e correlacionados nossos achados com tempo de recorrência (TTR) e sobrevida global (OS). Além disso, a fim de examinar potenciais diferenças na expressão de acordo com a histologia, examinamos o padrão imunocoramento KRT81 em 77 amostras de câncer de pulmão e três controles de pulmão normal.

Materiais e Métodos

População do estudo e Declaração de Ética

Entre Março de 1996 e Dezembro de 2009, 175 pacientes com NSCLC foram submetidos à ressecção cirúrgica completa em nossa instituição. Todos os pacientes tinham patologicamente confirmada doença em estágio I-III. Aprovação para o estudo foi obtido a partir do Institutional Review Board do Hospital Clinic, Barcelona, ​​Espanha. consentimento informado por escrito foi obtido de cada participante, de acordo com a Declaração de Helsinki

Seleção do miR-SNPs

Foram selecionados 11 SNPs em genes envolvidos nas vias de regulação miRNA:. SNPs nos genes miRNA ; SNPs em sítios de ligação de miARN; e os SNPs em genes de processamento de miARN. Dez dos SNPs foram selecionados de acordo com os seguintes requisitos: em primeiro lugar, a freqüência do alelo determinado para a população europeia e da disponibilidade no Centro Nacional de Biotecnologia do banco de dados de informações (NCBI) SNP; em segundo lugar, uma frequência de genótipo menor para a população europeia ≥ 0,05; e, finalmente, quer uma associação conhecida com uma susceptibilidade diferencial para o desenvolvimento do cancro ou de uma expressão diferencial em tumores sólidos. Para os SNPs em sítios de ligação de miRNA, foram selecionados três SNPs com uma frequência alélica aberrante em tumores humanos. Além disso, um SNP –

MIR194-2

– foi especificamente escolhida porque tinha sido mostrado para ser expresso diferencialmente no cancro do pulmão [11]. A tabela 1 resume a justificativa para a seleção SNP.

isolamento de ADN, iniciadores, sondas e análise de SNP

DNA foi obtida a partir de tecido tumoral embebido em parafina usando o kit de tecido DNeasy comercial ( Qiagen, Valencia, CA) seguindo o protocolo do fabricante. Para medir a quantidade de ADN, utilizou-se um espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA). Primers e sondas foram comercialmente disponíveis (TaqMan SNP Genotyping Assays, Applied Biosystems, Foster City, CA). SNP análise foi realizada por discriminação alélica numa Prism 7500 Sequence Detection System ABI (Applied Biosystems).

A imuno-histoquímica

A imuno-histoquímica foi realizada em secções de tecidos, embebidos em parafina e fixado em formalina de 77 carcinomas pulmonares e 3 controles pulmonares normais do Serviço de Patologia do Hospital Clinic de Barcelona, ​​após avaliação por um patologista torácica. secções transversais de cinco mícrons de espessura de tecido fixado em formol e embebido em parafina foram serialmente cortados e montados em Dako silanada Slides (S · 3003; Dako, Glostrup, Dinamarca). Para a recuperação de antigénio, as secções foram imersos em solução de destino manualmente Recuperação, pH elevado (Dako) e aqueceu-se num banho de água a 95-99 ° C durante 20 min. A actividade da peroxidase endógena foi extinta por imersão em solução Dako real peroxidase de bloqueio durante 10 minutos. As secções de tecido foram incubadas com o anticorpo primário contra KRT81 (diluição 1:50; clone sc-100929; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) durante 30 min à temperatura ambiente. coloração de imunoperoxidase foi realizada utilizando sistema de Avanço /HRP (Dako) e líquido DAB + (Dako). Finalmente, os cortes foram corados com hematoxilina. Todas as lâminas foram cegamente marcado por dois patologistas as mesmas, utilizando um sistema de três pontos. O sistema de pontuação foi a seguinte: 0, 5% de coloração de células tumorais; 1, 5% a 50% de coloração de células tumorais; 2, 50% de coloração de células tumorais. resultados não interpretáveis ​​foram eliminadas de consideração posterior. Casos marcou 1 ou 2 foram considerados positivos, e os casos marcou 0 foram consideradas negativas. Apenas positividade citoplasmática foi avaliada. As secções de tecido de pulmão normal foram usados ​​como controlos positivos, enquanto os controlos negativos foram obtidas por incubação das secções, sem o anticorpo primário.

A análise estatística

O objectivo primário do estudo foi de TTR. O objetivo secundário foi OS. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando PAS W Statistics 18 (SPSS Inc., Chicago, IL). A TTR foi calculada a partir do tempo de tratamento cirúrgico para a data de recaída ou último seguimento. OS foi calculado a partir do momento do tratamento cirúrgico para a data da morte ou último follow-up. Após a cirurgia, os pacientes sem progressão do tumor foram acompanhados a cada 3 meses para 2 anos, então a cada 6 meses até 5 anos após a cirurgia, e, em seguida, anualmente. O teste de log-rank e gráficos de Kaplan-Meier foram utilizadas para avaliar a associação de TTR e OS com cada um dos SNPs e variáveis ​​clínicas. A análise multivariada Cox (método enter) foi usado para calcular as odds ratio independentes para TTR e OS. Nas análises de imuno-histoquímica, as frequências foram comparadas pelo teste exato de Fisher. O nível de significância foi estabelecido em ≤0.05.

Resultados

características do paciente

A análise incluiu 175 pacientes, 154 (88%) do sexo masculino. A idade média foi de 65 anos (variação, 35-85). status de vinte e quatro (13,7%) pacientes tiveram Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) desempenho (PS) 0 e 149 (85,2%) pacientes apresentavam PS 1. Noventa e oito (56%) pacientes tinham doença em estágio I. Oitenta (45,7%) pacientes apresentavam adenocarcinoma e 84 (48%) tinham carcinoma de células escamosas. Cento e cinquenta e oito (90,3%) pacientes eram fumantes ativos ou inativos. Cento e trinta e dois (75,4%) pacientes foram submetidos a lobectomia ou bilobectomia. Nove (5,1%) pacientes tinham recebido quimioterapia pré ou quimioradioterapia de doença em estágio IIIA ressecável. Dezesseis pacientes (9,1%) receberam quimioterapia adjuvante (13 para a fase II ou III da doença e 3 para doença em estágio I com T 4 cm). O seguimento médio foi de 35 meses (variação, 2-160). Após um seguimento de 160 meses, a recorrência da doença ocorreu em 75 (42,9%) pacientes (Tabela 2).

TTR, OS e miR-SNPs

global mediana TTR era 39.03 meses (IC 95%, 3,9-74,1), e OS mediana foi de 90,6 meses (IC 95%, 47,4-133,7). Na análise univariada, incluindo apenas as características clínicas, estágio foi associado a TTR (P = 0,008) e idade foi associada a OS (P = 0,014). Também foi observada uma tendência não significativa para uma associação entre sexo e TTR (P = 0,081). A Tabela 3 mostra as frequências genotípicas para todos os 11 miR-SNPs analisados, tanto no presente estudo e como relatado na base de dados NCBI SNP (dbSNP) para a população europeia. diferenças significativas na TTR foram encontrados de acordo com o

KRT81

genótipo rs3660 (P = 0,008; Figura S1). Dada a distribuição semelhante em pacientes com TTR para os genótipos CG e GG, estes dois grupos foram combinados para outras análises. TTR mediana para 45 pacientes (25,9%) com o genótipo CC foi de 20,3 meses versus 86,8 meses para os pacientes com a CG ou genótipo GG (P = 0,003; Figura 1A). Entre 98 pacientes com doença em estágio I, mediana TTR foi de 23,9 meses para 25 pacientes (25,5%) com o genótipo CC contra 100,2 meses para pacientes com o CG ou genótipo GG (P = 0,002; Figura 1B). Observou-se também uma tendência não significativa para a TTR diferencial de acordo com o

XPO5

rs11077 genótipo (P = 0,077; Figura S2). Dada a distribuição semelhante em pacientes com TTR para os genótipos de CA e CC, estes dois grupos foram combinados para outras análises. A TTR significativamente menor foi observada em pacientes com o

XPO5

rs11077 genótipo AA; mediano TTR foi de 24,7 meses para os pacientes com o genótipo AA, contra 73,1 meses para aqueles com o AC ou genótipo CC (P = 0,029; Figura 2A). Entre 97 pacientes com doença em estágio I, mediana TTR foi 24,13 meses para 33 pacientes (34%) com o genótipo AA, mas não foi alcançado para aqueles com o AC ou genótipo CC (P 0,001; Figura 2B). Nenhuma outra diferença em TTR foram observadas de acordo com qualquer um dos outros clones estudados. Não foram observadas diferenças significativas na TTR no estágio II-III pacientes de acordo com qualquer um dos SNPs analisados ​​

1A:. em todos os pacientes analisados. IB:. Pacientes com doença em estádio I

1A: em todos os pacientes analisados. IB: em pacientes com doença em estádio I

Median OS não foi atingido por 49 pacientes com a

MIR423

genótipo rs6505162 AA, em comparação com 61,6 meses para 42 pacientes com. o genótipo CC e 90,5 meses para aqueles com o genótipo AC (P = 0,043; Figura S3). Nenhuma outra diferença em OS foram observadas de acordo com qualquer um dos outros genótipos analisados.

análises multivariadas

Todas as variáveis ​​com um log-rank P≤0.1 univariada TTR (sexo, fase, tipo de cirurgia ,

KRT81

genótipo rs3660 e

XPO5

rs11077 genótipo) foram incluídos na análise multivariada de Cox para TTR. sexo masculino (odds ratio [OR], 3,73; 95% CI, 1,4-9,9; P = 0,008), doença em estádio I (OR, 0,34; IC 95%, 0,18-0,65; P = 0,001),

KRT81

genótipo rs3660 CC (OR, 1,8; IC95%, 1,08-2,99; P = 0,023) e

XPO5

rs11077 genótipo AA (OR, 1,77; IC 95%, 1,07-2,91; P = 0,026) emergiu como variáveis ​​independentes para TTR (Tabela 4). Todas as variáveis ​​com um log-rank P≤0.1 OS univariada (sexo, idade e

MIR423

rs6505162 genótipo) e estágio da doença foram incluídos na análise multivariada de Cox para OS. Idade ≤65 (OR, 0,48; IC 95%, 0,25-0,95; P = 0,036) e doença I fase (OR = 0,31, 95% CI 0,14-0,67; P = 0,003) foram variáveis ​​independentes para OS

Outras análises de KRT81

Desde diferenças significativas na TTR foram encontrados de acordo com o

KRT81

genótipo rs3660, examinamos ainda mais o efeito deste genótipo sobre os sub-grupos de pacientes com adenocarcinoma eo carcinoma de células escamosas. Entre os 83 pacientes com carcinoma de células escamosas, TTR foi de 19,3 meses para 24 pacientes com o genótipo CC e 121 meses para 59 pacientes com o genótipo GG CG ou (P = 0,004; Figura 3A). Em contraste, não foi observada diferença significativa de acordo com o

KRT81

genótipo rs3660 entre os 80 pacientes com adenocarcinoma (P = 0,375; Figura 3B). Nós, então, explorada a possibilidade de um efeito diferencial semelhante para os outros dez genótipos, mas não encontraram diferenças na TTR entre carcinoma de células escamosas e adenocarcinoma acordo com o genótipo

A:. TTR de acordo com a

KRT81

rs3660 genótipo em 83 de 84 pacientes com carcinoma de células escamosas; um paciente não pôde ser genotipados. B: TTR de acordo com a

KRT81

genótipo rs3660 em 80 pacientes de adenocarcinoma. C: caso de carcinoma de células escamosas mostrando coloração KRT81 citoplasmática difusa. D: Controlo negativo. E: coloração negativa para KRT81 em um caso de adenocarcinoma. F: A imuno-histoquímica numa secção do tecido normal do pulmão. KRT81 positividade citoplasmática no epitélio bronquiolar foi utilizado como controle positivo.

A fim de explorar ainda mais esta marcada valor prognóstico da

KRT81

genótipo rs3660 no carcinoma de células escamosas, analisamos KRT81 expressão por imuno-histoquímica em 42 carcinoma de células escamosas, 33 adenocarcinoma e 2 amostras de carcinoma adeno e em três amostras de tecido pulmonar normal. Tabela S1 mostra os resultados de cada uma das 80 amostras. Foram observadas diferenças notáveis ​​no padrão de imunomarcação de acordo com a sub-tipo histológico: 38 de 40 carcinomas de células escamosas (95%) foram positivos, em comparação com 6 de 32 adenocarcinomas (19%) (teste exato de Fisher p 0,0001; Tabela 5). Para além disso, 3 dos 6 adenocarcinomas positivos mostrou apenas uma positividade focal (pontuação 1). A sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo, valor preditivo negativo e acurácia foram de 0,95, 0,81, 0,86, 0,93 e 0,89, respectivamente. Figura 3C-F mostra exemplos da avaliação imuno-histoquímica em células escamosas carcinoma, adenocarcinoma e controles.

Discussão

No presente estudo, analisamos 11 miR-SNPs em uma série de 175 pacientes com NSCLC ressecados e correlacionados nossos resultados com TTR e OS. Descobrimos que os pacientes com a

KRT81

genótipo rs3660 CC teve uma TTR mais curto do que aqueles com o genótipo GG CG ou e que os pacientes com a

XPO5

rs11077 genótipo AA teve uma TTR mais curto do que aqueles com o CA ou CC genótipo. Estes resultados também se mostrou verdadeira no subgrupo de pacientes com doença em estádio I. Além disso, as análises multivariadas mostraram que o

KRT81

genótipo rs3660 CC eo

XPO5

rs11077 genótipo AA foram fatores de risco independentes para TTR. A análise univariada para OS mostrou uma associação entre a sobrevivência eo

MIR423

genótipo rs6505162; no entanto, esta não foi uma variável independente na análise multivariada. Além disso, o valor prognóstico do

KRT81

genótipo rs3660 foi mais acentuada no carcinoma de células escamosas, indicando que KRT81 pode ser um novo marcador imuno-histoquímico para o carcinoma de células escamosas do pulmão.

Vários miR- Os SNPs são conhecidos por afectar a susceptibilidade ao cancro do pulmão e sobrevivência. A SNP na rs11614913 pré-miR-196a2 foi associada primeiramente com a sobrevivência em pacientes com NSCLC [23] e mais tarde foi ligado a um maior risco de desenvolver câncer de pulmão em chinês [27] e coreano [28] populações. Um SNP no pré-miRNA região adjacente

miR-30c-1

rs928508 tem sido relacionada com a sobrevivência em NSCLC, com um efeito maior na fase I e II da doença [29]. Um local alvo miRNA SNP no

gene KRAS

foi associada a um maior risco de desenvolver NSCLC entre os fumantes moderados [22]. Recentemente, um haplótipo SNP no gene biogênese miRNA

RNASEN

foi associado com menor sobrevida no câncer de pulmão [30] e um SNP em outro composto relacionado com a biogênese,

ago1

rs636832, estava ligado a uma diminuição do risco de cancro do pulmão [31]. Até à data, no entanto, nenhuma relação entre o miR-SNPs e recorrência de cancro de pulmão após a cirurgia tem sido relatada.

XPO5 é a proteína ran-dependente de GTP que transporta a pré-miARN a partir do núcleo para o citoplasma. Recentemente, nenhuma relação foi encontrada entre o

XPO5

rs11077 e risco de câncer de pulmão na população coreana [31]. Em contrapartida, no presente estudo, observou-se uma associação positiva entre este SNP e TTR em uma população europeia. Especula-se que um SNP em

XPO5

poderiam alterar a função normal da proteína para extrudir o pré-miARNs a partir do núcleo, alterando assim a regulação de vários miARNs na célula.

Fase II e pacientes com NSCLC III são tratados rotineiramente com quimioterapia adjuvante após ressecção cirúrgica, que melhorou a sobrevivência em diversos ensaios clínicos randomizados, [3], [33], [34] [32]. No entanto, existem muitos pacientes de alto risco de fase I, que também poderiam beneficiar desse tratamento, e tem sido sugerido que os pacientes com tumores ≥4 cm pode derivar benefício de sobrevivência de quimioterapia adjuvante [35]. Os biomarcadores para identificar com precisão os pacientes na fase I com um elevado risco de recorrência seria uma ferramenta útil no tratamento desses pacientes. Uma vez que o efeito sobre a recorrência observada com as variantes genéticas em

KRT81

e

XPO5

foi mantida no subgrupo de pacientes com doença em estádio I, sugerimos que esses SNPs são candidatos ideais para uma investigação mais aprofundada com vista a individualização do tratamento nestes pacientes

importante, a recorrência do tumor foi influenciada pelo SNP localizado na 3’UTR de

KRT81

, o local de ligação de vários miARNs:. miR-17, miR-93, miR-20b, miR-519d, miR-520g, miR-520H, miR-519c-3p, miR-519B-3p, miR-519a e miR-765. Alguns destes miARNs ter sido previamente demonstrado que ser alterados em NSCLC [11], e a presença do SNP afecta o local de ligação de sequência sementes destas miARNs, como mostrado na Figura S4.The frequência alélica deste SNP é diferente em humanos cancros do que na população normal [36].

KRT81

codifica para a proteína KRT81, também conhecido como Hb-1, um tipo de queratina do cabelo que é fisiologicamente expressa em fios de cabelo. Queratina são proteínas expressas em todos os tipos de células epiteliais [37], com diferentes padrões de expressão entre diferentes carcinomas [38], e que são amplamente utilizados como marcadores de diagnóstico. Eles constituem os filamentos intermédios de células epiteliais, envolvidas na manutenção da integridade de célula e resistência a factores de stress mecânicos e não mecânicos [39]. Queratinas não estão apenas relacionados com a regulação das funções celulares como a motilidade e crescimento, mas também para a síntese de proteínas, a polarização APICO-basal e sinalização intracelular, e eles têm sido descritos como marcadores prognósticos em tumores epiteliais [40]. carcinomas da mama ectopicamente expressar KRT81 [41], e no presente estudo observou-se expressão KRT81 no tecido tumoral de pulmão por imuno-histoquímica. Até à data,

KRT81

não foi validado como um marcador de prognóstico e do presente estudo é o primeiro a vincular um

KRT81

variante a recorrência do tumor.

Além disso, verificou-se que KRT81 pode muito bem ser um novo marcador imuno-histoquímica do carcinoma de células escamosas. KRT81 mostrou uma coloração positiva claro em carcinomas de células escamosas (95% positivo), enquanto que 81% dos adenocarcinomas foram negativos. Curiosamente, no sub-grupo analisa de TTR de acordo com a sub-tipo histológico, o efeito da

KRT81

genótipo rs3660 sobre a recorrência foi mais pronunciado em pacientes com carcinoma de células escamosas. O facto de vários agentes segmentados são novos activespecifically em adenocarcinoma e outros não deve ser utilizado em carcinoma de células escamosas por causa de complicações potenciais sublinha a necessidade de classificar mais NSCLC como carcinoma escamoso ou não-escamosas. Neste cenário, KRT81 poderia ser um novo marcador útil para o diagnóstico diferencial de NSCLC; como tal, pode ser adicionada ao painel de marcadores imuno-histoquímicos actualmente utilizados, tais como P63 e TTF1 [42], [43].

A evidência crescente de ligações entre miARNs e cancro torna a análise de SNPs em genes relacionados com o miRNA uma técnica chave potencial para a seleção de pacientes para a estratificação de risco. Apesar de algumas limitações – incluindo a falta de validação independente ou funcional eo número relativamente limitado de SNPs – do presente estudo é o primeiro a observar padrões diferenciais relacionados com o miR-SNP de recorrência do tumor em pacientes com NSCLC tratados cirurgicamente. Nossas descobertas indicam que SNPs em

KRT81

e

XPO5

poderia revelar-se biomarcadores úteis para individualizar a terapia em pacientes com NSCLC e que KRT81 pode ser um novo marcador imuno-histoquímica do carcinoma de células escamosas, proporcionando uma nova ferramenta de diagnóstico para ser usado em tomada de decisão terapêutica.

Informações de Apoio

Figura S1.

TTR de acordo com a

KRT81

genótipo rs3660

doi:. 10.1371 /journal.pone.0022509.s001

(TIF)

Figura S2.

TTR de acordo com a

XPO5

rs11077 genótipo

doi:. 10.1371 /journal.pone.0022509.s002

(TIF)

Figura S3.

OS de acordo com a

MIR423

genótipo rs6505162

doi:. 10.1371 /journal.pone.0022509.s003

(TIF)

Figura S4.

miRNAs conservadas Previsto segmentação KRT81. rs3660 SNP, localizado na região 3’UTR do

KRT81

, afeta a ligação destes miRNAs

doi:. 10.1371 /journal.pone.0022509.s004

(PPTX)

Tabela S1.

imunocoramento KRT81 nos 80 casos analisados ​​

doi:. 10.1371 /journal.pone.0022509.s005

(DOC)

Reconhecimentos

Agradecemos Dolors Fuster ( Universidade de Barcelona) para obter ajuda técnica e Renee O’Brate por sua assistência em escrever o papel.