Abstract

tetrandrina, um alcalóide bis-benzilisoquinoleínico isolado da raiz seca de Hang-Fang-Chi (

Stephania

tetrandra

S. Moore), foi relatada a possuir efeitos anti-câncer em muitos tumores. Neste estudo, nós investigamos a apoptose induzida por tetrandrina sobre o câncer gástrico humano células BGC-823

in vitro

e

in vivo

. Os resultados mostraram que tetrandrina viabilidade celular significativamente inibida numa dose e modo dependente do tempo e a apoptose induzida. É o aumento da apoptose; upregulation de Bax, Bak e Bad; e regulação negativa de Bcl-2 e Bcl-XL em células BGC-823. Além disso, tetrandrina aumentou a activação de caspase-3 e -9, libertação de citocromo

C

, e regulação positiva do Apaf-1, sugerindo que a apoptose induzida por tetrandrina foi relacionada com a via mitocondrial. Enquanto isso, o pré-tratamento com o inibidor da pan-caspase z-VAD-fmk em células BGC-823 reduziu a apoptose induzida por tetrandrina pelo bloqueio da activação das caspases. Além disso, tetrandrina efetivamente inibiu o crescimento tumoral através da indução da apoptose, a qual foi verificada por análise de imuno-histoquímica em um modelo de murganho de xenoenxerto nu. Tomados em conjunto, concluímos que tetrandrina inibiu significativamente a proliferação de células de câncer gástrico BGC-823 através da apoptose dependente da mitocôndria, que pode desempenhar um papel promissor na terapia do cancro gástrico

Citation:. Qin R, Shen H, Cao Y, fang Y, Li H, Q Chen, et ai. (2013) tetrandrina Induz mitocôndrias-Mediated apoptose em humanos câncer gástrico BGC-823 Cells. PLoS ONE 8 (10): e76486. doi: 10.1371 /journal.pone.0076486

Autor: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, Estados Unidos da América

Recebido: 16 de dezembro de 2012; Aceito: 27 de agosto de 2013; Publicação: 01 de outubro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Qin et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelos seguintes subsídios: os subsídios da National Science Foundation Natural da China (81070423 e 81101677), os subsídios da Natural Science Foundation da província de Jiangsu (BK 2.010.332). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Na China, câncer gástrico, um dos tumores malignos mais comuns, resultante de um acúmulo de eventos genéticos e epigenéticos, ainda tem uma alta incidência e mortalidade [1-3]. Há vários fatores que causam o aparecimento de cancro gástrico, tais como

Helicobacter Pylori

infecção, dieta, consumo de tabaco, e assim por diante [4]. Dependendo das circunstâncias, a maioria dos doentes com cancro gástrico precisar de cirurgia, quimioterapia e /ou radioquimioterapia [5]. Estudos anteriores revelaram que o câncer gástrico é uma doença genética complexa relacionada com oncogenes ou supressores de tumor [6].

tetrandrina (C

38H

42

2O

6, MW 622,730 ) é um alcalóide bis-benzilisoquinoleínico isolado da raiz seca de Hang-fang-Chi (

Stephania

tetrandra

S. Moore). Recentemente, as diversas actividades biológicas de tetrandrina têm sido estudadas intensamente devido à sua ampla utilização na artrite, a arritmia, a inflamação, a silicose, a vários tipos de tumores, e inverter a resistência a múltiplas drogas [7,8]. É relatado que tetrandrina tem efeitos significativos sobre os tumores, incluindo a desaceleração do crescimento do tumor e aumentar animais tempo de sobrevivência ea taxa de sobrevivência [9-12]. Tetrandrina provoca um bloqueio do ciclo celular em G1 e induz a apoptose em diversos tipos de células. No entanto, os mecanismos exactos através dos quais tetrandrina inicia a apoptose e inibe o crescimento celular em células de tumor gástrico permanecem incertos [13]. É relatado que a codelivery de paclitaxel (Ptx) e tetrandrina por nanopartículas podem eficientemente aumentar a citotoxicidade de Ptx por inibição sequencial da Akt ROS-dependente e activação das vias de apoptose com base na terapia contra o cancro gástrico oxidação [14]. No entanto, como um agente terapêutico, Ptx inevitavelmente tem efeitos secundários graves, devido aos seus efeitos tóxicos não específicos e solventes especiais, e as células tumorais podem tornar-se mais resistentes à apoptose induzida por Ptx [15-17]. Um estudo anterior demonstrou que tetrandrina tem um efeito sinérgico com agentes quimioterapêuticos sobre apoptose de linhas celulares de cancro gástrico [18]. Além disso, um derivado de (H1) de tetrandrina exerce uma boa actividade anti-resistência a múltiplas drogas, iniciando a via de apoptose intrínseca e inibindo a activação de ERK1 /2 e Akt1 /2 [19]. Estes achados sugerem que tetrandrina pode substituir Ptx como a primeira quimioterapia linha para câncer gástrico.

Desde tetrandrina tem um grande potencial na terapia anti-câncer, é importante estudar de forma sistemática para entender seu mecanismo. Portanto, neste estudo, foram investigados os possíveis mecanismos de tetrandrina sobre as células cancerosas gástricas humanas

in vitro

e

in vivo

.

Materiais e Métodos

Materiais e reagentes

tetrandrina foi obtido a partir de Jiangxi Yintao Pharmaceutical Development Company (Jiangxi, China). Os anticorpos foram obtidos a partir das seguintes fontes: anticorpos contra Bcl-2, Bax, Bcl-XL, a caspase-3, -8, -9, citocromo

C

, Apaf-1, e β-actina foram de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA); anti-Bad e Bak eram de Bioworld Tecnologia (St. Louis Park, MN, EUA). O kit de reagente de Trizol foi adquirido de Invitrogen (Grand Island, NY, EUA). MTT (brometo de 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5-difeniltetrazólio) foi adquirido a partir de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA).

cultura celular

A linha de células humanas de câncer gástrico BGC-823 foi comprado de Shanghai Biologia celular, Academia chinesa de Ciências (Xangai, China). As células foram cultivadas em meio modificado por Dulbecco de Eagle (DMEM) (Gibco BRL, Grand Island, NY, EUA), suplementado com 10% de soro fetal bovino (Hyclone, Logan, UT, EUA), 1% de penicilina e 1% de estreptomicina numa atmosfera humidificada de 95% de ar e 5% de CO

2 a 37 ° C.

a viabilidade celular ensaio

a viabilidade celular foi medida pelo ensaio de MTT. Em resumo, as células foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 1 × 10

4 células /poço. Após 36 h, as células foram tratadas com ou sem tetrandrina em concentrações variáveis ​​de 24, 48 e 72 h; e solução salina tamponada com fosfato (PBS) serviu como um controlo negativo. Em seguida, 20 ul de solução corante de MTT (0,5 mg /ml, dissolvida em PBS e filtradas através de uma membrana de 0,2 mm) foi adicionado a cada poço e incubou-se a 37 ° C durante 4 h. Em seguida, 150 ul de sulfóxido de dimetilo foi adicionada a cada poço, e as placas foram incubadas a 37 ° C durante um adicional de 10 min. A absorvância foi medida a 490 nm utilizando um leitor de microplacas de 96 poços. O

valor de IC 50 foi definido como a concentração de fármaco que inibe o crescimento celular de 50% em comparação com o controlo.

blotting

células de cancro gástrico ocidentais foram lavadas duas vezes com PBS, e depois 100 ul de tampão de lise RIPA (Beyotime, China) foi adicionado a cada poço para lisar as células durante cerca de 20 min. Em seguida, a mistura foi centrifugada a 12.000

g

durante 15 min, e o sobrenadante foi recolhido. A concentração de proteína foi detectada utilizando um kit de ensaio de proteína BCA (Beyotime, China) de acordo com as instruções do fabricante. A proteína total foi separada por SDS-PAGE a 8%, 10%, e 12% de geles de poliacrilamida e transferidas electroforeticamente para difluoreto de polivinilideno (PVDF) membranas (Millipore, Bedford, MA, EUA). Após o bloqueio durante 2 horas ou durante a noite com leite seco não gordo a 5% (dissolvida em Tris-tamponada salina-Tween 20; TBST), as membranas foram incubadas com anticorpos primários (1: 500-1: 1000 de diluição) durante 2 h a temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C e depois lavou-se três vezes com TBST (5 mM Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 136 mM, 0,1% de Tween 20) antes de reagir com peroxidase de rábano (HRP) -conjugated anticorpos secundários (1: 5000 -1: 10000) durante 1 h à temperatura ambiente. Depois de se lavar três vezes durante 10 minutos cada com TBST, as membranas foram tratadas com ECL Western Blotting Detection Reagent.

quantitativo em tempo real da reacção em cadeia da polimerase

O ARN celular total foi isolado utilizando o reagente Trizol ( Invitrogen) seguindo o protocolo do fabricante e dissolveu-se em água tratada com DEPC. A concentração de ARN total foi medida por espectroscopia de absorvância de UV. A transcrição reversa foi realizada utilizando um RevertAid ™ First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas MBI, Waltham, MA, EUA) seguindo o protocolo do fabricante. O ADNc recém-sintetizado foi amplificado por reacção em cadeia da polimerase (Fermentas). As sequências de cada um dos iniciadores utilizados no presente estudo são mostrados na Tabela 1. A reacção em cadeia da polimerase condições são listados como se segue: 95 ° C durante 3 min, 95 ° C durante 5 min, 58 ° C durante 30 min, e 72 ° C durante 30 min, seguido de 40 ciclos a 94 ° C durante 15 s e 60 ° C durante 1 min. Todos os testes foram realizados em triplicado.

Gene

iniciador de sentido directo (5 ‘para 3’)

iniciador anti-sentido (5 ‘para 3’)

bcl-2GGATCCAGGATAACGGAGGCCCAGATAGGCACCCAGGGTbaxACCAAGAAGCTGAGCGAGTGTACAAACATGGTCACGGTCTGCbclxlGGCAGGCGACGAGTTTGACCCATCCCGGAAGAGTTCATβ-actinTGGCACCCAGCACAATGAACTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCATable 1. As sequências de iniciadores para os genes utilizados no presente estudo.

CSV Transferir CSV

ligação de anexina V-iodeto de propídio ensaio

Em resumo, as células foram semeadas em placas de 6 poços e tratadas com diferentes concentrações de tetrandrina, durante 24 h, e PBS serviram como controlo negativo. em seguida, as células foram ressuspensas em 500 ul de tampão de ligação frio. As suspensões de células foram coradas contra Anexina-V e iodeto de propídio (BD Pharmingen

TM, Becton Dickinson, San Jose, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante, e, em seguida, a análise de citometria de fluxo foi efectuada por um FACS (Coulter, Becton Dickinson).

a caspase-3 ensaio de actividade

Resumidamente, as células incubaram-se em uma placa de 6 poços a uma concentração de 4 x 10

5 /cavidade e tratados com a concentração indicada de droga. um volume igual de PBS foi utilizado como controlo negativo. a caspase-3 actividade foi medida usando um caspase-3 kit de ensaio de actividade (Beyotime, China) seguindo as instruções do fabricante. A absorvência foi então medida a 405 nm utilizando um leitor de microplacas. Todos os experimentos foram realizados em triplicado.

Ética declaração

Os procedimentos que envolvem animais e seus cuidados foram realizados em conformidade com as diretrizes do NIH (NIH Pub. No.85-23, revista em 1996) e foram aprovados pelo Comitê animal Care and Use of Hospital do Povo Affiliated, Universidade de Jiangsu.

experiências com animais

ratinhos nu fêmea (BALB /c nu /nu), 4-6 semanas de idade, foram obtidos a partir do Centro de animal Experimental da Academia chinesa de Ciências (Xangai, China) e mantido sob condições específicas livres de patógenos em um gabinete biológico do Biotério da Universidade de Jiangsu. Os animais foram mantidos num ciclo de luz-escuro de 12 h. A temperatura ambiente mantida a cerca de 20 ° C, e a humidade foi mantida a cerca de 50% numa sala com um fornecimento de ar filtrado.

tratamento de tetrandrina subcutâneas BGC-823 tumores em ratinhos

Para estabelecer um modelo de murganho de xenoenxerto de murganhos BALB /c de cancro gástrico humano, células BGC-823 a uma concentração de 5,0 x 106/150 mL foram injectadas no flanco direito de cada ratinho BALB /c nu. Aproximadamente 10 dias mais tarde (o tamanho do tumor atingiu 120-150 mm3), os ratinhos nus foram divididos aleatoriamente em três grupos (n = 5) e tendo em conta os seguintes tratamentos: controle (tratados com solução salina normal), do grupo de dose baixa (tratados com 40 mg /tetrandrina kg), e o grupo de dose elevada (tratados com 120 mg /kg tetrandrina). Os ratinhos BALB /c foram injectados por via intraperitoneal com tetrandrina (200 uL, 40 mg /kg ou 120 mg /kg) ou um volume igual de solução salina normal, uma vez por dia durante 3 semanas, respectivamente. O tamanho do tumor foi medido a cada 3 dias em duas dimensões perpendiculares com compassos de calibre de Vernier, e o volume do tumor (TV) foi calculada pela fórmula: TV = comprimento (mm) x largura

2 (mm

2) × 0,5 . o volume relativo do tumor (RTV) foi calculada de acordo com a seguinte fórmula: RTV = TV

T /TV

0, em que a televisão

0 é o volume do tumor no dia 0 e TV

t é o tumor volume em um determinado dia t. Enquanto isso, os animais foram pesados ​​duas vezes por semana. No final da experiência, os tumores foram excisados ​​e fixados em formalina para posterior análise.

A análise imunohistoquímica

As amostras embebidas em parafina excisados ​​de BGC-823 ratinhos nus foram coradas utilizando os seguintes anticorpos : Bcl-2 e Bax (Boster), Bcl-XL, activado a caspase-3 e caspase-9 activado (Santa Cruz) para imuno-histoquímica. As imagens foram tiradas com um microscópio de fluorescência (Carl Zeiss).

A análise estatística

Todos os experimentos foram realizados pelo menos três vezes, e todos os dados foram apresentados como média ± desvio padrão (SD). As diferenças estatísticas foram determinadas pelo one-way ANOVA usando SPSS 16.0 software. Um valor P inferior a 0,05 foi considerado significativo.

Resultados

efeito citotóxico do tetrandrina em células BGC-823

A estrutura química do tetrandrina é mostrado na Figura 1A. O efeito anti-proliferativo de tetrandrina foi investigada em células BGC-823 utilizando o ensaio MTT. Como é mostrado na Figura 1B, as células foram tratadas durante 24, 48, e 72 h, com várias concentrações de tetrandrina. Tetrandrina foi encontrado para inibir significativamente o crescimento de células BGC-823 de uma maneira dose e dependente do tempo. Células BGC-823 foram significativamente inibidas por tetrandrina em 10 ug /ml (

P

0,05). O IC

50 valor foi 6,104 ± 0,786, 4,471 ± 0,650 e 3,744 ± 0,573 seguinte 24, 48 e 72 h de tratamento tetrandrina, respectivamente. Assim, 6, 8 e 10 ug /ml foram determinadas como as concentrações representativos nos seguintes estudos.

(A) A estrutura química do tetrandrina. proliferação (B) de células foi determinado por um ensaio de MTT, e células BGC-823 foram tratadas com várias concentrações de tetrandrina em 24, 48 e 72 h, respectivamente. A taxa de inibição do grupo de controlo foi definido como 0. Os dados são expressos como médias ± DP de três experiências independentes realizadas em triplicado. *

P Art 0,05; **

P Art 0,01; ***

P Art 0,001 versus o grupo controle, respectivamente.

A indução de apoptose por tetrandrina

habilidades anti-câncer tetrandrina mediadas foram relatados para ser associados com apoptose [9-12]. Em conformidade, investigou-se a capacidade de apoptose induzida por tetrandrina de células BGC-823 usando um ensaio de citometria de fluxo. Tal como medido por citometria de fluxo, os efeitos de tetrandrina na apoptose de células BGC-823 são mostrados na Figura 2A e B, com os tratamentos tetrandrina 24 h a 0, 6, 8, e 10 ug /ml, resultando em 4,35%, 11,4% , 17,72% e 32,34% de células apoptóticas, respectivamente, e tetrandrina (8 ug /ml) durante 0, 12, 24, e 48 h, resultando em 3,4%, 6,64%, 19,15% e 25,85% de células apoptóticas, respectivamente (Figura 2C e D). Estes dados indicam claramente que tetrandrina apoptose induzida em células BGC-823 de uma maneira dose e dependente do tempo. Os números de células apoptóticas aumento juntamente com a concentração tetrandrina e tempo de tratamento.

Um ensaio de ligação PI-anexina V-FITC foi utilizada para detectar apoptose de células BGC-823. (A) células tratadas com tetrandrina durante 24 h a 0, 6, 8, e 10 ug /ml. (C) As células tratadas com 8 ug /ml tetrandrina para 0, 12, 24, e 48 h. (B, D) As colunas representam as médias ± DP de células apoptóticas obtidos a partir de três experiências independentes. **

P Art 0,01; ***

P Art 0,001 versus o grupo de controlo.

expressão tetrandrina mediada por membros da família Bcl-2

Para investigar o mecanismo mais específico sobre a indução de apoptose em células BGC-823 por tetrandrina, foi detectada a expressão de proteínas relacionadas com a apoptose por transferência de Western e o seu nível de ARNm por em tempo real (RT) -PCR. Aqui, estudou-se a expressão da Bax, Bad, Bak, Bcl-2 e Bcl-XL em BGC-823 células tratadas com tetrandrina. Após 24 h de exposição a tetrandrina, Bax, e a expressão de Bak a proteína Bad foi dependente da dose aumentou, enquanto a Bcl-2 e Bcl-XL expressão da proteína foi dependente da dose, diminuiu (Figura 3A). Nós também descobrimos que tetrandrina pode regular positivamente a expressão do Bax e regular negativamente a expressão de Bcl-2 de um modo dependente do tempo (Figura 3B). Para determinar se tetrandrina iria afectar a transcrição do gene de Bcl-2, Bcl-XL, e Bax, a sua expressão de mRNA foi analisada por RT-PCR (Figura 3C). Os resultados de RT-PCR claramente coincidiram com aqueles apresentados na Figura 3A.

(A) análise de transferência de Western da expressão das proteínas relacionadas com a apoptose em células BGC-823 tratadas com 6, 8, e 10 ug /ml tetrandrina durante 24 h. (B) Análise de transferência de Western de Bcl-2 e Bax tratada com 8 ug /ml durante 12 tetrandrina, 24, 48, e 72 h. (C) Efeitos de tetrandrina sobre os níveis de expressão de Bcl-2, Bcl-XL, e Bax foram determinados utilizando PCR em tempo real (1), o controlo (2) 6 ug /ml (3) 8 ug /ml (4) 10 ug /ml. expressão de p-actina foi utilizado como um controlo interno. Os dados são apresentados como médias ± SD de pelo menos três experiências. *

P Art 0,05; **

P Art 0,01; ***

P Art 0,001 versus o grupo de controlo.

apoptose induzida por tetrandrina através de uma via mitocondrial em células BGC-823

Para explorar se a apoptose induzida por tetrandrina foi associada com a ativação de membros caspase, medida que a expressão das caspases em BGC-823 células tratadas com várias concentrações de tetrandrina por Western blotting. Os resultados mostraram uma elevação dependente da dose da caspase-3 e caspase-9 em tetrandrine- células tratadas (Figura 4A). No entanto, os níveis não detectáveis ​​de caspase-3 clivada e caspase-9 foram encontrados nas células na ausência de tratamento tetrandrina (dados não mostrados). Para determinar o papel da activação da caspase em apoptose induzida por tetrandrina, células BGC-823 foram pré-tratados com o pan-caspase inibidor z-VAD-fmk (10 pM), durante 4 h, e depois tratou-se com 8 ug /ml tetrandrina para 24 h. Em comparação com o controlo, as actividades relativas de caspase-3 foram aumentados em BGC-823 células tratadas com tetrandrina única (Figura 4B). Além disso, a libertação do citocromo

C

foi aumentada de uma forma dependente da dose por tetrandrina. Um fluxo representativo citometria resultado mostrou que as células pré-tratadas com z-VAD-FMK reduz fortemente a apoptose induzida por tetrandrina e que apenas um pequeno número de células apoptóticas foi detectado (Figura 4C). Em seguida, examinou-se o nível de expressão citoplasmática do citocromo

C

, que é libertado a partir da mitocondria para o citoplasma durante a apoptose, agido sobre protease apoptótica factor de activação-1 (Apaf-1), aumentando a ligação de Apaf- 1 a ATP /dATP, e induzida por activação 9-dependente de caspase da caspase-3 [20-22]. Verificou-se que tetrandrina aumentou significativamente a expressão do citocromo citoplasmática

C

e Apaf-1 em BGC-823 células de uma forma dependente da dose (Figura 4D). Juntos, estes resultados sugerem que uma via cascata das caspases mediada por mitocôndrias estava envolvida na apoptose induzida por tetrandrina.

(A) análise de transferência de Western da expressão da pro-caspase-3, caspase-3 clivada, e clivado caspase 9 em BGC-823 células tratadas com tetrandrina aos 6, 8, e 10 ug /ml durante 24 h. (B) As células foram pré-tratadas com ou sem pan-caspase inibidor z-VAD-fmk (10 pM) durante 4 h seguida por tratamento com tetrandrina a 8 ug /ml durante 24 h, e a actividade relativa da caspase-3 foi medido utilizando um ensaio de actividade da caspase-3. (C) Células BGC-823 foram pré-tratadas com ou sem Z-VAD-fmk (10 pM) durante 4 h seguida por tratamento com tetrandrina a 8 ug /ml durante 24 h. Um ensaio de ligação PI-anexina V-FITC foi utilizada para detectar apoptose de células BGC-823. (D) Análise Western blot da expressão do citocromo citoplasmática

C 10 ug /ml durante 24 horas e

Apaf-1 em BGC-823 células tratadas com tetrandrina aos 6, 8, e. expressão de p-actina foi utilizado como um controlo interno. Os dados são apresentados como médias ± SD de pelo menos três experiências. *

P Art 0,05; **

P Art 0,01; ***

P Art 0,001 versus o grupo de controlo.

O efeito anti-tumoral de tetrandrina na BGC-823 xenotransplantes nus rato

Desde tetrandrina foi encontrado para inibir significativamente o crescimento de células BGC-823

in vitro

, avaliamos ainda mais o efeito anti-tumoral de tetrandrina

in vivo

com modelos de xenotransplante estabelecidos. Como mostrado na Figura 5A, tetrandrina pode inibir eficazmente o crescimento do tumor após um tratamento de 24 dias. No final de 24 dias, a média dos volumes tumorais foram 493.06 mm

3 e 1243.00 mm

3 no grupo de dose elevada e grupo de dose baixa, respectivamente, correspondendo a 80,52% e a taxa de inibição de 50,9% em comparação com o controle grupo. Além disso, o peso do tumor foi reduzida como um resultado do tratamento com tetrandrina em ambas as concentrações (Figura 5B Tabela 2). Este resultado mostrou que uma dose elevada de tetrandrina teve um efeito antitumoral mais forte do que uma dose baixa no modelo de xenoenxerto BGC-823.

células BGC-823 foram inoculadas subcutaneamente em ratinhos Balb /c nu para estabelecer o modelo de xenotransplante. (A) O crescimento do tumor foi monitorizado nos pontos de tempo indicados, e o volume do tumor foi medido a cada 3 dias. O dia de início do tratamento com fármaco foi definido como o dia 0. Os dados representam médias ± DP do volume relativo do tumor para cada grupo. peso (B) do tumor foi medido no final da experiência. Os dados representam médias ± DP do peso do tumor para cada grupo. ***

P Art 0,001 versus o grupo de controlo.

Group (n = 5)

volume tumoral (mm

3)

Inibitória Taxa (%)

peso do tumor (g)

Inibitória taxa (%)

control2531.78 ± 153.251.194 ± 0.10Tet (40 mg /kg) 1243.00 ± 55,19

*** 50.900.641 ± 0,06

*** 46.31Tet (120 mg /kg ) 493,06 ± 145,63

*** 80.520.298 ± 0,09

*** 75.04Table 2. Inibição da tetrandrina (Tet) no crescimento do tumor de ratos nus.

***

P Art 0,001

contra

o grupo controle. CSV Baixar CSV

apoptose induzida por tetrandrina no BGC-823 xenotransplantes

A análise imuno-histoquímica de tecidos tumorais excisados ​​de ratinhos nus xenoenxerto BGC-823 voltou a confirmar que a apoptose tinha ocorrido em tumores tratados com tetrandrina e que a via mitocondrial jogado um papel significativo durante a apoptose. Havia cinco ratinhos nus em cada grupo. Observou-se que a expressão de Bcl-2 e Bcl-XL foi diminuída, enquanto que os níveis de proteína de Bax, activado da caspase-3 e caspase-9, activada foram significativamente melhoradas por tetrandrina (Figura 6). Todos esses achados corroboram fortemente que tetrandrina pode induzir a apoptose, consistente com o

in vitro

estudo

coloração imuno-histoquímica de proteínas relacionadas à apoptose:. Bcl-2, Bcl-xl, Bax, caspase Activated -3, e Activado Capase-9. Ampliação é de 200 ×. microfotografias representativas dos três grupos são mostrados. DAB manchado células imunorreativas (marrom escuro).

Discussão

O câncer gástrico, a quarta neoplasia mais comumente diagnosticado por trás do cancro do pulmão, mama, cólon e reto, faz com que quase um milhão de mortes anuais e tem sido a segunda causa de mortalidade relacionada ao câncer em todo o mundo [23-26]. Cirurgia, quimioradioterapia, e terapia alvo molecular têm sido as principais estratégias de tratamento no tratamento de câncer gástrico [27]. Embora a ressecção cirúrgica tem sido o tratamento curativo mais eficaz, os resultados são inconsistentes e limitadas pela recorrência do tumor e chemoresistance. fármacos quimioterapêuticos convencionais, tais como Ptx, 5-fluorouracilo, cisplatina e células tumorais matam induzir apoptose e autofagia; mas as células tumorais podem tornar-se resistentes à apoptose induzida por drogas [17,28,29].

É relatado que tetrandrina tem actividade anti-tumoral forte ambos

in vitro

e

In

vivo em muitas células de cancro, tais como células de carcinoma de pulmão humano A549, células de cancro de bexiga, células de cancro do cólon, células de hepatoma, e assim por diante [9-12]. Um estudo anterior indicou que tetrandrina pode desempenhar um papel promissor por interacção sinérgica com os agentes quimioterapêuticos, eventualmente, por os seus efeitos sinérgicos em induzir a apoptose e regular negativamente genes associados a agentes quimioterapêuticos em células MKN-28 BGC-823 e as células [18]. No entanto, o mecanismo de tetrandrina em câncer gástrico células BGC-823 humanos não foi identificado. Neste estudo, demonstramos que tetrandrina exibiu potente actividade antitumoral em direção câncer gástrico humano

in vitro

e

in vivo

, elucidar os mecanismos subjacentes de ação.

Em primeiro lugar, a nossa tetrandrina resultados mostraram que inibiu eficazmente a proliferação de células BGC-823 ensaiada por MTT de uma maneira dose e dependente do tempo. Enquanto isso, o IC

50s de tetrandrina eram aproximadamente 6,1, 4,5, e 3,7 ug /ml em BGC823 células durante 24, 48, e 72 h, respectivamente. De acordo com estudos prévios, as drogas quimioterapêuticos matar tumores sólidos, principalmente por indução de apoptose [30-32]. Descobrimos que a apoptose foi induzida por tetrandrina de uma forma dependente da concentração através de análise de citometria de fluxo com o aumento das células apoptóticas precoces e células apoptóticas tardias em células de cancro gástrico BGC-823.

Em células de mamíferos, a apoptose pode ser desencadeada pela a via extrínseca activada pelo receptor de morte e a via intrínseca regulada por Bcl-2 membros da família e cascatas de caspase na mitocôndria [33,34]. No nosso estudo, tetrandrina aumentou a expressão das proteínas pró-apoptóticas Bax, Bad, e Bak e diminuiu os níveis de proteína de Bcl-2 e Bcl-XL. Por conseguinte, um aumento da relação de expressão anti-apoptóticas e pro-proteína, tal como a razão de Bax /Bcl-2, levaria à perda de potencial de membrana mitocondrial. mitocôndrias disfunções libera citocromo

C

, que se acumula no citoplasma e forma um complexo com Apaf-1. Na via intrínseca, como um efector, caspase-3 clivada por activação da caspase-9 [35-37]. No presente estudo, mostrou que a caspase-9 e caspase-3 foram activadas por tetrandrina. O inibidor da pan-caspase z-VAD-fmk reduziu a apoptose em células BGC-823, indicando que a via mitocondrial desempenha um papel central na apoptose induzida por tetrandrina.

É relatado que tetrandrina poderia reverter a resistência a muitas medicamentos de quimioterapia, tais como Ptx e doxorrubicina na KBv200 e K562 modelos de rato de xenotransplante nus [38,39]. Tetrandrina também possui uma forte capacidade para inibir a angiogénese em gliomas em ratos [40]. Além disso, os nossos resultados indicaram que tetrandrina exibiu actividade anti-tumoral forte através da inibição do crescimento do tumor e induzir a apoptose no modelo de ratinho nu de xenoenxerto BGC-823 estabelecida.

Em conclusão, os nossos dados demonstram que tetrandrina induziu significativamente a apoptose em humanos câncer gástrico BGC-823 células e os seus modelos de xenotransplante de rato nu. apoptose induzida por tetrandrina foi associada com a activação da via intrínseca da apoptose. Com base nestes resultados, tetrandrina poderia ter um grande potencial no tratamento do cancro gástrico humano no futuro.

Reconhecimentos

Gostaríamos de agradecer aos membros do Departamento de Clínica da Universidade de Jiangsu Medicina por sua assistência técnica.