Abstract

A superexpressão de TOP2A está associada com risco de progressão sistêmica em pacientes com câncer de próstata, e níveis mais elevados de TOP2A foram encontrados em hormona casos resistentes ao. Para elucidar o mecanismo pelo qual os níveis elevados de TOP2A contribuem para a progressão do tumor que sobre-expressam gerado TOP2A linhas celulares de cancro da próstata. Mostramos que TOP2A promove a agressividade do tumor, induzindo rearranjos de genes que contribuem para um fenótipo mais invasiva. O tratamento anti-andrógeno sozinho foi ineficaz para matar as células que sobre-expressam TOP2A, devido à activação de uma rede de receptor de androgénio. venenos TOP2A mataram células de tumor mais eficazmente no início do curso de progressão, enquanto que em fases posteriores, eles proporcionaram maior benefício quando combinada com terapia anti-androgénio. Mecanisticamente, descobrimos que TOP2A aumenta a sinalização de androgénio, facilitando a transcrição de genes que respondem a androgénios, promovendo assim o crescimento de células tumorais. Estes estudos revelaram uma relação entre TOP2A e via de sinalização do receptor de andrógeno que contribui para a progressão do câncer de próstata e confere sensibilidade aos tratamentos

Citation:. Schaefer-Klein JL, Murphy SJ, Johnson SH, Vasmatzis G, Kovtun IV (2015 ) Topoisomerase 2 Alpha Coopera com receptor de andrógeno para contribuir para o cancro da próstata progressão. PLoS ONE 10 (11): e0142327. doi: 10.1371 /journal.pone.0142327

editor: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, ITALY

Recebido: 10 de junho de 2015; Aceito: 19 de outubro de 2015; Publicação: 11 de novembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Schaefer-Klein et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa Waterman de biomarcador descoberta e o Centro de Medicina Individualizada na Mayo Clinic. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

DNA topoisomerase 2 alfa (TOP2A) é uma enzima nuclear essencial, necessário para a resolução de estresse topológico associado com a replicação do DNA. TOP2A introduz transientes quebras de fita dupla (DSB) no DNA de uma forma dependente da ATP para permitir mudanças na topologia do DNA e eliminar o excesso de enrolamento [1,2]. TOP2A função é crucial em muitos processos biológicos, incluindo a replicação, transcrição, a reparação do ADN e manutenção da estrutura do cromossoma. Ela é expressa em níveis elevados em células como o seu nível é conhecido por ser regulada através do ciclo celular dividindo, e é frequentemente usado como um marcador proliferativa [3,4]. Anormalidades de proteína TOP2A estão ligados a cromossômica instabilidade [5]. TOP2A acredita-se desempenhar um papel importante no ponto de verificação decatenation durante a mitose, um mecanismo responsável pela segregação cromossómica correcta [6-8]. Elevado nível de TOP2A como um indicador de comportamento mais agressivo e estágio avançado foi relatada por vários tipos de cancro [9,10]. Segmentação TOP2A e subsequente proliferação de células, foi utilizado como uma abordagem terapêutica para o tratamento de algumas doenças malignas rotineiramente [11]. Fármacos pertencentes à classe dos venenos TOP2A fazer-se a maior parte do aprovado para agentes de uso clínico. O etoposido e doxorrubicina alvo ambas as isoformas de enzimas TOP2, A e B, através da interferência com o seu ciclo de clivagem de ADN /ligadura, induzir DSB de ADN e morte celular gatilho [12,13]. Uma segunda classe de compostos que atuem TOP2, inibidores catalíticos TOP2, não induzem a formação de indexados à proteína DNA DSB, mas agem como inibidores não competitivos da actividade TOP2 ATPase [12]. A eficácia de venenos TOP2A acredita-se depender do nível de proteína TOP2A [5] e a sua actividade enzimática [14]

. Um certo número de estudos demonstraram que os níveis elevados de conta TOP2A para uma maior sensibilidade das células aos venenos TOP2A etoposido e doxorubicina [15,16]. Actividade da enzima TOP2A é regulada por modificações pós-traducionais [14-22]. A fosforilação de TOP2A nos resíduos dentro do domínio catalítico afecta a sua actividade enzimática [17, 21]; e mutações em alguns destes sítios foram relatados para ter em conta a resistência das células tumorais aos venenos TOP2A [14]. Embora, os níveis de proteína e a sua actividade TOP2A são considerados como importantes contribuintes para a sensibilidade das células tumorais aos venenos TOP2A, TOP2A, também tem sido demonstrado para associar à resistência à quimioterapia, tanto in

in vitro

e

In vivo

, através de mecanismos de alteração da distribuição intracelular e inibição da apoptose [23,24]. Altos níveis de proteína DLX4 foram mostrados para estimular a reparação de ADN DSB induzida pela doxorrubicina tornando a droga ineficaz [25].

A resistência aos venenos TOP2A, observados em tumores clinicamente refratários [26], e desenvolvimento de cancros secundários, tais como a leucemia mielogénica, como um resultado de

de Novo

rearranjos [12,27], são os principais limitações da terapêutica anti-TOP2A. É necessária mais investigação para compreender os fatores e mecanismos subjacentes a resposta do tumor a drogas inibidoras TOP2A.

TOP2A é frequentemente sobre-expressos em câncer de próstata agressivo (PCA). Estudos anteriores mostraram uma correlação positiva entre o nível de expressão de TOP2A e pontuação de Gleason (GS) [28,29]. Os carcinomas com a mais alta expressão da TOP2A foram pouco diferenciado [28]. Níveis elevados de TOP2A também foram encontrados em hormona-resistentes PCA do GS 8-10 [29]. O nosso grupo descobriu que a superexpressão de TOP2A foi significativamente associada com maior risco de progressão sistêmica em pacientes CaP [30]. O nível de proteína TOP2A foi o mais forte preditor de resultado no contexto do

ERG

expressão [31].

TMPRSS2-ERG

fusão, o rearranjo mais comum observado em CaP afeta até 60% dos casos [32,33]. A geração mecanismo subjacente da

ERG

fusão foi examinado [34,35]. Haffner et al. demonstraram que o receptor de androgénio (AR) e TOP2B são co-recrutados a elementos reguladores dos genes que respondem a androgénios quando da transcrição e desencadear a formação de DSB de ADN. Estas pausas são acreditados para ser altamente recombinagênico e quando reparado resultado na produção de

de genes de fusão Novo

, tais como

TMPRSS2-ERG

[35]. Da mesma forma, TOP2B é recrutado para outros receptores de esteróides: genes alvo receptor de estrogênio sobre estrogênio sinalização [36,37]. Embora, proteínas TOP2A e B têm funções celulares semelhantes em resolver overwinding através da introdução de ADN DSB, nenhum estudo reportou uma cooperação de TOP2A com maquinaria de transcrição de um modo análogo ao TOP2B. Apesar de uma correlação relatada entre altos níveis de TOP2A e pior prognóstico no câncer, o exato mecanismo subjacente fenótipo mais agressivo associado com TOP2A não é conhecido. venenos TOP2, tais como mitoxantrona e doxorrubicina, são ocasionalmente prescritos para tratar metastático resistente à castração CaP foram mostrados para fornecer apenas benefícios paliativos [38]. Por outro lado, a terapia de privação de andrógeno adjuvante padrão parecia ser efetiva apenas no grupo de pacientes cujos tumores expressaram alto nível de TOP2A e são positivos para

ERG

fusão [30,31]. Ainda não está claro se esses pacientes podem se beneficiar da terapia com inibidores TOP2A em um cenário adjuvante. Neste estudo, foi desenvolvido um modelo celular para examinar o papel de TOP2A em progressão tumoral e avaliar a sua contribuição para a célula sensibilidade ao hormonal e quimioterapia. Mostramos que impulsiona TOP2A CaP no sentido de um fenótipo mais invasiva através da indução de rearranjos do DNA. Nós também fornecemos evidências para o mecanismo de sensibilidade relacionada ao tempo de células tumorais da próstata a venenos TOP2A. Nós demonstramos que mais células de tumor de próstata avançada, resistentes a ablação de androgénios, pode ser mais eficazmente eliminado por uma terapia de combinação com o anti-androgénio e doxorrubicina. TOP2A interfere com a terapia anti-andrógeno aumentando a sensibilidade à sinalização AR, facilitando a sua actividade de transcrição para os elementos que respondem a androgénios.

Resultados

Geração de linhas de células de câncer de próstata com superexpressão TOP2A

Nossa hipótese é que altos níveis de TOP2A, além daqueles normalmente presente nas células de ciclismo, causar a geração persistente de DNA DSB que, posteriormente, levar a rearranjos genômicos associados com a formação de um fenótipo mais agressivo (S1A Fig). Para investigar a contribuição de TOP2A à carcinogênese de próstata e explorar vantagens da segmentação terapêutica desta proteína para pacientes CaP nos propusemos a desenvolver linhas de células CaP sobre-expressam de forma estável TOP2A. Embora TOP2A é altamente expressa em células cancerosas

in vivo

, tenta expressar ectopicamente esta proteína

in vitro

têm sido infrutíferos por causa da indução concomitante de apoptose [39].

In vivo

, durante a progressão do câncer, as células desenvolveram mecanismos para contornar a morte celular programada associado com alto nível de TOP2A. Por exemplo, a proteína CKS2, elevada em APC, em modelos animais e linhas de células APC, foi mostrado para proteger as células da apoptose [40]. Assim, para ultrapassar a apoptose induzida por níveis elevados de TOP2A, primeiro gerados clones de CaP LNCaP estáveis ​​que sobreexpressam CKS2 (S1B FIG), e os clones com o nível reduzido de caspase-3 (S1C figura), um grande da caspase efectora na via apoptótica [41] . Expressão de caspase-3 foi relatado perdido ou reduzido em ACP [42]. As formas cataliticamente inactivo de caspase-3, quando transfectado para as células, foram mostradas especificamente para inibir a morte celular desencadeada pela resposta a danos do ADN [43]. Tentativas de contornar a apoptose induzida por TOP2A pela superexpressão CKS2 não conseguiu resgatar qualquer TOP2A superexpressão linhas celulares. Três clones com nível reduzido de caspase-3 foram seleccionados na integração do ADNc TOP2A e usado em experiências subsequentes. clone T14 mostrou o mais alto nível de proteína TOP2A e foi usado como TOP2A alta expressor, enquanto T25 e T33 teve um nível endógeno do TOP2A e foram usados ​​como controles negativos (S1D Fig).

Níveis mais altos de TOP2A aumentar a capacidade de invasão das células tumorais

para recapitular mudanças que ocorrem

in vivo

mediante a progressão APC, nós clones continuamente cultivadas para investigar como nível de TOP2A afetados funções celulares. Os clones foram colhidas em diferentes passagens e analisados. Como expressão de TOP2A se sabe correlacionar-se com a proliferação [4] Em primeiro lugar, examinou taxas de proliferação. Não houve diferença significativa nas taxas de proliferação entre o TOP2A maior clone expressor (T14) e clones expressor inferiores (T33 e T25) (Fig 1A). índice de proliferação celular não se alterou significativamente com o aumento da passagem de ambos os clones, sugerindo que níveis elevados de TOP2A não afectar o crescimento tumoral

per se

em cultura. Níveis mais altos de TOP2A, no entanto, afetar a motilidade e invasão de clones LNCaP. células LNCaP parentais, TOP2A expressadores altos e baixos de passagens precoces e tardias foram comparadas em ensaios de câmara de Boyden. Ambos cedo (p23) e (P46) passagens tardias da superexpressão clone T14 TOP2A demonstraram maior movimento através da membrana do que seus clones controle pareados ou células LNCaP parentais (Fig 1B). Do mesmo modo, as células com elevado nível de TOP2A demonstrou propriedades mais invasiva do que os seus homólogos com nível endógeno da proteína. A morfologia das células que migraram através da membrana revestida diferia entre os clones T14 e T33. As células T14 com superexpressão TOP2A foram se espalhando com formas pontiagudas irregulares e processos mais longos que se assemelham fenótipo mesenquimal, enquanto que, as células T33 apareceu mais plana e redonda, com os processos curtos (Fig 1C).

A) Proliferação de clones com superexpressão de forma estável TOP2A (T14) e as células controle pareados com nível endógena de TOP2A (T25 e T33). A proliferação foi determinada às 96 horas após o plaqueamento de células. B) A motilidade dos clones TOP2A de diferentes passagem e células LNCaP parentais determinada usando ensaio de câmara de Boyden. C) As imagens das células com o fenótipo invasivo após 72 horas de proliferação. P designa número de passagens; OD, au é medida a densidade óptica em unidades arbitrárias. Os dados são apresentados como média ± DP, com base em 3 experiências independentes. * P 0,00001, e ** p 0,0001, n = 3.

sensibilidade das células com superexpressão TOP2A aos tratamentos mudanças sobre a proliferação prolongado

tumores de alto grau de próstata

in vivo

são conhecidos por desenvolver resistência a terapia de privação de andrógeno com o tempo [44]. Não existe tratamento específicos para estes pacientes. Nós, portanto, investigou como sensibilidade dos clones com superexpressão TOP2A gerados para anti-andrógenos, venenos TOP2A e combinação de duas drogas mudou com o tempo. No início passagens células T14-expressor elevado TOP2A eram muito mais sensível à doxorubicina do que os seus contrapartes células T25 (Fig 2A). A diferença desapareceu em passagens superiores como células foram propagadas em cultura, com as células T14 a tornar-se mais resistentes ao tratamento anti-TOP2A (Fig 2B). tendência similar foi observada para os tratamentos com Casodex anti-androgénio (Fig 2A e 2B, os painéis inferiores). Houve uma diferença significativa consistente na sensibilidade à Casodex entre T14 e T25 clones de passagens iniciais. Embora pequeno (aproximadamente 10-15%) nas doses seleccionadas, esta diferença não foi observado nas passagens superiores, semelhantes a padrão de sensibilidade demonstrada para a doxorrubicina (Fig 2B, painel superior). As diferenças nas respostas não foram relacionadas com as alterações no nível de proteína TOP2A como estas células após a propagação em cultura mantida níveis mais elevados de TOP2A (Fig 2C). Assim, estes dados mostram que as células que sobre-expressam de primeiras passagens TOP2A são mais sensíveis aos tratamentos, ambas as drogas anti-TOP2A e anti-androgénios. Um estudo recente identificou que DLX4, frequentemente sobre-expressa em cancros da mama e do ovário, estimula a reparação de DSB de ADN induzida por venenos TOP2A, diminuindo assim a sensibilidade das células ao tratamento [25]. Por isso, o nível de comparação de DLX4 em células epiteliais da próstata normais e células tumorais de cancros diferentes GS (S2 FIG). A análise da expressão microarray [30] mostrou que não há indução de DLX4 em APC, indicando assim que DLX4 não será um fator que contribui para a resistência a venenos TOP2A em CaP.

A) Survival of clones TOP2A de passagem precoce em resposta ao tratamento com doxorrubicina (painel superior) e Casodex (painel inferior). B) A sobrevivência dos clones TOP2A de final de passagem em resposta ao tratamento com doxorrubicina (painel superior) e Casodex (painel inferior). C) Western blot mostrando níveis de TOP2A em clones estáveis ​​gerados de passagens precoces e tardias. Detecção de TBP proteína nuclear foi usado para verificar o carregamento igual. D) Quantificação da expressão TOP2A baseado em transferência de Western em C. Os dados são apresentados como média ± DP, com base em 3 experiências independentes. Os valores de P são como indicado, n.s. não é significativo.

Estamos próximos testaram se a morte celular seria mais eficiente se foi aplicada uma combinação das duas drogas. No primeiro conjunto, o tratamento com uma dose constante de doxorrubicina e concentrações crescentes de Casodex mostrou nenhuma vantagem em matar células com elevado nível de TOP2A, em comparação com o controlo endógena (Figura 3A e 3B, painéis superiores). Na verdade, clone passagem T14 cedo mostraram mais resistência a este regimento comparação com T25 (Fig 3A, painel superior). Em contraste, o tratamento com uma dose constante de 50 uM de Casodex, cuja aplicação isoladamente resultou na sobrevivência de células de 90% (Figura 2), demonstrou morte mais eficiente das células de passagem final sobre-expressam TOP2A em comparação com a passagem precoce e baixo clone de expressão de controlo T33 ( Figura 3B, painel inferior). Em conjunto, esses resultados sugerem que a AR tratamento combinado segmentação e TOP2A em TOP2A células altamente expressam pode ser benéfico para tumores avançados

A) Survival of clones TOP2A de passagem precoce em resposta a tratamento de combinação:. Topo da dose em painel constante de doxorrubicina e concentrações crescentes de Casodex; dose de painel constante inferior da Casodex e concentrações crescentes de doxorrubicina. B) A sobrevivência dos clones TOP2A de final de passagem em resposta a tratamento de combinação, as drogas e as concentrações são tão em um. Os dados são apresentados como média ± DP, com base em 3 experiências independentes. Os valores de P são como indicado, n.s. não é significativo.

Para obter insights sobre possível interação entre ações TOP2A e rede de sinalização de andrógeno nós níveis próxima comparação de AR em clones com superexpressão TOP2A aos de clones com nível endógena de TOP2A. As células foram cultivadas em meios com contendo nível não-descascada base de soro de androgénios sem suplementação adicional. Os níveis totais de proteína AR foram comparados entre T14 e T25 clones de passagens precoces e tardias (Fig 4A). células T14 de ambas as passagens mostraram níveis significativamente mais elevados de AR do que as células T25 de controlo correspondente (elevado 3 e 8 vezes, respectivamente), sugerindo um envolvimento das TOP2A na indução da expressão de AR ao nível da transcrição. Os níveis de proteína TOP2A permaneceram mais elevados em células T14 em cada passagem tomados em experiência (Figura 2C, S3C e Fig S3E). Para assegurar que a proteína estava funcional TOP2A, foi realizado o ensaio utilizando molde de ADN específica TOP2A. A actividade enzimática medida no extracto de proteína obtida a partir de células T14 foi superior à de células T25 (S3 FIG). Quando ajustado para a quantidade de proteína total, que foi 6 vezes maior (Fig S3B), consistente com os níveis mais elevados de TOP2A em comparação com células T14 T25. atividade enzimática total permaneceu elevada, consistente com os níveis mais elevados de proteína TOP2A, em passagens posteriores de células T14 (S3D FIG), confirmando que TOP2A permaneceu funcional, e não houve mutações no sítio ativo instaurado no propagação deste clone.

Western blot mostrando o nível total de AR em clones TOP2A de diferentes passagens (como indicado), painel superior. Quantificação de expressão AR normalizada para nível actina beta, painel inferior. B) Western blot mostrando a indução do nível de AR (superior) mediante tratamento de TOP2A clones.with 5 nM de R1881. Correspondente quantificação dos níveis de TOP2A normalizados ao controle TBP carregamento é mostrado (parte inferior); NT é não-tratadas, T é tratado; passagens de células são como indicado. C) Área promotor exibição Esquema de

KLK3

PSA) gene (usado no ensaio CHIP. DtFw e DtRv retratam posições dos iniciadores directos e inversos, respectivamente, para a região do promotor distal; -positions PxFw e PxRv para a frente e iniciadores de promotor proximal reversa. D) A análise dos clones CHIP TOP2A estimuladas com 5 nM de R1881 durante 3 horas. Enriquecimento de AR e TOP2A em regiões do promotor proximal e distai do gene da KLK3 (painéis superior e meio) e a sua ausência na região do gene GAPDH (painel inferior) de codificação são mostrados. M é ADN marcador de tamanho, HG-se ADN genómico humano usado como um controlo positivo para a amplificação por PCR, EL1 e EL2 são fracções de eluição consecutivos (buffers são descritos nos Métodos).

TOP2A é modular a sinalização AR

foram observados níveis mais elevados de AR em células com superexpressão TOP2A (Fig 4A). Para elucidar o mecanismo pelo qual TOP2A pode contribuir para a regulação da transcrição, que trataram células com androgénio sintético R1881 e níveis nucleares comparação de AR. AR transloca para o núcleo após ligação a regular a transcrição de genes responsivos ligando [45]. Observou-se significativamente mais elevado nível de AR nuclear em resposta à estimulação de androgénio em células que sobre-expressam TOP2A T14 de início (p.24) passagem em comparação com células T25 (Fig 4B). O nível de AR nuclear nestas células aumentou 5 vezes após o tratamento. passagem tardia (p.55) células com superexpressão TOP2A mostrou um nível ligeiramente elevado de AR, não tão dramática como seus precursores na passagem 24. AR ativado reconhece e se liga a palíndromo elemento de resposta andrógeno (ARE) sequências nos genes proximais para induzir a sua transcrição [45,46]. Os nossos dados sugerem que TOP2A actua com AR para activar a transcrição de genes responsivos. Para testar esta formalmente foi realizada imunoprecipi tacão utilizando um cromatina região correspondente ao proximal e distal, são no promotor de antigénio específico da próstata (PSA) (gene KLK3, Fig 4C), um alvo de transcrição bem caracterizados de ar [46]. Os anticorpos, a TOP2A e AR, foram capazes de capturar fragmentos de ADN que contêm são pelo promotor KLK3 após o tratamento com R1881 (Figura 4D). Não houve diferença na ligação de TOP2A ou AR a Ares entre clones T14 e T25. A ligação foi específica como não recrutamento de qualquer TOP2A ou AR a sequência não relacionada foi observada (região de codificação do gene de GAPDH foi usada como um controlo. Este resultado indica que, como faz o seu TOP2B homólogo, TOP2A é recrutado para elementos reguladores esteróides para estimular a transcrição e sugere ações sinérgicas com sinalização de andrógeno em células de tumor da próstata.

TOP2A promove a produção de rearranjos de DNA em células CaP

grandes rearranjos cromossômicos são frequentemente observados em CaP [47,48] e são acreditados para jogar um papel na iniciação e progressão do tumor. Mostramos aqui que de um modo semelhante ao TOP2B, TOP2A é recrutado a Ares de estimular a transcrição. se reiteração do presente processo resulta em acumulação progressiva de rearranjos de DNA não foi investigada. para testar isto, par companheiro sequenciamento ponto de interrupção foi realizada [49,50] em diferentes passagens de clones de alta e baixa expressar TOP2A. células LNCaP parentais abrigar uma série de alterações genômicas que incluem translocações, e copiar as mudanças numéricas (S4A FIG). As células seleccionadas após a integração de vectores portadores siRNA para caspase-3 e ADNc para TOP2A mostraram significativamente maior número de alterações cromossómicas (S4B FIG). Isto não é surpreendente uma vez que as manipulações provável levou a selecção de células com capacidade reduzida para sofrer apoptose. clones T25 expressando nível endógena de TOP2A não mostrou alteração no número de rearranjos genômicos com proliferação (Fig 5A e 6A). O número total de alterações em células T25 de diferentes passagens era a mesma que em células precursoras que albergam reduzido nível de caspase-3 (Fig 6A). Em contraste, as células que sobre-expressam T14 TOP2A demonstraram acumulação progressiva de rearranjos com o aumento da passagem (figuras 5B e 6B). O gene TOP2A em si também foi afetado em T14 da passagem tardia (Tabela 1). No entanto, a interrupção de um alelo não resultou em diminuição significativa da expressão da proteína, sugerindo que a cópia integrada exógeno do gene foi principalmente dirigir a expressão

A) passagem tardia do clone T25 expressando nível endógeno de TOP2A. . B) atraso da passagem T14 clone superexpressão TOP2A. pontos cinzentos (contagem) mostram frequência de distribuição de leituras nas janelas 30KB e pontos de interrupção para todos os cromossomos (os números são indicados). O eixo X abrange o comprimento do cromossoma, o eixo Y mostra o número de leituras para cada janela. contagens de janela são mostrados de acordo com a previsão pelo algoritmo CNV. pontos cinzentos são normais, pontos vermelhos correspondem a deleções e pontos azuis mostram ganhos. As linhas ligam pontos de interrupção bioinformatically identificados. As larguras das linhas correlacionar com o número de companheiro-associado par lê. Cor das linhas de ligação indica a polaridade do cromossoma unidas. Para eventos intra-cromossômica mostra vermelho direção de avanço para ambas as partes, verde indica inversão por um parceiro e azul mostra inversão para ambos. Para eventos inter-cromossómicas, vermelho conecta a parte do lado P da maior cromossoma para a peça do lado do Q do cromossoma menor na direcção para a frente, verde liga a peça do lado do Q do cromossoma maior para a peça do lado P da menor do cromossoma em direcção para a frente, azul conecta a parte do lado P da maior cromossoma para a peça do lado P do cromossoma menor na direcção inversa e magenta liga a peça do lado do Q do cromossoma maior para a peça do lado do Q do menor cromossomo em sentido inverso. Preto indica translocações equilibradas. setas azuis apontam para rearranjos de DNA selecionados que foram adquiridas com a proliferação (ausente em células correspondente da passagem anterior.

A) Número total de pontos de interrupção presentes nas células T25 de diferentes passagens. LNCaP /CASP é um derivado da linha de células LNCaP expressando estavelmente siRNA para derrubar caspase alterações 3. B) de ADN obtidas por TOP2A superexpressão células T14 sobre a proliferação. Os números representam alterações observadas para além dos presentes no clone controle T25. C) mostrando proposta esquemática papel da TOP2A na progressão do cancro da próstata e resistência à terapia de ablação do andrógeno.

Em conjunto, estes resultados indicam que alterações genômicas induzida por níveis elevados de chumbo TOP2A a aquisição de mais fenótipo agressivo e também pode contribuir para o desenvolvimento de resistência aos tratamentos agente único.

Discussão

Apesar de prostatectomia radical curas mais de GS 7-10 pacientes, o risco de progressão sistêmica e morte após a cirurgia continua a ser mais elevado do que 15%. Um subconjunto desses pacientes desenvolvem doença disseminada [44] e alguns, após melhora inicial com a terapia da privação do andrógeno, o progresso para o estado resistente à castração [51]. Apesar dos avanços no tratamento de pacientes com doença de castração resistente [52, 53], realização de sobrevivência a longo prazo continua a ser um problema. Compreensão dos mecanismos subjacentes resistência à ablação é crítica. Um dos mecanismos propostos é o desenvolvimento de um aumento da sensibilidade aos baixos níveis de androgénios após ablação devido à amplificação AR ou elevação da sua expressão [54,55]. Consistente com isto, o nosso estudo revelou que TOP2A, frequentemente sobre-expressa em casos de CaP em risco elevado de progressão, dirige a expressão de AR. Os nossos dados sugerem que a terapia de ablação do androgénio pode ser menos eficaz na presença de nível elevado da proteína TOP2A (Figura 6C). Além disso, as experiências de tratamento de apoiar a noção de que a terapia usando combinação de veneno anti-andrógeno e TOP2A fornece um benefício mais forte. Mostramos também que a segmentação TOP2A com veneno só é eficiente apenas no início, antes que as alterações de DNA orientada por TOP2A ter ocorrido (Fig 6C). De acordo com estes resultados de um estudo recente, utilizando um modelo diferente para CaP identificou TOP2A como um antígeno tumoral específico da reincidência [56]. tumores da próstata do rato quando expostos a imunoterapia subóptima evoluiu para um fenótipo drasticamente diferente, que mostra expressão elevada de TOP2A e resposta a tratamento anti-TOP2A. Nesta fase da doença residual mínima, células TOP2A-positiva apresentada como fenótipo de células-tronco e mostrou aumentada capacidade de invasão [56], uma propriedade, característica das células que sobre-expressam TOP2A no nosso modelo. Em outro estudo, utilizando modelo murino singeneicos de metástase CaP espontânea [57] autores demonstraram que altos níveis de TOP2A correlacionados com altos níveis de metiltransferase EZH2 e segmentação de ambas as proteínas em combinação resultou na morte celular eficiente.

Além e o nível de funcionalidade de TOP2A, resposta celular aos seus inibidores também foi relatada a actividade dependem de outros factores. DLX4, um gene homeobox, sobre-expressos em vários cancros [58], foi mostrado para reduzir a sensibilidade das células tumorais aos venenos TOP2A, estimulando a reparação de DSB de extremidade não-homóloga juntar [25]. Os nossos dados indicam que este não é o caso em APC, como o nível de DLX4 não aumenta com o grau do tumor, mas permanece semelhante à que, em células epiteliais normais (Fig S2).

Colectivamente, estes estudos sugerem que há uma janela de tempo no decurso da progressão CaP em que a terapia anti-TOP2A pode ser particularmente eficaz. Se TOP2A venenos /ou inibidores da imunoterapia tem de ser o tratamento de escolha em clínica ainda não foi determinada.

Finalmente, mostramos aqui que TOP2A coopera com AR para induzir a transcrição de genes alvo (Fig 6c). O próprio nível de AR é significativamente mais elevada em células que sobre-expressam TOP2A após estimulação com agonista de androgénio. Semelhante ao seu TOP2B isoforma, TOP2A é co-recrutados para SÃO com AR, e é provável que activar a transcrição. Anteriormente, TOP2B também foi mostrado para induzir o ADN DSB em regiões reguladoras dos genes alvo de estrogênio e ar [35,36]. Embora, em nosso estudo não abordou essa possibilidade diretamente, nós observamos um aumento em um número de rearranjos de DNA em células TOP2A superexpressão sobre a proliferação. Se são o resultado da reparação de DSB de ADN defeituosa que ocorrem nos elementos reguladores da transcrição ou uma consequência do excesso de função TOP2A durante a replicação continua a ser investigada. Foram identificados alguns genes rearranjados que consideramos como “dependentes TOP2A” (Tabela 1). Com base nas observações anteriores relacionados com a função destes genes, as alterações nas propriedades de células que sobre-expressam TOP2A e sua sensibilidade aos tratamentos pode ser atribuída às alterações nessas regiões de ADN. Por exemplo, Emi1 (FBOX5) (Tabela 1) afectado em células T14 da última passagem é conhecido um regulador de progressão mitótica [59,60]. Ele tem sido implicado na determinação da sensibilidade à doxorrubicina [61]. No estudo que a depleção de Emi1 levaram a um aumento da sensibilidade, de acordo com isso, os nossos dados sugerem que a duplicação observada em células T14 de passagem posterior pode contribuir para um decréscimo da sensibilidade à doxorrubicina (Fig 2B). O rompimento do gene PARD3B, mostrada para controlar junções apertadas [62], pode ser responsável por aumento na motilidade e invasão capacidade das células T14. Redução na expressão ou perda de Tango, um homólogo de Tango6, interrompido em TOP2A células superexpressão, também foi mostrado anteriormente para aumentar a migração [63]. A função de Tango6 não foi examinado ainda, se a sua perda pode ter efeito similar sobre as propriedades de células PCA ‘requer uma investigação mais aprofundada. Futuros estudos são necessários para a reflexão sobre a contribuição exata funcional de alterações genômicas adquiridos.

Materiais e Métodos

cultura celular e tratamentos

As culturas celulares foram mantidas seguindo as recomendações da ATCC. LNCaP (ATCC) e LNCaP derivados estáveis ​​foram cultivadas em meio RPMI 1640 cultura (Gibco, Life Technologies) suplementado com 100 unidades /ml de penicilina, 1 mg /ml de estreptomicina, e 10% de FBS. Para as células de experiências de tratamento de androgénio foram cultivados no mesmo meio, mas substituindo 10% de FBS com 5% de FBS filtrado com carvão (One Shot, Life Technologies) durante 48 horas antes da adição de 5 nM R1881 (metribolona, ​​RM10, TSZCHEM), e depois disso foram incubadas durante um período adicional de 48 horas. As células foram recolhidas por raspagem e a proteína foi isolado (kit de extracto nuclear, motivo Activo) para análise de mancha de Western.