Abstract

Fundo

A regulação da apoptose sob basais (não-stress) condições é crucial para o desenvolvimento dos mamíferos normal e também para a renovação celular normal em diferentes tecidos ao longo da vida. deficiente regulação da apoptose basal, ou a sua perturbação, pode resultar no desenvolvimento prejudicado e /ou estados de doença, incluindo o cancro. Em contraste com a apoptose induzida pelo estresse a regulação da apoptose em condições basais é mal compreendida. Para abordar esta questão que temos em relação a apoptose basal- e induzida por estresse em células epiteliais humanas de origens normais e cancerosos. Para isso, centrou o nosso estudo sobre os opostos JNK pró-apoptótica vias de NFkB /anti-apoptóticos.

Metodologia /Principais Achados

Combinatória RNAi mais knockout gene foram utilizados para acessar e mapear basal regulamentar vias de apoptose. Follow-on, em profundidade análises incluíram expressão exógena de mutantes de fosforilação e imunoprecipitação da cromatina. Nós demonstramos que a apoptose basal é constitutivamente suprimida pela JNK2 em uma gama de linhas celulares de cancro humano. Este efeito não foi observado em células não-cancerosas. JNK2 silenciamento por RNAi resultou em apoptose dependente de JNK1 de células cancerosas através de regulação positiva do factor de AP-1 C-junho Inesperadamente, descobrimos que JNK1 e c-Jun promovem a apoptose basal na ausência de “activação” fosfolarização tipicamente induzidas por stress. Hypo-fosforilada c-Jun acumulou a níveis elevados seguintes silenciamento JNK2, regulada automaticamente a sua própria expressão e suprimiu a expressão de Bcl-3, uma proteína IkB incomum e regulador de NFkB. apoptose basal foi mediada por componentes da via de resposta a TNFa mas foi mecanisticamente distintos da apoptose induzida por TNFa.

Conclusões /Significado

Os nossos resultados demonstram que as vias mecanisticamente distintas funcionar para regular a apoptose em células de mamífero sob basal (fisiológica) versus condições induzidas pelo estresse. Também descrevemos uma rede apoptótica romance que regula a sobrevivência de células de cancro basal. Essa informação é crucial para compreender a renovação celular normal durante o desenvolvimento dos mamíferos e, posteriormente, ao longo da vida. Esta informação também abre novos caminhos para a intervenção terapêutica em estados de doença proliferativa humana, incluindo cancro

Citation:. Ahmed SU, Milner J (2009) Cancer Cell Basal Survival envolve a supressão JNK2 de um romance JNK1 /c-Jun /Bcl -3 Rede apoptóticas. PLoS ONE 4 (10): e7305. doi: 10.1371 /journal.pone.0007305

editor: Andreas Bergmann, da Universidade do Texas MD Anderson Cancer Center, Estados Unidos da América

Recebido: 10 Agosto, 2009; Aceito: 07 de setembro de 2009; Publicação: 06 de outubro de 2009

Direitos de autor: © 2009 Ahmed, Milner. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este projecto foi apoiado por uma pesquisa do cancro de Yorkshire prêmio programa de núcleo de pesquisa para JM. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

as quinases N-terminal c-Jun (JNK) são membros da família MAP quinase (MAP quinases, MAPKs) e são ativados em resposta ao estresse celular [1], [2]. Em resposta ao estresse JNK1 e JNK2 são ativados via dupla fosforilação de T183 e Y185 por quinases MAPK (MAPKK), especificamente MKK4 e MKK7 [3], [4]. MAPKs e MAPKKs formar parte de uma transdução de sinal de super-família que inclui as quinases reguladas por sinais extracelulares (ERKs) e p38 MAPK. As funções de JNK1 e JNK2 são determinados pelo tipo celular e pela natureza do estresse responsável pela sua activação. Estudos iniciais JNK identificados pela sua capacidade para fosforilar a extremidade N-terminal de c-Jun, um membro da proteína de activação 1 (AP-1) factor de transcrição da família [5]. Subsequentemente JNK foram mostradas para fosforilar e regulam a actividade de outras proteínas AP-1, bem como proteínas adicionais envolvidos na proliferação celular e na apoptose, incluindo p53, c-myc, Bcl-2 e Bim [2], [6].

AP-1 factores são um grupo estruturalmente e funcionalmente membros relacionados da família de proteínas Jun (c-Jun, JunB e JunD) e a família de proteínas Fos (c-Fos, FosB, Fra-1 e Fra-1) [7]. Dimerização dentro destes membros da família constitui um factor de transcrição AP-1 e a abundância relativa de AP-1 subunidades individuais e a composição do dímero são factores importantes que determinam o destino celular. O repertório de AP-1 permite que a composição do dímero de Adaptação de uma resposta de AP-1 mediada por tipos de células individuais a um dado estímulo. Pós-translacional modificação e turnover de proteína são dois mecanismos para regular a AP-1 actividade. Por exemplo, em resposta ao stress o potencial de transactivação de c-Jun é activada por fosforilação N-terminal mediada por JNK, [8], [9], enquanto que a estabilidade da proteína c-Jun é regulada através de GSK-3-mediada fosforilação do terminal C-que tem como alvo c-Jun para ubiquitinação e degradação através da ligase E3 Fbw7 [10].

um activador importante da via apoptótica de JNK é o factor de necrose tumoral α (TNFa), uma citoquina pró-inflamatória que regula a sobrevivência de células por meio de promover tanto a proliferação celular ou apoptose [11]. TNFa engata com o seu receptor trimérico, TNFR1, na superfície externa da membrana celular. TNFa /TNFR1 interacção resulta na formação de um complexo de proteína heterogénea intracelular (complexo 1) na cauda citoplasmática de TNFR1. Por sua vez este complexo conduz à activação de JNK e também de IkB-cinase (IKK). estudos elegantes

in vitro

e

in vivo

demonstraram que, em hepatócitos expostas a TNF, ativado JNK1 fosforila e ativa a coceira ubiquitina ligase E3 [1], [12]. COCEIRA activada induz a ubiquitinação e degradação de cFLIP (FLICE proteína inibidora celular), que inibe especificamente a activação de outra forma de pró-caspase 8 (também chamado FLICE). Caspase 8 resultados de activação de apoptose [1], [10]. Esta via pró-apoptótica é contrabalançada pela NFkB que up-regula a expressão de c-FLIP e, assim, inibe pró-caspase 8 activação e apoptose [13].

NFkB é um fator de transcrição composta por homo ou heterodímeros de membros da família rei de proteínas, incluindo p65 (RelA), RelB, c-Rel, p50 e p52 (revisto em [14]. domínios de activação da transcrição estão ausentes em p50 e p52, que, assim, é necessário para formar heterodímeros, a fim de transactivar alvejar genes. O conjunto principal é um heterodímero de p65-p50, mas composições dímero diferentes também são formadas. NFkB está sujeito à regulamentação por interações proteína-proteína com proteínas IkB. IκBα e IκBβ preferencialmente alvo heterodímeros p65-p50. a fosforilação de IkB por IkB quinases provoca a degradação de IkB com libertação de NFkB dimérica que se transloca para o núcleo, e regula a expressão de genes. Bcl-3 é um IkB incomum que preferencialmente se liga a p50-p50 e homodímeros NFkB p52-P52 [15], [16]. Bcl-3 é distinguido de outras proteínas IkB em que possa localizar para o núcleo, que não é degradado após a activação do NFkB e que possui sete, em vez de seis, domínios de repetição de anquirina. A localização nuclear da proteína Bcl-3 é compatível com a sua capacidade para formar um complexo ternário com a p50 ligada a DNA: homodímeros de p50 de NFkB, e também para ajudar a absorção de p50 para o núcleo (ver [17] e referências aí contidas). Bcl-3 foi descrita pela primeira vez na célula B leucemia linfocítica crónica [18] e é considerado como uma oncoproteína putativo

.

Além de seus papéis na resposta ao estresse JNK1 e JNK2 também funcionará sob basal, non-stress condições como evidenciado por alterações específicas de tecidos observadas na JNK1 – /- e JNK2 – /- ratos. Por exemplo, JNK1 – /- ratos exibem diminuição da diferenciação das células T e imunidade defeituosa [19]. É importante salientar JNK1 – /- ratos também desenvolver tumores intestinais espontâneos, indicando que as funções JNK1 como um supressor de tumor para este tipo de tecido [20]. No entanto, os mecanismos de JNK1 e JNK2 funcionando sob basal, condições fisiológicas são mal compreendidos.

Para investigar os papéis individuais de JNK1 e JNK2 em células epiteliais humanas em condições basais que empregou uma combinação de (i) RNAi induzido na ausência da tensão aplicada, (ii) knock-out de genes linhas celulares, e (iii) a expressão do gene exógeno. Em uma série de linhas de células humanas, descobrimos que JNK1 é activamente pró-apoptótica mas é constitutivamente inibida pela presença de JNK2 em células cancerosas. Este efeito não foi observado em células não-cancerosas. experimentos de silenciamento co revelou que estes basal, opondo funções pró e anti-apoptóticos de JNK1 e JNK2 são em grande parte independente do up-stream cinases MKK4 e MKK7. Isto foi consistente com a falta de mudança perceptível na JNK1 fosforilação apesar apoptose dependente de JNK1 seguinte esgotamento de JNK2. Experiências adicionais revelaram que o JNK1 via pró-apoptótica envolve basais de c-Jun mais componentes da via de MAP-cinase-TNFa responsivo juntamente com a via de NFkB através de c-Jun mediada por sub-regulação de Bcl-3. Assim, a regulação da base da sobrevivência de células de cancro parece ser dependente das funções opostas de JNK2 /Bcl-3 (Pro-sobrevivência) e JNK1 /c-Jun (pró-apoptótica) e estar sob controlo constitutivo por JNK2.

resultados

Selective knock-down de JNK2 aumenta a expressão JNK1

para RNAi foram empregados siRNAs sintéticos sob condições previamente demonstrado para dar eficiente knock-down de mRNAs alvo sem a ativação do p53 celular resposta ao estresse [21], [22]. controlos de ARNi incluídos BCR-ABL siARN, que não tem nenhum ARNm alvo em células epiteliais e, por conseguinte, serve como um ARNsi de controlo não-funcional, e lamina A /C siARN, que tem como alvo lamina A C ARNm /e serve como um ARNsi de controlo funcional (Métodos ). Selective knock-down de JNK1 e mRNA JNK2 foi reproduzido com dois siRNAs diferentes para cada alvo (Métodos e Fig. S1). A eficiência do mRNA knock-down foi determinada por PCR quantitativa e foi similar para ambos JNK1 e JNK2 (redução de -75%; ver Fig. 1A para os níveis de mRNA JNK1). silenciamento induzido por ARNi de lamina A /C ou de JNK1 não induziu qualquer alteração no p53 ou p21

WAF1, um gene alvo dependente de p53 (Fig. 1B para JNK1 siRNA e Fig. S2 de lamina A /C siARN) , confirmando assim que as condições de RNAi

per se

não iniciar uma resposta p53 stress. No entanto JNK2 silenciamento resultou num aumento para o dobro ~ 3 na proteína p53 (Fig. 1B), sugerindo que a JNK2 directa ou indirectamente regula o volume de proteína p53. Isto é consistente com o relatório de que JNK pode regular o volume basal de p53 [23]. Curiosamente, co-silenciamento de JNK1 com JNK2 revogou o aumento da p53 (Fig. 1B) o que implica que JNK1 e JNK2 exercer efeitos coordenados sobre o volume de negócios de p53.

níveis (A) de mRNA JNK1, e ( B) JNK1, JNK2, e também p53 e p21 níveis de proteína foi determinada 48 h após a transfecção com JNK1- e JNK2-siRNAs como indicado (Métodos). imagens (C) de contraste de fase de células HCT116 48 h após a transfecção com JNK1- e JNK2-siRNAs. (D) A apoptose determinada por anexina V marcação das células tratadas com siRNA em relação aos controlos não tratados numa gama de linhas celulares humanas (Métodos. Nota: resultados de apoptose são representativos de pelo menos três experiências repetidas, a menos que as barras de erro são incluídos para repetição analisa de um experiência única). (E) Caspase 8 e seus produtos de clivagem, activado caspase 7 e efetoras caspase 3 seguinte silenciamento RNAi mediada por JNK1 e JNK2 como indicado. controles actina = Carregando. HCT116 p53 + /+ e HCT116 p53 – /- são clones isogénicas de células de câncer colorretal HCT116 humanas (métodos)

De forma inesperada, em células de cancro colo-rectal HCT116 JNK2 knock-down consistentemente resultou em -50%. aumento nos níveis de ARNm de JNK1 e um aumento ~ 3 vezes nos níveis de proteína JNK1 (Fig. 1A e 1B). Resultados semelhantes para ARNm JNK1 foram obtidos em p53 HCT116 isogénica

+ /+ e HCT116 p53

– /- células (Fig. 1A e 1B), o que indica que o efeito é independente de p53. Assim, em células HCT116, a presença de JNK2 suprime directa ou indirectamente os níveis de expressão JNK1 basais.

JNK2 knock-down induz apoptose

knock-down de JNK2 resultou em apoptose numa variedade de cancro linhas de células, incluindo células HCT116 (Fig. 1C e 1D). A apoptose foi determinada por anexina V coloração (Métodos) e envolver pró-caspase 8 activação e caspases efetoras 3 e 7 (Fig. 1e). Este efeito apoptótico de depleção JNK2 era independente de p53 tal como evidenciado por HCT116 p53 – /- células (Fig. 1C e 1D). Em células não cancerosas JNK2 silenciamento não induziu a apoptose (células epiteliais ARPE19 e MCF10A e fibroblastos WI-38), apesar de eficaz JNK2 ARNm knock-down (Fig. 1D e dados não mostrados). Em contraste com o silenciamento JNK2, o silenciamento de JNK1 não afectou a viabilidade em qualquer uma das linhas celulares testadas (Fig. 1C e 1D). No geral, estes resultados indicam que a JNK2, mas não de JNK1, é essencial para a viabilidade da base num certo número de linhas de células de cancro humanas, incluindo células epiteliais de cancro da mama MCF7, mas é dispensável para a viabilidade basal de células não-cancerosas, incluindo células epiteliais da mama MCF10A.

a apoptose é dependente de JNK1

a seguir, JNK1 co-silenciados com JNK2, a fim de investigar a sua ligação funcional na regulação da sobrevivência da célula cancerosa. Em todos os casos em que a apoptose induzida por JNK2 silenciamento verificou-se que a co-silenciamento JNK1 com JNK2 resgatado células empobrecido-JNK2 da apoptose (Fig. 1D). Assim, podemos concluir que a JNK1 e JNK2 contrabalançar um ao outro na manutenção da viabilidade das células do cancro e que JNK2 constitutivamente suprime a apoptose mediada por JNK1 em condições basais.

apoptose dependente de JNK1 é independente da reforçada JNK1 S63 /73 fosforilação

Os resultados anteriores indicam que JNK1 é aprontado para induzir apoptose em células de cancro epiteliais humanas, mas é constitutivamente suprimida por JNK2. Ambos JNK1 e JNK2 são mediadores a jusante da via apoptótica MAP quinase e são activadas em resposta ao stress por MKK4 e /ou fosforilação no MKK7 T183 /Y185 (Introdução). A seguir, comparação JNK1 e JNK2 fosforilação sob basal (RNAi) e induzida por estresse condições (UV ou TNF).

Como a irradiação UV esperada induzida forte fosforilação em resíduos T183 /Y185 de ambos JNK1 e proteínas JNK2 em células HCT116 (Fig. 2A). Da mesma forma, o tratamento de células HCT116 com JNK1 também induziu fosforilação de TNFa e JNK2 em T183 /Y185 (Fig. 2B, painel superior). Neste último caso JNK1 fosforilação predominou sobre a fosforilação JNK2. Estes resultados demonstram claramente a fosforilação da JNK1 e JNK2 em resposta ao stress genotóxico (UV) e ao stress mediada pelo receptor (TNFa) em células HCT116. Tanto a radiação UV e de TNFa induzida por apoptose (dados não apresentados)

Comparação de JNK1 /estado de fosforilação JNK2 no controle, irradiação UV silenciados-JNK2 e seguinte (células HCT116; Métodos) (A).. p-JNK1 = fosforilado JNK1, JNK2 pJNK2 = fosforilado (seta). (B) Efeitos de TNFa no estado de fosforilação de JNK1, JNK2 e c-jun. (C)-Co silenciar c-Jun com JNK2 resgata células HCT116 da apoptose (V rotulagem anexina; Métodos). (D) JNK1, JNK2 e c-Jun níveis de proteína silenciamento de JNK2 e c-Jun 48 h pós RNAi-mediada. os níveis de proteína p53 e p21, também são mostrados. (E) Os níveis de c-Jun mRNA após JNK1 e JNK2 silenciamento. (F) Dobre aumento nos níveis de c-Jun de mRNA em células HCT116 em comparação com células ARPE19 48 h após silenciamento JNK2. (G) Knockdown de c-Jun mRNA e proteína níveis em HCT116 p53 + /+ células após o tratamento c-Jun siRNA.

Em condições basais, quando JNK1 estava ativamente pró-apoptótica seguinte silenciamento JNK2, há houve aumento perceptível na JNK1 T183 /Y185 fosforilação (Fig. 2A, comparar pista de controlo com JNK2 siRNA pista). Isto está em flagrante contraste com as condições de estresse induzido por (Fig 2A;. Comparar pista JNK2 siRNA com pista UV). Assim, podemos inferir que JNK1 é capaz de promover a apoptose na ausência de fosfolarização T183 /Y185 ” activantes que são caracteristicamente induzidos em resposta ao stress. a montante cinases MKK4 Co-silenciamento ou MKK 7 com JNK2 apenas parcialmente resgatados apoptose dependente de JNK1 (Fig. S3), fundamentar ainda mais a capacidade de promover a apoptose JNK1 na ausência de reforçada T183 /fosfolarização Y185.

Concluímos que, em condições basais, JNK1 pode promover activamente a apoptose sem sofrer reforçada T183 /Y185 fosforilação característica da resposta ao estresse celular. Esta função pró-apoptótica basal de JNK1 é evidente em células cancerosas epiteliais humanas (mas não em células não-cancerosas) e é constitutivamente inibida por JNK2 endógena. Para investigar a via apoptótica basal sob controle JNK1 nós próxima realizou uma série de experiências de co-silenciando visam identificar mediadores pró-apoptóticos essenciais relacionadas com a apoptose dependente de JNK1 seguintes silenciamento JNK2.

c-Jun é um mediador essencial da apoptose basal e está sujeita a efeitos de JNK1 e JNK2

opostas para perguntar se c-Jun é necessária para a apoptose em condições basais que co-silenciados c-Jun com JNK2 (Fig 2;. a eficiência de c-jun de ARNm knockdown é mostrado na Fig. 2G). Os resultados demonstram claramente que o co c-Jun-silenciamento resgata células HCT116 silenciados-JNK2 de apoptose, assim, a identificação de c-Jun como um mediador essencial da apoptose sujeito a supressão JNK2 em condições basais (Fig. 2C).

A c-Jun proteína acumulada para níveis elevados seguintes silenciamento JNK2 em células HCT116 (Figura 2D;. aumento de c-Jun foi também observada em células RKO e Lovo seguinte silenciamento JNK2 não mostrados) acompanhado por um aumento em c-jun de ARNm (Fig. 2E). Curiosamente, este efeito foi abolido quando JNK1 foi co-silenciados com JNK2 (Fig. 3A para a proteína c-Jun e a Fig. 2E para c-jun de ARNm) que indica que a sobre-regulação de c-Jun é dependente da presença contínua de JNK1 . JNK1 silenciamento sozinho causou um decréscimo no c-jun de ARNm e de proteína (Fig. 2E e a Fig. S4). Estas observações indicam que combinados JNK1 e JNK2 exercem efeitos opostos sobre a expressão de c-Jun e que JNK1 é necessário para manutenção dos níveis de ARNm de c-Jun e de expressão de proteínas basais, enquanto JNK2 constitutivamente suprime os níveis de c-jun de ARNm e expressão de proteína. Resultados similares foram observados em p53 HCT116

+ /+ e p53 HCT116

– /- células (ver, por exemplo Fig 2E.). Curiosamente aumento dos níveis de ARNm de c-Jun, não foram observadas em células ARPE19 silenciados-JNK2 (Fig. 2F) consistente com a falta de apoptose nestas células (Fig. 1D).

(A), proteína total de c-Jun e fosfolarização em S63, S73 e T91 seguintes quer radiação UV (faixa da direita) ou silenciamento induzido por RNAi JNK1 e JNK2. (B) esquemática ilustrando

c-Jun

e o fragmento amplificado utilizado para a detecção de c-Jun no promotor. anticorpos (C) total e formas fosforiladas de c-Jun presos junto do promotor c-Jun detectado por cromatina imunoprecipitação (chip) com c-Jun e c-Jun-specific fosfoazotados. Histograma mostra dobrá-enriquecimento em relação aos controlos de IgG (métodos).

Nossos resultados identificar os efeitos opostos de JNK1 e JNK2 sobre c-Jun. Neste aspecto, diferem a partir de observações obtidas usando uma abordagem “genética química ‘em que o bolso catalítica ATP vinculativo de JNK2 foi expandido por mutação [2]. A conclusão desta última abordagem que foi JNK1 e JNK2 tanto regular positivamente a expressão de c-junho No entanto, é possível que a expansão da bolsa de ligação ao ATP de JNK2 pode perturbar a organização molecular espacial da região β-Strand semelhante adjacente de proteína JNK2. Uma vez que este domínio β-Strand semelhante é importante para as interacções proteína-proteína JNK2 sugerimos que perturbação localizada neste local pode comprometer as características de ligação da proteína JNK2 para os seus substratos alvo. Isso pode afetar o funcionamento do JNK2 mutante de maneiras adicionais para os efeitos previstos no acesso molecular no bolso de ligação ATP expandida de JNK2

Outro estudo comparando fibroblastos de murino derivadas de JNK1 -. /- E JNK2 – /- ratos indicaram que JNK1 e JNK2 podem funcionar como reguladores de c-Jun opostas [3]. Nossos próprios resultados, em condições basais, são consistentes com esse relatório, mostram que em HCT116 células resulta (i) JNK2 silenciamento no aumento da regulação do c-Jun mRNA acompanhada acumulação acentuada de proteína c-Jun, e (ii) aumento da regulação de c-Jun nestas condições depende JNK1.

-regulação de JNK1 em células empobrecido-JNK2 é independente de c-Jun

Dado que a sobre-regulação basais de c-Jun (empobrecido em células-JNK2) requer JNK1 (ver acima) que se perguntou se c-Jun, por sua vez, é necessária para a regulação de proteína JNK1 seguinte JNK2 silenciamento (Fig. 1B). No entanto, o aumento da JNK1 consistente observada em células silenciados-JNK2 não foi afectada pela co-silenciamento de c-Jun com JNK2 (Figura 2D;. Painel superior). Isso indica que mRNA reforçada e expressão da proteína JNK1 após a depleção JNK2 é independente do c-junho

Hypo-fosforilada c-Jun liga o promotor c-Jun

induzida por estresse S63 /S73 a fosforilação de c-Jun por JNK libera quinases c-Jun de um complexo de inibidor permitindo assim a proteína c-Jun para ligar e promotores alvo transactivar [24]. fosforilação induzida pelo stress de c-Jun em células HCT116 tratados com irradiação de UV é mostrado na Fig. 3A. No entanto, embora tenhamos observado elevada acumulação de proteína c-Jun seguinte silenciamento JNK2 (Fig 3A;. JNK2 siRNA pista), este foi independente do aumento da fosforilação N-terminal no S63, S73 ou pelo S91 (Fig 3A).

JNK2 silenciamento induz um aumento acentuado nos níveis de ARNm de c-Jun (ver acima, a Fig. 2E). Para perguntar se aumentou transcritos de c-Jun eram atribuíveis, pelo menos em parte, a uma auto-regulação ciclo positivo de feed-back foi realizada imunoprecipi tacão da cromatina (ChIP) para c-Jun complexos de promotor /c-Jun (Fig. 3B e 3C) . Em células não tratadas HCT116 c-Jun foi indetectável no promotor de c-Jun (Fig. 3C, os controlos). Irradiação UV A seguir c-Jun foi fosforilada no S63 e S73 (Fig. 3A) e a proteína fosforilado foi ligado ao promotor de c-Jun, tal como indicado por análise de ChIP utilizando anticorpos anti-fosfo-T63 /73 c-Jun (Fig. 3C). Em células empobrecido-JNK2, em condições basais, nenhuma mudança em c-Jun T63 /73 fosforilação foi evidente em relação aos controlos (Fig. 3a). No entanto c-Jun nestas células foi ligado ao promotor de c-Jun (Fig. 3C). A falta de fosforilação da cromatina ligado a c-Jun foi confirmada pela falta de reactividade com anti-fosfo-T63 /73 anticorpos de c-Jun (Figura 3C;. Comparar amostras a partir de células irradiadas com UV com células silenciados-JNK2). Assim, podemos concluir que S63 /73 fosforilada-hipo c-Jun liga-se ao seu próprio promotor após a depleção JNK2 e é susceptível de contribuir para os elevados níveis de expressão de mRNA c-Jun (aumento ~ 9 vezes o controle, ver Fig. 2E) induziu sob estas condições basais.

acumulação da proteína c-Jun está correlacionada com a perda de fosforilação em S243

é possível que a proteína c-Jun é mantida em níveis baixos em células HCT116, menor do que a observada para não células -Câncer ARPE19 (dados não mostrados), através da degradação da proteína c-Jun contínua. Degradação de c-Jun envolve fosforilação do terminal C que inicia no S243 c-Jun por fosforilação mediada por GSK3 no T239. Isto gera um sítio de ligação para a ubiquitina-ligase E3 Fbw7, resultando em polyubiquitinylation e c-Jun degradação [10]. Em nosso estudo observamos que JNK1 silenciamento causou um aumento ligeiro, mas reprodutível em c-Jun S243P (ver Fig 4B-4D;. Controle pista cp JNK1 siRNA pista S243P imunotransfer�cias). Por outro lado JNK2 silenciar níveis reduzidos reproducibly causados ​​de c-Jun 243P, às vezes indetectáveis ​​apesar acumulação maciça de proteína total (Fig 4B-4D;. Controle pista cp JNK2 siRNA para imunotransfer�cias S243P). Assim, JNK1 e JNK2 exercer efeitos sobre a fosforilação de c-Jun em S243, uma alteração relacionada com a desestabilização da proteína c-Jun opostas.

(A) mostrando os sítios esquemáticas de fosforilação de c-Jun por JNK, a GSK -3 e ERK, e suas respectivas consequências funcionais. Note-se que S243P é um pré-requisito da T239 fosforilação (indicada pela seta curva). (B) Imunotransferência mostrando efeitos de JNK1, JNK2 e GSK3 silenciamento, sozinho e em combinação, sobre um painel de proteínas celulares HCT116. (C) e imuno (D) seguinte silenciamento combinatória de JNK1 e JNK2 com Fbw7 e ERK. (E) os intermediários pró-apoptóticos essenciais determinadas por co-silenciamento com JNK2. (F) apoptose após silenciamento JNK2 em condições basais é independente da Bax como evidenciado pela Bax +/- e Bax – /-. Clones isog�nicas HCT116

GSK3, ERK, Fbw7 e ITCH são mediadores essenciais da basal dependente de JNK1 apoptose

Numa outra série de experiências de co-silenciamento demonstramos que cinases da GSK3, ERK, e a ubiquitina-ligase 3 Fbw7 também são mediadores essenciais da apoptose dependente da JNK1 em células empobrecido-JNK2 (fig. 4E). No entanto nenhum destes componentes apareceu para embater fosforilação S243 ou a acumulação da proteína c-Jun (Figura 4B, 4C e 4D;. Pistas GSK3, Fbw7 e ERK, respectivamente). Isto foi inesperado uma vez que, em resposta ao stress, todos os três têm sido associadas com a degradação de c-Jun por meio de S239 e fosforilação S243 (ERK e GSK3, respectivamente) e da degradação mediada por ubiquitina (Fbw7) [10], [25], [26] . Parece que, em condições basais, a função GSK3, ERK e Fbw7 como mediadores essenciais da apoptose através de substratos diferente de C-junho

Bax e CKII são dispensáveis ​​para a via apoptótica basal JNK1 /JNK2

Seguindo o stress Bax é um mediador pró-apoptótica de apoptose induzida por JNK, [27], [28]. Para perguntar se Bax também é necessária para a JNK1 via apoptótica basal /regulado por JNK2 usamos isogênico Bax +/- e Bax – células HCT116 [2] – /. JNK2 silenciamento induzido a apoptose em ambos HCT116 Bax

+/- e HCT116 Bax

– /- células (Figura 4F.), Indicando que o Bax não é necessária para a apoptose nestas condições basais. Co-silenciamento por CKII, uma quinase putativo para a proteína c-Jun [3], também não conseguiu recuperar células HCT116 empobrecido-JNK2 da apoptose (Fig. 4E). Assim, tanto Bax e CKII parecem dispensáveis ​​para a JNK1 /JNK2 via apoptótica basal.

Interação entre c-Jun e ITCH

O caminho pró-apoptótica induzida por TNFa culmina na ativação dependente de JNK1 fosforilada de ITCH, a degradação da c-FLIP e caspase 8 activação (ver Introdução). Aqui, mostramos que a coceira é também um mediador pró-apoptótico essencial governada por JNK1 /JNK2 em condições basais e que provocam comichão co-silenciamento com JNK2 salva células da apoptose (Fig. 5A e 5B).

(A) e (B) de proteínas e níveis de apoptose observada após coçar e silenciamento JNK2 em células HCT116. (C) Complexos de proteínas ITCH-c-Jun endógenos detectados antes do silenciamento JNK2 são perdidas após a depleção JNK2.

Para investigar ainda mais o papel pró-apoptótica de ITCH em condições basais que realizamos imunoprecipitação /immunoblot análise por complexos endógenos de coceira-c-jun, antes e após o silenciamento RNAi mediada por JNK2 (Fig. 5C). Significativamente, os complexos ITCH-c-Jun eram detectáveis ​​em condições de controle, mas esses complexos foram perdidos seguinte JNK2 silenciamento (Fig. 5C).

prossegue apoptose via c-FLIP e caspase 8

Co- silenciamento caspase 8 com células JNK2 resgatados de apoptose (Fig. 4E). Este efeito foi restrito a condições basais uma vez que a caspase 8 ARNi falhadas para resgatar a apoptose após irradiação com UV (dados não mostrados). c-FLIP silenciamentos sozinho induziu apoptose em células HCT116 [29]. Co-silenciamento de c-Jun, GSK3, ou Fbw7 com c-FLIP falhou para resgatar as células de apoptose (Fig. 6A), o que indica que cada um destes intermediários pró-apoptóticos funcionar a montante de c-flip (Fig. 7A-esquemática ). Assim, as vias da cinase MAP apoptótica basais e induzidos por stress convergem para o nível de c-FLIP. Como esperado, co-silenciando caspase 8 com c-FLIP células resgatados de apoptose (Fig. 6A e 6B).

(A) Os níveis de apoptose observada após co-silenciamento de c-FLIP com mediadores pró-apoptóticos . (B) Os níveis de proteína mostrando pro-caspase 8 de clivagem e acumulação de c-Jun após a depleção c-FLIP por RNAi.

(A) esquemático mostrando tipo selvagem c-Jun (wt-c-Jun) e não-fosforilável mutante c-Jun constrói. medição de V (B) de anexina apoptose após a sobre-expressão de p-c-Jun ou Mut-c-Jun, tal como indicado. (C) imuno mostrando c-Jun seguinte superexpressão total e fosforilada, controle SIRT1 carregamento mostrado. (D) Os níveis de apoptose após o tratamento combinado de siARN na presença ou ausência de alvo não-MUT-c-Jun (ver materiais e métodos).

A sobre-expressão de exógenos induz c-Jun apoptose

a seguir, perguntou se elevado nível de expressão sozinho c-Jun é suficiente para induzir apoptose. A sobre-expressão de tipo selvagem c-Jun exógena a apoptose induzida em células de cancro HCT116 (Fig. 7A e 7B). Mais importante, a sobre-expressão de um mutante de fosforilação de c-Jun, na qual S63, S73, T91 e T93 são mutados para alanina, também induziu apoptose, assim, evidência re-aplicação para funções pró-apoptóticos de fosforilada-hipo c-Jun (Fig . 7A e 7B). Note-se que a expressão de uma outra proteína exógena, SIRT1, não induz a apoptose em células HCT116 [22] o que indica que os presentes resultados são específicos para C-junho a expressão da proteína do construções e fosforilação status de c-Jun mostra fosforilação em todos os locais examinados tipo selvagem c-Jun (Fig. 7C). Isto é indicativo de stress celular em resposta ao gene exógeno sobre-expressão. Note-se que isto está em contraste com o estado hipo-c-Jun fosforilada sustentada seguinte silenciamento de genes mediada por ARNi sob as condições basais utilizados ao longo deste trabalho (ver, por exemplo, Fig. 3A). A fosforilação mutante c-Jun não tinha reactividade com anti-fosfo-S63, S73 e anticorpos T91 como esperado (anticorpo para Fosfosserina 93 não estavam disponíveis). Embora ambas as proteínas mutantes e de tipo selvagem c-Jun exógena foram fosforilados no T239 e S243 (Fig. 7C), acreditamos que este era não essencial para a indução de apoptose desde endógenos de c-Jun é necessária para a apoptose, apesar da falta de fosforilação C-terminal (ver, por exemplo, Fig. 4B-4D seguinte silenciamento JNK2). Significativamente, a sobre-expressão de c-Jun exógena não induziu a apoptose em células de cancro não-ARPE19 (Fig. 7B). Estas observações gerais ainda mais re-impor nossas conclusões (i) que elevados níveis de hipo-fosforilada de c-Jun são pró-apoptóticos em células cancerosas HCT116, e (ii) que o efeito é específico para as células cancerosas (HCT116) e não é observado