Abstract

Fundo

Nestin está associada com a transformação neoplásica, mas os mecanismos pelos quais nestin contribui para a invasão e malignidade do câncer de pulmão permanecem desconhecidos. Considerando-se que a proliferação é necessário para o comportamento maligno, nós investigamos o mecanismo de acção nestina em associação com as propriedades proliferativas do cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC).

Métodos

expressão nestina foi examinada em espécimes NSCLC e linhas celulares. Associações com características clínico-patológicas, incluindo marcadores de prognóstico e proliferativa, foram avaliados. Efeitos de knockdown nestina na proliferação e as vias de sinalização envolvidos foram ainda mais investigados.

Resultados

nestina foi expresso na maioria das amostras de cancro e todas as linhas celulares de tumores analisados. expressão nestin alta no tecido maligno foi associada a altos Ki-67 ou PCNA níveis e resultados pobres pacientes. Por outro lado, knockdown de expressão nestina levou a uma inibição significativa da proliferação de células tumorais, diminuição da capacidade de formação de colónias, e a paragem do ciclo celular G1. Além disso, knockdown nestin resultou na inibição da Akt e GSK3β ativação.

Conclusões

Nossos dados demonstram que a expressão nestin em células NSCLC está associada com mau prognóstico dos pacientes e via de proliferação de células tumorais. Regulação negativa da nestin eficiente inibiu a proliferação de células do cancro do pulmão, o que pode ser através afetando paragem do ciclo celular e Akt-GSK3β-Rb via de sinalização

Citation:. Chen Z, Wang J, Cai L, Zhong B, Luo H, Hao Y, et al. (2014) Papel do Stem Cell-Associated Intermediário Filament Nestin na proliferação maligna de Non-Small Cell Lung Cancer. PLoS ONE 9 (2): e85584. doi: 10.1371 /journal.pone.0085584

editor: Vladimir V. Kalinichenko, Hospital Infantil de Cincinnati Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 29 de maio de 2013; Aceito: 29 de novembro de 2013; Publicação: 03 de fevereiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Chen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada por doações do Programa Nacional de Pesquisa básica da China (No. 2009CB522100 e 2010CB945400), a National Science Foundation Natural da China (No. 30971675, 30900729 e 31171398), ea chave científicas e Tecnológicas Projectos da Província de Guangdong (Sem . 2007A032100003). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é hoje a principal causa de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo. No cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC), que responde por 80% de todos os casos de câncer de pulmão, metástases distantes desenvolver em até 70% dos pacientes com doença em estágio inicial [1], [2]. Apesar da introdução de novos agentes quimioterápicos e melhoria das técnicas cirúrgicas, NSCLC continua a ser um desafio terapêutico considerável. A taxa de sobrevivência é atualmente pobres, com a sobrevivência apenas 15% paciente em 5 anos após o diagnóstico [3]. características malignas de NSCLC envolver vários eventos importantes, incluindo a proliferação e invasão do tumor primário, angiogênese sustentado, e evasão de apoptose. Proliferação de tumor primário é uma parte integrante da patogénese molecular e celular, desenvolvimento, e metástases de cancro do pulmão [4].

Nestina, um membro do filamento intermédia (IF) da família, tem sido identificada como um potencial indicador proliferativa e multipotência em várias células progenitoras [5] – [10]. relatórios recentes suportam uma ligação entre nestin e características malignas [11] – [19], e sugerem que a expressão nestin abundante está correlacionada com maior malignidade e pior prognóstico em cancros diferentes [11], [18] – [21]. No entanto, a função específica de nestin no comportamento invasivo e metastático de células de câncer de pulmão permanece incerta. As descobertas de que a nestina knockdown reduz o neuroblastoma em cultura e o crescimento de células de astrocitoma enquanto que a sua sobreexpressão tem um efeito citoprotector contra H

2O

2 lesões sugerem um papel na promoção da sobrevivência e proliferação das células [22] – [24]. Em contrapartida, outro estudo mostrou que a regulação baixa nestin não altera o

in vitro

ou

in vivo

características de crescimento de duas linhas celulares de cancro do pâncreas distintas [25]. Assim, nestina pode não actua apenas como uma proteína estrutural, mas podem participar activamente no controlo de processos celulares importantes. No entanto, os mecanismos precisos de acção nestina em proliferação requerem elucidação adicional.

O nosso estudo anterior confirmou nestina expressão em amostras de tecido com NSCLC, que parecia correlacionar-se com a conduta de recém-nascido linfática induzida por células de tumor [21]. expressão nestina Por outro lado, Ryuge S havia descrito é um indicador de prognóstico da probabilidade de sobrevivência mais pobre para pacientes com NSCLC ressecado [26]. No entanto, a relação entre a expressão da nestina e comportamento proliferativa de células NSCLC não foi directamente investigada até à data. Dada a informação disponível limitada sobre o papel fisiopatológico da nestin em células NSCLC [21], [26], temos não só confirmou que a expressão da nestina em amostras de NSCLC apareceu correlacionar-se com medidas clínicas de malignidade do tumor, mas também examinaram a associação de expressão nestin com propriedades proliferativa das células de câncer de pulmão e seu papel funcional na proliferação de células tumorais no estudo atual.

Materiais e Métodos

Tissue espécimes

Um total de 71 amostras de NSCLC e tecidos tumorais adjacentes (borda mais distante da ressecção do tumor) foram selecionados aleatoriamente a partir de nosso banco de dados de tecidos. As amostras foram obtidas a partir de pacientes tratados no Serviço de Cirurgia Torácica do Primeiro Hospital Filiado de Sun Yat-sen University entre maio de 2003 e julho de 2004. Nenhum dos pacientes tinham recebido quimioterapia neoadjuvante ou radioterapia. informações clínicas foram obtidas através da revisão de registros médicos pré e perioperatórios ou via telefone ou correspondência por escrito. Os casos foram encenadas com base na classificação tumor-nódulo-metástase (TNM) da Internacional Cancer Union Against, revisto em 2002 [27], [28]. O uso de materiais humanos foi aprovado pela Comissão de Ética Médica do primeiro hospital Affiliated, Universidade Sun Yat-sen (nome completo do conselho /comitê:. Médica Comissão de Ética do primeiro hospital Affiliated, Sun Yat-sen University No. 2008-7). Confirmamos que o consentimento informado por escrito do doador ou o parente mais próximo foi obtido para o uso desta amostra em investigação. As características clínicas dos pacientes estão apresentadas na Tabela 1.

Linhas Celulares

Não-pequenas células do câncer de pulmão de células, A549, H1299 e H460, foram obtidos a partir do celular Banco do Academia chinesa de Ciências (Xangai, China), e cultivadas de acordo com o protocolo de banco de células específicas.

imuno coloração

o procedimento de imunohistoquímica foi semelhante aos protocolos previamente relatados [21], [29] . Anti-nestina (AB5922; Millipore, Temecula, CA; 1:500 diluição) e anti-Ki-67 (SC-15402, Santa Cruz, CA, EUA; 1:200 diluição). Foram utilizados como os anticorpos primários

Os plasmídeos

Para knockdown de expressão nestin, vetores retrovirais (pSM2) codificação RNAs curto hairpin (shRNA), designado shRNA1 (5′-TGC TGT TGA CAG TGA GCG AGG CAG ACA TCA TTG GTG TTA ATA GTG AAG CCA CAG ATG TAT TAA CAC CAA TGA TGT CTG CCC TGC CTA CTG CCT CGG A-3 ‘) e shRNA2 (5’-TGC TGT TGA CAG TGA GCG CGG CTA GTC CCT GCC TGA ATA ATA GTG AAG CCA CAG ATG TAT TAT TCA GGC AGG GAC TAG CCA TGC CTA CTG CCT CGG A-3 ‘), foram adquiridos a Abrir Biosystems (Huntsville, AL, EUA). Estes retrovírus ou uma construção contendo uma sequência de shRNA scrambled (controlo shRNA, Open Biosystems) foram transduzidas de forma estável em células tumorais através de selecção de antibiótico.

A coloração de imunofluorescência

As células foram incubadas com o anticorpo primário anti-nestina ( AB5922; Millipore, Temecula, CA; 1:500 diluição), anti-Ki-67 (Santa Cruz; 1:200 diluição) ou anticorpo anti-PCNA (2586; Cell Signaling tech, Beverly, MA; 1:2000 diluição). As amostras foram montadas com Vectashield contendo Hoechst 33342, e observados sob um microscópio de fluorescência

Análise de RT-PCR

O ARN total foi extraído, e as seguintes sequências iniciadoras empregues:. Nestina, 5-GAG GAC CAG AGT ATT GTG AGA C-3 e 5-CAC AGT GGT GCT TGA GTT TC-3 (368 pb) e β-actina (controle interno), 5-GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA-3 e 5-CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3 (540 pb).

Análise de imunotransferência

As proteínas foram separadas, electrotransferidas, bloquearam-se com uma solução de TBS /0,1% Tween-20, incubadas com anti-ratinho anticorpo nestina (AB5922; Millipore, Temecula, CA; 1:500 diluição) durante a noite, e detectados com um anticorpo conjugado com peroxidase de rábano anti-ratinho secundário (Cell Signaling tech, Beverly, MA, EUA). GAPDH (SC-81545; Santa Cruz, CA, EUA) foi utilizado como um controlo interno ea imagem-Pro expresso (MediaCybernrtics, EUA) foi utilizado o sistema

Formação de Colónias e CCK-8 Proliferação Celular Ensaios

formação de células colónia foi determinada utilizando coloração violeta cristal. A proliferação celular foi testada com o kit de contagem de células (CCK) -8 (Dojindo, Kumamoto, Japão), e determinada medindo a absorvância a 450 nm.

A avaliação da síntese de DNA por meio de EdU Incorporação

As células foram marcadas com 5-etinil-2′-desoxiuridina (EdU). incorporação nuclear foi determinada por detecção de Alexa Fluor 488 utilizando o Kit de clique sobre ele EdU tratamento de imagens (Invitrogen).

Citometria de Fluxo

A seguir à lavagem com PBS, cinquenta mil células foram analisadas utilizando um FACS Calibur instrumento (BD Biosciences, San Jose, CA) equipado com CellQuest 3,3 software. ModFit LT software de análise de ciclo celular 3.1 julgamento foi utilizado para determinar as percentagens de células em diferentes fases do ciclo celular

A expressão do Ciclo Celular Proteínas

Para immunoblotting, os seguintes anticorpos utilizados:. Coelho anti-Akt (# 9272), anti-GSK3β (# 9332), anti-fosfo (Ser21 /9) -GSK3β (# 9331), anti-fosfo (Ser780) -Rb (# 9307), anti-fosfo (Ser795) -Rb (# 9301), anti-fosfo (Ser870 /811) -Rb (# 9308), de ratinho anti-fosfo (Ser473) -Akt (# 4051) e anti-retinoblastoma (Rb) proteína (# 9309), bem como anticorpo secundário conjugado com HRP-anti-coelho. Todos os anticorpos foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Beverly, MA, EUA). Para análises quantitativas, todos os dados foram normalizados para a expressão GAPDH.

Análise Estatística

Todos os cálculos foram realizados utilizando o software estatístico SPSS V.14.0 (Chicago, IL, EUA). O coeficiente de Spearman de correlação, teste do qui-quadrado e ANOVA foram aplicados conforme apropriado. A sobrevida global (OS) foi calculado a partir da data da cirurgia até a data do último follow-up, ea associação de expressão nestin com OS apresentados como gráficos de Kaplan-Meier. Análises univariada e multivariada foram realizadas utilizando Cox riscos proporcionais regressão para determinar os efeitos prognóstico da expressão nestin e variáveis ​​clínicas potenciais no OS.

Resultados

informações clínicas básicas e estudos de acompanhamento

no total, 51 do sexo masculino e 20 do sexo feminino com NSCLC submetidos a ressecção cirúrgica curativa foram incluídos no estudo. A idade média dos pacientes foi de 57,6 ± 9,8 anos (variação de 35 a 77 anos). Foram examinados 35 adenocarcinoma de pulmão, 34 carcinoma de células escamosas e dois casos de carcinoma de células grandes. Os casos foram classificados como estágio I (n = 32), fase II (n = 17), fase III (n = 15) e estágio IV (n = 7).

27, 28 Estágio IV casos incluídos T

1-2 N

0 e ressecado metástase cerebral solitária. Os dados dos pacientes foram analisados ​​após 5 anos de follow-up, e informações obtidos para 95,8% (68 de 71) dos pacientes. A sobrevida global mediana foi de 25,2 ± 1,9 meses (IC 95%: 21.4-29.0 meses) e sobrevida global média foi de 24,0 ± 2,3 meses (IC 95%: 19.4-28.6 meses).

Associação de Expressão Nestin com mau prognóstico em NSCLC pacientes

as características basais da população estudada em relação ao fenótipo nestina e os resultados das análises multivariadas são apresentados nas Tabelas 1 e 2, respectivamente. Nestina foi expressa em 88,7% (63/71) dos casos, com quase nenhuma expressão em células epiteliais alveolares e brônquicas em tumorais tecidos adjacentes (Figuras 1A, B). estatuto Nestin foi correlacionada com o fenótipo pouco diferenciado (

χ

2 = 17,776,

P =

0,006), tipo de tecido de câncer histológico (

χ

2 = 8,215,

P =

0,002), classificação N (

χ

2 = 12,093,

P =

0,001) e status vital (

χ

2 = 9,003,

P =

0,003). Observou-se uma diferença significativa na taxa de sobrevivência entre os pacientes com e sem fenótipo nestina (Figura 1D). expressão nestin elevada (usando um valor de corte com base na histoscore nestin mediana) foi associado a sobrevivência cumulativa menor (30,8 ± 3,3

vs

20,2 ± 1,7 meses; taxa de risco, 3.366;

P =

0,006).

nestina coloração forte era evidente no tecido NSCLC, ao passo que a coloração no tecido adjacente tumor era fraco (a, B). Nestin foi adicionalmente detectado em adenocarcinoma pouco diferenciado e tecido de carcinoma de células escamosas (C). Um gráfico de Kaplan-Meier que descreve as diferenças de sobrevivência entre os grupos de altas e baixas de expressão nestina, dicotomizados com base no valor médio de expressão nestina em lesões tumorais (D). Barra de escala, 100 mm; *

p Art 0,01; ANOVA.

Associação de Nestin com tumor de células proliferativas Marcadores

expressão Nestin foi significativamente associada com os dos marcadores de proliferação, Ki-67 (r = 0,795,

P

0,001; Figura 2A, B, e C) e o PCNA (r = 0,764,

P

0,001; Figura S1A e B), indicativo de uma função na proliferação das células tumorais.

coloração de nestina e Ki-67 em amostras de NSCLC. (A) coloração IHC de nestina e Ki-67 em tecidos de NSCLC. (B) correlação significativa da nestina e Ki-67 níveis (r = 0,795;

P Art 0,001). Cada ponto representa um espécime NSCLC. (C) Ki-67 histoscores foi elevada em adnocarcinoma (adeno) e carcinoma espinocelular (CEC), com maior expressão nestin. Barra de escala, 100 mm; *

p Art 0,01, utilizando ANOVA

Expression Nestin em linhas celulares de NSCLC

Para clarificar o estatuto expressão da nestina em NSCLC, examinamos a sua expressão. padrões no NSCLC linhas celulares, A549 e H460. Notavelmente, o ARNm e proteína de nestina foram detectadas em todas as linhas celulares (Figura 3). A expressão da proteína nestina entre as células tumorais e as células normais foram também sido mostrada utilizando captura a laser microdissecação (Figura S2).

expressão nestina foi detectada em A549, células H1299and H460 utilizando imunofluorescência (A), RT-PCR (B) e análise de imunotransferência (C). β-actina ou GAPDH foi usada como um controlo de carga. Bar Scale, 100 mm.

Papel do Nestin na proliferação do tumor celular

Para avaliar se nestin desempenha um papel na proliferação de células do cancro do pulmão, nós estavelmente transfectadas células A549 e H460 com plasmídeos codificando shRNAs visando a transcrição nestin ou com plasmídeos de controlo shRNA mexidos, e mudanças medidas em atributos relacionados com a proliferação. coloração por imunofluorescência e imunotransferência mostrou que duas sequências de shRNA nestina (shRNA1 e shRNA2) reduziu drasticamente a expressão de proteína nestina (Figura 4A). Como mostrado na Figura 4B, knockdown nestina em células de tumor, resultou numa diminuição importante na capacidade de formação de colónias (de 23% para 11,8% e 12,3% para shRNA1 e shRNA2 em células A549, e de 39,6% para 20,9% e 22,8% para shRNA1 e shRNA2 em células A549, respectivamente). A taxa de proliferação celular também foi marcadamente diminuída em cada células knockdown-nestina em comparação com células de controlo vetor, medido como uma diminuição de células viáveis ​​(Figura 4C). Consistente com a relação entre a expressão elevada nestina e Ki-67 ou expressão de PCNA em espécimes de tumor de NSCLC, knockdown nestina em células de tumor, resultou numa diminuição significativa do número de células Ki-67-positivos em comparação com células de controlo do tumor (Figura 4D). Além disso, a síntese de ADN em células tumorais knockdown nestina foi significativamente inibido em comparação com o que, em células de tumor de controlo (Figura 5A).

A549 ou células H460 (A) que expressam estavelmente shRNA contra nestina (shRNA1, shRNA2) e foram estabelecidos knockdown nestina, em comparação com células A549 ou H460 transfectadas com uma sequência de shRNA mexidos (vector de controlo), confirmado com a coloração de imunofluorescência (painel da esquerda) e imunotransferência (painel da direita). As diferenças entre knockdown nestin e A549 controlo ou H460 células em termos de formação de colónias de células foram demonstrados em micrografias representativas com coloração violeta cristal (B, painel esquerdo) e quantificação de colônias de células (B, painel da direita). Supressão do crescimento celular como um resultado de knockdown nestina foi estabelecida com o kit de ensaio de CCK-8 (C). imunofluorescência (D) apresentaram imunorreactividade positiva para o anticorpo Ki-67 (vermelho), e os núcleos foram contra-coradas com Hoechst 33342 (azul). Barra de escala, 100 mm; *

p

. 0,01, utilizando ANOVA

As diferenças nas taxas de síntese de ADN entre knockdown nestin e A549 controlo ou células H460 foram determinadas usando ensaios EdU incorporação (A). A citometria de fluxo foi utilizada para analisar o ciclo celular em knockdown nestina e A549 controlo ou células H460 (B). Barra de escala, 100 mm; *

p

. 0,01, utilizando ANOVA

Nestin shRNA Clones exibição parada do ciclo celular no G1 /S Fase

Para determinar se a inibição de proliferação de células tumorais está relacionada com a regulação do ciclo celular, foram investigados os efeitos de knockdown nestina sobre a progressão do ciclo celular em células cancerosas. Notavelmente, o número de células na fase S do ciclo celular foi substancialmente reduzida na sequência knockdown nestina (Figura 5B).

nestina shRNA Clones de exibição Diminished fosforilação de Akt em Ser 473 e GSK3α /β em Ser 21 /9

Em seguida, foram determinados os perfis de sinalização de clones shRNA nestina. Uma vez que a transição da fase G1 para a fase S é um ponto de controlo importante durante a proliferação das células, verificou-se ainda mais as vias de sinalização envolvidos em progressão G1 para S. knockdown nestina exibida fosforilação relativamente reduzida de proteínas-chave envolvidas na proliferação e metástase, incluindo Akt em Ser 473, GSK3α /β em Sor 21/9, e Rb em Sor 780, 795, e 807/811 (Figura 6A). A análise quantitativa ainda revelado que a diminuição das proteínas /p fosfo-GSK3α fosfo-Akt e foi particularmente marcada em células tumorais transduzidas com a sequência de shRNA2, enquanto a expressão de fosfo-Rb foi mais significativamente diminuída em células tumorais transduzidas com a sequência de shRNA1 (Figura 6B -F). Portanto, os principais eventos de fosforilação alterados mediante regulação negativa nestina são aqueles dos mediadores chave na via fosfatidilinositol 3-quinase.

(A) Os padrões de expressão de uma série de proteínas relacionadas com o ciclo celular em knockdown nestina e A549 controle células. (B-D) A análise quantitativa de Rb e fosfo-Rb, (B) e fosfo AKT (Ser473) -Akt (C), e GSK3β e fosfo-GSK3α /β (D). *

p Art 0,01; ANOVA.

Discussão

nestina, expressa numa ampla variedade de populações de células embrionárias e progenitoras adultas, e considerada como um marcador para distinguir células progenitoras a partir de outras células diferenciadas [30], [ ,,,0],31]. Relatórios recentes têm mostrado que a expressão de nestina nos cancros da mama, da próstata, e cancro do pâncreas é positivamente correlacionada com a malignidade de tumores [16] – [18]. Estas observações levaram aumento do interesse de pesquisa nos padrões de nestin em vários tumores e sua relação com características proliferativas e metastáticas de expressão.

No presente estudo, mostramos que a expressão nestin está significativamente associado com características malignas do tecido NSCLC , especificamente, fenótipo pouco diferenciado e histologia. Adicionalmente, o ARNm e proteína de nestina foram expressos em todas as linhas celulares de NSCLC estudadas. A análise estatística revelou um aumento significativo na taxa de risco (risco de morte) em pacientes com elevada expressão nestina, em comparação com aquelas que expressam baixos níveis de nestina. expressão nestin alta no tecido NSCLC foi mais frequentemente associada a recidiva da doença e da morte. Nossos achados confirmam ainda mais os relatórios anteriores de uma relação positiva entre a expressão nestin e malignidade do tumor [11], [18] – [21].

Apesar de estudos anteriores relataram que knockdown de nestin por siRNA reduz eficazmente a proliferação e o crescimento de células de astrocitoma C6 [23] e a sua infra-regulação activa CDK5 /vias apoptóticas dependente de p35 [24], [32], o papel preciso da nestina na metástase tumoral é obscura actualmente. Aqui, observamos uma relação positiva entre nestin e Ki-67 em tecidos e células NSCLC. A observação de que a proteína Ki-67 é expresso em todas as fases activas do ciclo celular (G1, S, G2, e mitose), mas ausente de células em repouso, apoia ainda mais a teoria de que a nestina pode ser associado com a proliferação de células tumorais. Dada a associação entre a alta expressão nestin e coloração elevada para os marcadores de proliferação celular, Ki-67 e PCNA, nós nos concentramos sobre o papel da nestina na proliferação de células tumorais usando retrovírus para introduzir vectores shRNA com sequências-nestina alvo (ou de controle) em NSCLC células. Significativamente, as propriedades proliferativas, tais como a capacidade de formação de colónias de células e taxa de crescimento, tiveram uma diminuição nos clones shRNA nestina. Nossos resultados fornecem evidências preliminares para um papel de nestin na proliferação de células do cancro do pulmão.

Um mecanismo possível para explicar a ligação entre a expressão nestin e proliferação é proposto com base em resultados de nossa análise da regulação do ciclo celular em células tumorais. Especificamente, o tamanho da população de células na fase S foi dramaticamente reduzida em células de knockdown nestina. Consistente com esta conclusão, a síntese de DNA, que ocorre durante a fase S, foi reduzida em clones shRNA nestina. A transição da fase G1 para a fase S é um ponto de controlo importante no ciclo celular. A nossa investigação das proteínas chave que regulam o ponto de verificação, tais como a proteína Rb, desde suporte adicional para um papel para nestina na proliferação através da modulação do ciclo celular. As interacções do Rb com complexos de ciclina D-CDK4 /6 e a ciclina E-CDK2 promover a fosforilação de Rb e a expressão dos genes necessários para entrar na fase S [33], [34]. Nossos experimentos mostraram que os clones shRNA nestina exibir níveis relativos diminuição da fosforilação em vários locais de Rb. Por conseguinte, propomos que a promoção da fosforilação de Rb é um dos mecanismos moleculares pelos quais nestina induz a proliferação de células tumorais. Nós adicionalmente investigadas proteínas específicas da via de sinalização de Akt. Anormalidades na proteína quinase serina /treonina, Akt, estão intimamente relacionados com o estado proliferativo das células e induzir a fosforilação de GSK3β [35], [36]. Na sua forma activada desfosforilado, GSK3β promove a degradação de ciclina D, e não fosforilada GSK3β suprime fosforilação de Rb e impede a progressão do ciclo celular [37], [38]. Os dados do presente estudo indicam que a supressão da proliferação de células em clones shRNA nestina depende da regulação negativa da via de sinalização de Akt-GSK3β-Rb. Por extensão, estes dados implicam que os níveis elevados de nestina em células do cancro do pulmão e estimular a proliferação de metástases através do aumento da actividade desta via. Um número de investigadores acreditam que a nestina tem principalmente uma função do citoesqueleto, proporcionando um local de reacção para uma variedade de vias de sinalização [39], [40], e, portanto, são esperados alterações do citoesqueleto de afectar as cinases relacionadas com a invasão e metástases. Mais importante ainda, porque A549 e células H460 linhas são p53 do tipo selvagem e proteínas MDM2 regulada por p53 é um regulador conhecido de função de RB, a diafonia entre nestina e via p53 parece ser tomados em consideração, e a inibição da actividade da mTOR por p53, que por sua vez regula fosfo-Akt-S473 nível, também pode fornecer possível ligação entre p53 e nestin [41], [42]. Assim, a ligação entre a expressão nestin e regulação do nível de proteína Rb precisa ser mais abordados.

Comparando com os relatórios anteriores relativos à expressão nestin no cancro do pulmão [21], [26], os nossos resultados não só confirmaram que a expressão da nestina em amostras de NSCLC pareceu correlacionar com medidas clínicas de malignidade do tumor e má classificação histológica, mas também sugeriu que a nestina pode contribuir para o comportamento proliferativa e invasiva das células NSCLC. Além disso, o nosso trabalho, em primeiro lugar também estudaram a relação biológica entre a alta expressão nestina e características malignas de NSCLC utilizando técnicas de ARN de knockdown, análise do ciclo celular, e a avaliação de uma série de proteínas associadas ao ciclo celular em modelos de linhas celulares de cancro do pulmão. Com base nestes resultados, seria fornecida a primeira demonstração de que o fenótipo nestina exibiram melhores propriedades proliferativas, e explicado cientificamente as questões mais importantes do mecanismo potencial da acção nestina na proliferação de células tumorais. Assim, os fenómenos que as células de tumor que expressam nestina são importantes para a proliferação, migração, e metástases do cancro do pulmão.

Enquanto os nossos resultados indicam que os actos nestina através da via de sinalização de Akt-GSK3β-RB para contribuir para a proliferação in células de câncer de pulmão, outros aspectos de malignidade do tumor, como a angiogênese, lymphangiogenesis e metabolismo do tumor, estão ainda a ser examinada diretamente. No entanto, tendo em conta estas conclusões, o papel da nestin precisa ser considerado no diagnóstico clínico em curso ou como um novo alvo para terapia de câncer

Conclusões

observadas células tumorais nestina-positivas em. a maioria das amostras de NSCLC e associação significativa de expressão nestin com o subconjunto de pacientes com NSCLC exibindo maus resultados e níveis elevados de marcadores de proliferação. Além disso, knockdown nestin inibiu a proliferação celular e G1 /S prisão em células NSCLC humanas, possivelmente através de regulação negativa da AKT-GSK sinalização D 3β-ciclina. Nossos dados sugerem coletivamente que as células tumorais expressando nestina promover a proliferação em NSCLC, o que pode constituir um mecanismo-chave de malignidade mediada por nestin em células de câncer de pulmão. regulamentação específica de nestin pode, assim, ter aplicações terapêuticas no tratamento do câncer de pulmão humano.

Informações de Suporte

Figura S1.

Coloração de nestina e PCNA em amostras de NSCLC. (A) coloração IHC de nestina e PCNA em tecidos NSCLC. (B) histoscores PCNA foi elevada em adnocarcinoma (adeno) e carcinoma espinocelular (CEC), com maior expressão nestin. Barra de escala, 100 mm; *

P Art 0,01, utilizando ANOVA

doi:. 10.1371 /journal.pone.0085584.s001

(TIF)

Figura S2.

A expressão da proteína nestina entre as células tumorais e células normais, utilizando microdissecação de captura a laser. microdissecação de captura (A) laser de células tumorais e células normais. H seção celular mostrando células tumorais (A) e as células normais (d) antes microdissection E-manchada. células tumorais mesma secção que mostra (B) e as células normais (e) Após microdissecação. As células tumorais (c) e as células normais (f) seguintes microdissecação na tampa. (B) Os resultados da transferência de Western de dois pares de células de tumor e as células normais microdissecados. Escala Bar, 100 mm

doi:. 10.1371 /journal.pone.0085584.s002

(TIF)

Reconhecimentos

Esta pesquisa foi apresentada no 2

II Conferência Europeia Câncer de pulmão (2010, Genebra).