Sumário

A inibição do sistema ubiquitina-proteassoma (UPS) de degradação da proteína é uma estratégia anti-cancro válido e tem levado para a aprovação do bortezomib para o tratamento de mieloma múltiplo. No entanto, a abordagem alternativa de aumentar a degradação de oncoproteínas que são frequentemente sobre-expressos em cancros é menos desenvolvida. O ácido betulinico (BA) é uma pequena molécula derivada de planta que pode aumentar a apoptose especificamente em cancro, mas não em células normais, tornando-se um agente anti-cancro atraente. Os nossos resultados no cancro da próstata sugeriu que a BA inibida múltiplos deubiquitinases (dobragens), o que resultou na acumulação de proteínas ubiquitinadas-poli, diminuição dos níveis de oncoproteínas, e aumento da morte celular por apoptose. Em fibroblastos normais, no entanto, a BA não inibir a atividade DUB nem aumento de proteínas totais ubiquitinada-poli, que foi associado com a falta de efeito sobre a morte celular. No modelo de ratinho transgénico TRAMP do cancro da próstata, o tratamento com BA (10 mg /kg) inibiu tumores primários, aumento da apoptose, diminuição da angiogénese e a proliferação, e reduzido receptor de androgénio e a proteína ciclina D1. tratamento BA também inibiu a actividade de DUB e aumentou proteínas ubiquitinadas em TRAMP do cancro da próstata, mas não teve nenhum efeito sobre a apoptose ou ubiquitinação em tecidos normais de ratinho. Em geral, os nossos dados sugerem que a inibição mediada por BA de dobragens e de indução da morte celular por apoptose especificamente em cancro da próstata, mas não em células normais e tecidos pode fornecer um agente eficaz não-tóxicos e clinicamente selectiva para a quimioterapia.

Citation : Reiner T, Parrondo R, de las Pozas a, Palenzuela D, C Perez-Stable (2013) ácido betulínico seletivamente aumenta a degradação da proteína e aumenta Prostate Cancer a apoptose-específico: possível papel para a inibição da Deubiquitinase Atividade. PLoS ONE 8 (2): e56234. doi: 10.1371 /journal.pone.0056234

Autor: Paul J. Galardy, Clínica Mayo, Estados Unidos da América

Recebido: 12 de abril de 2012; Aceito: 11 de janeiro de 2013; Publicação: 12 de fevereiro de 2013

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Financiamento:. Veterans Affairs Merit comentário 6.996,06 MR https://www.research.va.gov/programs/blrd/merit_review.cfm. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

em virtude da sua elevada capacidade proliferativa, as células cancerosas normalmente respondem à acumulação de proteínas desdobradas ou estresse proteotoxic pela melhoria do sistema ubiquitina-proteassoma (UPS), a fim de resistir à morte celular por apoptose [1]. A UPS é a principal via celular que degrada proteínas desdobradas e controla os níveis de proteínas específicas importantes no ciclo celular, a proliferação de expressão, e apoptose [2]. As proteínas são alvo para degradação UPS mediada pela adição de unidades múltiplas de ubiquitina (poli-Ub), que facilita o reconhecimento e a degradação pelo complexo de UPS. A inibição do aumento do UPS e subsequente em várias proteínas é uma estratégia anti-cancro válido que levou ao desenvolvimento de bortezomib, uma droga aprovado pela FDA para o tratamento de mieloma múltiplo [3]. Clinicamente, no entanto, bortezomib sozinho não exibe a atividade substancial no câncer de próstata resistente à castração (CRPC) e é frequentemente associada com a limitação de dosagem efeitos secundários, tais como a neuropatia [4].

Uma alternativa mas a estratégia terapêutica menos desenvolvidos é para explorar as UPS, reforçando a sua actividade e especificidade, a fim de aumentar a degradação de proteínas proliferação e pró-sobrevivência que são frequentemente sobre-expresso em cancros, ou seja, oncoproteínas. Um método viável e clinicamente relevante é buscar a identificação de moléculas pequenas que podem ativar a degradação mediada por UPS de proteínas tais como receptor de andrógeno (AR) no cancro da próstata (PC). O ácido betulinico (BA) é uma pequena molécula derivada de planta que pode aumentar a apoptose em células cancerosas, tornando-se assim um agente anti-cancro atraente [5]. Actualmente, BA é uma das duas únicas moléculas pequenas relatadas para ativar diretamente a atividade UPS tipo quimotripsina

in vitro

[6], [7]. Outro relatório demonstra que a BA inibe o crescimento de células LNCaP de PC, activando selectivamente degradação UPS-dependentes de AR, bem como de proteína especificidade factores de transcrição (SP) que regulam a expressão de VEGF [8]. No entanto, os mecanismos através dos quais a BA activa especificamente a degradação UPS-dependente de factores de AR e outras são desconhecidos.

Para além de estimular a actividade UPS, BA outra forma possível pode aumentar a degradação de proteínas específicas é pela inibição deubiquitinases ( Dubs). ubiquitination reversível é um mecanismo crucial na regulação da UPS e na manutenção de muitas proteínas do ciclo celular e pró-sobrevivência [9] – [11]. Dados recentes indicam que Dubs desempenham papéis reguladores críticos na maioria dos percursos envolvendo Ub [9] – [11]. Cerca de cem Dubs humanos caem em cinco classes, as proteases sendo melhor caracterizadas específicos de ubiquitina (USP) e ubiquitina hidrolases C-terminal (UCH). remoção DUB-mediada de poli-Ub de proteínas-chave torna-os menos suscetíveis à degradação pela UPS e, portanto, aumenta os seus níveis. Na verdade, várias dobragens são sobre-expresso em cancro e são considerados como oncogenes [9] – [11]

Como chama de ter um papel na transformação oncogénica, a atenção tem-se centrado recente na identificação de pequenas moléculas inibidoras de. Dubs. A ideia é que Dubs inibidores vai elevar poli-Ub em oncoproteínas e aumentar o seu reconhecimento e degradação pela via UPS, resultando em uma maior apoptose e uma melhor eficácia da droga [12]. Vários inibidores de pequenas moléculas da actividade DUB foram identificados para aumentar a acumulação de proteínas poli-Ub e intensificar a apoptose em células cancerosas, sugerindo que os inibidores DUB são promissores agentes anti-cancro [13] – [18]. Neste relatório, nós mostramos que a capacidade da BA para aumentar a degradação de proteínas múltipla proliferação e pró-sobrevivência em células PC foi correlacionada com a inibição da Dubs. Em contraste com as células PC, BA não teve nenhum efeito sobre a actividade e a degradação de proteínas em células normais DUB, resultando em nenhuma toxicidade. Nossos resultados sugerem que o efeito específico do PC fornecida pela terapia BA foi devido à sua capacidade de inibir Dubs em câncer, mas não em células não-cancerosas.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

Todos os estudos com animais foram realizados com a aprovação do Comitê Institucional animal Cuidado e Uso (protocolo nº 6.996,06 MR), do Centro Médico Miami Veterans Affairs (Associação para a Avaliação e Acreditação do Laboratório animal Care credenciados) e conduzida de acordo com as Diretrizes do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório

Reagentes

BA para experimentos de cultura celular foi comprado de AG Scientific.; digitonina e polivinil-pirrolidona (PVP) a partir de Sigma-Aldrich; MG132, doxorrubicina e azul de Coomassie de EMD Biosciences; N-etilmaleimida (NEM) a partir de Sigma; e azul de tripano (0,4%) a partir de Invitrogen.

O tratamento de ratinhos TRAMP com BA

ratinhos transgénicos TRAMP (Jackson Laboratories) foram identificados pela biópsia cauda e PCR utilizando purificação Assistente SV Genomic DNA (Promega ) e iniciadores de ADN PB-1 para a frente 5′-CCGGTCGACCGGAAGCTTCCACAAGTGCATTTA-3 ‘e Tag reversa 5′- CTCCTTT CAAGACCTAGAAGGTCCA-3’. BA foi obtido a partir de Zé-Qi Xu da Advanced Life Sciences e preparado como anteriormente descrito [19]. Os ratos com tumores de próstata palpáveis ​​foram aleatoriamente divididos em grupos experimentais e de controlo e injectados i.p. 11 vezes mais de 14 dias com BA (5 [BA5] ou 10 [BA10] mg /kg de peso do corpo, n = 10 cada dose) ou veículo de controlo (n = 12). No dia 15, os tumores da próstata primários foram removidos e os seus pesos determinada. Uma porção exterior do tumor da próstata primário foi fixado em formalina para imuno-histoquímica. TRAMP machos sem tumores palpáveis ​​da próstata foram tratados da mesma forma com BA10 ou controle do veículo (n = 3, cada grupo), próstatas, baço, timo removido, e analisados ​​por imuno-histoquímica.

Imunohistoquímica

imunocoloração para apoptótica (caspase-3 clivada, Cell Signaling Technology; ApopTag peroxidase detecção in situ de apoptose, Millipore) e em proliferação (Ki67, NCL-Ki67p, Leica Microsystems; PCNA [PC10], Santa Cruz Biotechnology) de células foi realizada utilizando anticorpo policlonal de coelho, anticorpo monoclonal de ratinho , os anticorpos secundários e de cabra biotinilado anti-coelho /rato (Vector Laboratories), como previamente descrito [20]. a densidade dos vasos sanguíneos foi determinada por imunocoloração para CD-31, utilizando um anticorpo policlonal de cabra (M20; Santa Cruz Biotechnology) e um anticorpo secundário anti-cabra de coelho biotinilado ou para CD-34, usando um anticorpo policlonal de rato (RAM34, BD Biosciences) e de cabra anti -rat anticorpo secundário. O número de caspase-3 clivada ou células positivas Ki67 e CD-31 vasos positivos foram determinados para os controlos BA10 e o veículo (n = 5 em cada grupo), tal como previamente descrito [20]. Da mesma forma, AR (N-20), ciclina D1 (DCS-6), e ubiquitina (P4D1) de Santa Cruz Biotechnology foram imunocoradas; o número de células positivas AR foi determinada para controlo e BA10 veículo tumores da próstata.

As linhas celulares

linhas celulares PC Humanos LNCaP, DU145, PC3 e [21] foram obtidas a partir da American Type Culture coleção (ATCC) e utilizado no prazo de 6 meses de reanimação das culturas originais. Todas as células de PC foram mantidas em meio RPMI 1640 (Invitrogen) com soro fetal bovino a 5% (Hyclone), 100 U /ml de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina, e 0,25 ug /mL de anfotericina (Invitrogen). células epiteliais da próstata PrEC normais humanos foram obtidos a partir de Lonza e mantidas em meio PrEGM. RWPE-1 células epiteliais de próstata normais (obtido do Dr. Bal Lokeshwar, Universidade de Miami e originalmente a partir de ATCC) foram mantidas em meios de queratinócitos-SFM (Invitrogen). Prepúcio humano células BJ fibroblastos (passagem 24) e os fibroblastos pulmonares fetais (IMR-90, células MRC-5) foram obtidas do Dr. Priyamvada Rai (Universidade de Miami) e originalmente obtida a partir de ATCC (CRL-2522, CCL-186 e CCL -171). BJ, IMR-90, e as células MRC-5 foram mantidas em meio DMEM (Invitrogen) com 10% de soro fetal bovino, 100 U /ml de penicilina, e 100 ug /ml

ensaio de proliferação celular BA estreptomicina.

O método colorimétrico proliferação celular CellTiter aquosa em Promega foi usada para determinar a viabilidade celular de células PC em meios contendo BA (2,5, 5, 7,5, e 10 uM) ou controlo (0,5% de DMSO). A viabilidade celular foi normalizado contra o controlo do veículo e os dados foram expressos como uma percentagem de controlo a partir de três experiências independentes realizadas em triplicado.

tratamentos com drogas

células PC foram cultivadas em meios contendo BA (10 uM ), MG132 (1 uM), docetaxel (1 nM) ou controlo de DMSO durante tempos que variam (24-72 h). BJ, IMR-90, MRC-5, PrEC, e RWPE-1 As células foram cultivadas em meios contendo BA, doxorrubicina (1 uM), ou controlo de DMSO durante tempos que variam (24-72 h). Em todas as experiências, as células tripsinizadas flutuante e ligados foram reunidas para posterior análise.

análise Western blot

Preparação de lisados ​​totais de proteína e análise por Western blot foi realizada tal como anteriormente descrito [22]. Foram utilizados os seguintes anticorpos: PARP clivada (9541), CoxIV (4844), AKT (9272), e a survivina (71G4B7) a partir de Cell Signaling Technology; citocromo c (7H8.2C12), Smac (612,245), Bcl-xL (610211) e Rb (544,144) da BD Biosciences; FIA (E-1), actina (C-11), ciclina A (H432), ciclina B1 (GNS1), ciclina D1 (DCS-6), Cdk1 (17), Cdk2 (D-12), Cdk4 (M2) , p21 (C-19), p27 (C-19), E2F1 (KH95), AR (N-20), Mcl-1 (S-19), Bcl-2 (N-19), HA (Y-11 ), Ub (P4D1), Rb (C-15), e anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano-de Santa Cruz Biotechnology. Nossa preferência era usar Coomassie coloração azul da proteína total como controles de carga porque os tratamentos de drogas muitas vezes afetam os níveis de proteínas de limpeza típicos, tais como actina ou tubulina.

Trypan azul exclusão ensaio

tratado e controle PC, BJ, IRM-90, MRC-5, células PrEC, ou RWPE-1 foram recolhidas, ressuspensas em PBS, diluídos 1:01 em 0,4% trypan azul, morto azul e viver células não-azuis imediatamente contadas utilizando um hemacitómetro, e as% de células azuis mortas determinadas a partir de pelo menos três experiências independentes feitas em duplicado.

anexina-FITC /iodeto de propídio (PI) citometria de fluxo

tratadas e as células controle de PC foram novamente suspensas em tampão de ligação seguido por adição de anexina V-FITC e PI (anexina V Kit SC-4252 AK, Santa Cruz Biotechnology). Após 20 min., As células foram analisadas por citometria de fluxo utilizando um citómetro de fluxo Coulter XL e a percentagem de células anexina + WinMDI determinado utilizando a versão 2.8 a partir de duas experiências independentes realizadas em triplicado.

ensaio de libertação de proteína mitocondrial

tratadas e as células de controlo PC foram ressuspensos num tampão contendo digitonina 100-200 uM, tampão Hepes 20 mM, pH 7,5, KCl 10 mM, MgCl 1,5 mM, EGTA 1 mM, EDTA 1 mM, DTT 1 mM, sacarose 250 mM, e inibidores de protease (Roche) a 50 ul /1 × 10

6 células. Após 5 min. em gelo, as células foram centrifugadas 5 min e o sobrenadante foi utilizado para análise de Western blot. A digitonina é um detergente que preferencialmente permeabiliza membrana do plasma em comparação com membrana mitocondrial [23].

análise do ciclo celular por citometria de fluxo

propídio /citrato hipotónica método foi utilizado para estudar a distribuição do ciclo celular de PC BA tratada células [24]. Seis a oito amostras foram analisados ​​a partir de pelo menos três experiências independentes e os histogramas de distribuição de ADN geradas como previamente descrito [22], [25].

transfecção transiente de AR, ciclina D1 de tipo selvagem e mutante T286A

CMV /AR plasmídeo de expressão foi transfectado em células PC3, durante 24 h utilizando FuGene-HD (Roche) seguido de BA (24, 48, 72 h) ou tratamento de controlo (24 h) e a proteína AR analisados ​​por western blot. A ciclina D1 plasmídeos de expressão pBABE /ciclina D1 de tipo selvagem (9050) e pcDNA /ciclina D1 mutante T286A (11182; não pode ser degradado pela UPS; [26]) foram obtidos a partir de AddGene. Estes plasmídeos foram transfectados em células LNCaP durante 24 h seguida por BA ou tratamento de controlo, durante 24 h. Os níveis de proteína da proteína ciclina D1 transfectadas foi determinada por análise de Western blot utilizando anti-HA e ciclina D1.

ensaio Proteasoma

O proteassoma-Glo Chymotrypsin-like Cell-Based Assay (Promega) foi utilizado para determinar o efeito da BA sobre a actividade de proteassoma em células PC. As células foram tratadas com BA, BA + MG132, ou de controle para 8, 24, 48 e 72 h, o número de células determinadas, e a atividade do proteassoma medida com um luminómetro (TD-20/20, Turner Designs). unidades de luz foram normalizados para o número de células (tratamento controle = 1) e 6-8 amostras foram analisadas a partir de pelo menos quatro experiências independentes.

ensaio DUB

O DUB-Glo Protease Assay (Promega) foi utilizado para determinar o efeito da BA sobre a actividade DUB em PC, BJ, células RWPE-1 IRM-90, e. As células foram tratadas com BA, 1 nM de docetaxel ou o controlo 8, 24, 48, e 72 h, submetidas a lise em tampão de DUB (Tris-HCl a 50, pH 7,5, 0,1% de NP-40, MgCl 5 mM de

2 , sacarose 250 mM, DTT 1 mM, PMSF 1 mM), centrifugou-se 10 min., e 10 ug de proteína utilizada para determinar a actividade DUB. Os lisados ​​de controlo foram pré-incubadas com NEM 4 mM, um inibidor conhecido DUB, durante 1 h antes da adição de substrato. unidades de luz (tratamento de controle = 1) a partir de amostras 6-8 foram determinados a partir de pelo menos três experiências independentes. DUB actividade também foi medido no controlo de veículo (n = 4) e BA10 (n = 5) tumores da próstata TRAMP.

foram preparados rotulagem ensaio DUB

Os lisados ​​celulares como descrito acima para o ensaio DUB , 20 ug de proteína incubadas com 500 ng de HA-Ub vinilsulfona (VS), um inibidor específico irreversível da maior parte das dobragens (Boston Biochem) durante 1,5 h à temperatura ambiente, e as amostras analisadas por western blot utilizando anticorpo anti-HA para detectar DUB rotulagem.

a análise estatística

As diferenças estatísticas entre e os controles foram determinadas por tratados com drogas de Student bicaudal

t

-test (variância desigual) com

P

. 0,05 considerado significativo

resultados

BA inibe o crescimento de tumores TRAMP próstata, aumentando a apoptose e diminuição da angiogênese e proliferação

Nós BA utilizado anteriormente (Fig. 1) como um agente que pode melhorar a sensibilidade de linhas de células de PC para a morte celular quando combinados com agentes anti-mitóticos, aumentando a actividade de NF-kB, em parte devido à degradação aumentada de IκBα [27], [28]. Para avaliar o

in vivo

eficácia terapêutica da BA, utilizamos o modelo TRAMP rato transgénico de PC [29], [30]. ratinhos TRAMP conter o promotor probasina específico da próstata ligada ao oncogene antigénio T de SV40, que resulta no desenvolvimento de PC metastático agressivo. Os nossos resultados indicam que a BA (5 e 10 mg /kg) reduziu significativamente os pesos finais dos tumores da próstata primários em comparação com tumores de controlo de veículo (Fig. 2a). Não houve diferença nos pesos corporais finais entre BA tratados e ratinhos de controlo (dados não apresentados). A imuno-histoquímica (IHQ) de clivada (activa) da caspase-3, um marcador para células apoptóticas, mostrou um aumento significativo em comparação com BA10 tumores de controlo de veículo (Fig. 2B e Fig suplementar. S1A). O IHC de CD31, um marcador para os vasos sanguíneos, e de Ki67, um marcador para a células em proliferação, mostrou uma diminuição significativa em BA10 comparados com os tumores de controlo do veículo. Outra confirmação usando TUNEL para a apoptose, CD34 para a angiogênese e PCNA para a proliferação é mostrado na Suplementar Fig. S1B. Estes resultados indicaram que a apoptose induzida por BA e angiogénese e inibiu a proliferação em tumores da próstata TRAMP.

(A) Os pesos dos tumores da próstata primários foram significativamente menos em BA (5, 10 mg /kg) em relação ao veículo controle [C] ratinhos TRAMP tratados (*,

P Art 0,03; **,

P Art 0,002). de tratamento (B) BA10 aumento da caspase-3 clivada e células + CD31 diminuiu e Ki67 células + em comparação com tumores de controlo da próstata. (C) imunocoloração representativas para ciclina D1 e AR (200 ×) mostrou menos proteína em BA10 em comparação com tumores de controlo da próstata (PT). Os níveis de proteína AR foram semelhantes em próstatas normais (PR) a partir de ratinhos tratados com BA ou de controlo (200 ×). (D) diminuiu significativamente o número de AR + células em BA10 relação ao controle de tumores de próstata (*,

P Art 4 × 10

-7).

diminui BA os níveis de AR em tumores de próstata TRAMP mas não em

normais da próstata

em seguida, procurou determinar se a BA pode diminuir os níveis de proteínas D1 AR e ciclina expressão em tumores de próstata TRAMP. IHC e contagem de células RA + mostraram uma diminuição significativa no BA10 em comparação com tumores de controlo de veículo (Fig. 2C e D). O IHC de ciclina D1 também mostrou uma diminuição significativa em BA10 comparados com os tumores de controlo do veículo, correlacionando-se com a diminuição nos marcadores de proliferação Ki67 e PCNA (Figs. 2B, C). A seguir, procuramos determinar se a diminuição mediada por BA em AR também ocorreu em tecido prostático não canceroso. Ao contrário dos resultados em tumores da próstata, os níveis de AR na próstata normal, foram semelhantes em BA10 em comparação com controlo de veículo, sugerindo que a degradação mediada por BA do AR ocorreu apenas em células de tumor (Fig. 2C).

BA inibe a proliferação e aumenta a apoptose de células PC

Para abordar os mecanismos de BA como agente único no PC, usamos células DU145 e PC3 LNCaP e resistente à castração andrógeno-dependentes. Utilizando um ensaio de proliferação de células de três dias, verificou-se que 10 pM BA inibiu o crescimento de todas as células PC, incluindo o mais resistente à quimioterapia DU145 e PC3 células (Fig. 3a). Todas as experiências seguintes foram efectuadas utilizando 10 uM BA. O efeito célula BA anti-PC era devido a um aumento da morte celular por apoptose, conforme determinado por ensaio de exclusão de azul de tripano, a análise de Western blot de clivada-PARP (substrato para as caspases activadas), e anexina V-FITC /PI citometria de fluxo (Fig. 3B , C). BA é relatado para segmentar mitocôndrias para iniciar a via intrínseca da apoptose através do aumento da libertação de proteínas mitocondriais, tais como citocromo C, o que activa a cascata de caspases [5]. Os resultados em células PC3 mostraram que a BA aumentada a libertação de citocromo c, Smac (blocos de inibidor de apoptose [IAP] família; [31]), e o factor de indução de apoptose (AIF; transloca-se para núcleo para aumentar a fragmentação do ADN; [32] ) das mitocôndrias (Fig. 3D). Resultados semelhantes foram obtidos em células LNCaP e DU145 BA tratada suplementar (Fig. S2). Assim, a libertação mediada por BA de proteínas pró-apoptóticas das mitocôndrias coincidiu com o aumento observado na apoptose em células PC.

de ensaio (A) a proliferação celular demonstraram que o aumento das concentrações de BA (2,5 a 10 uM) inibida LNCaP, DU145, PC3 e células. (B) ensaio de exclusão com Trypan azul mostrou que 10 uM BA (B) aumento da morte celular total em LNCaP (48 h), DU145 (72 h), e PC3 (72 h) em comparação com células de controlo (C). A análise Western blot mostrou que a BA aumentaram clivada níveis (cl) -PARP em células PC. Coomassie mancha azul do total de proteínas está a carregar o controle. (C) análise de citometria de fluxo apresentaram maior anexina-FITC BA corado em comparação com células de controlo PC tratadas. (D) Ensaio de libertação de proteína mitocondrial e western blot apresentaram níveis aumentados de citocromo c, Smac, e AIF em células PC3 tratadas com BA em comparação com células de controlo. proteína Cox IV foi negativo indicando que não há contaminação mitocondrial e actina foi o controle positivo. + C foi lisado preparado utilizando o método padrão para proteínas totais.

BA aumenta G1 /S paragem do ciclo celular em células PC

Para investigar os efeitos do ciclo celular de BA em células PC , utilizou-se a análise de citometria de fluxo. O tratamento de células PC com BA durante 24 h resultou num aumento significativo do G1 e diminuiu a fase S do ciclo celular, indicando um bloco grande em G1 /S (Recurso Fig. S3A). Depois de tempos mais longos de tratamento BA, houve um aumento significativo na fase do ciclo celular sub-G1 em todas as células PC, que era um reflexo maior de degradação do ADN que ocorreu em células apoptóticas (Fig suplementar. S3B). Em DU145 e PC3 mas não em células LNCaP, houve um aumento significativo na G2 /M, após 72 h de tratamento BA. Estes resultados indicaram que a BA induzidas rupturas significativas no ciclo celular normal de células PC.

BA aumenta a degradação de proteínas do ciclo celular múltipla e pró-sobrevivência em células PC

Uma vez que é relatado para BA aumentar a degradação de proteínas múltiplas, investigámos o efeito da BA em proteínas do ciclo celular e pró-sobrevivência em células PC por análise western blot. Os nossos resultados indicaram que os níveis de proteína de várias proteínas do ciclo celular, incluindo as ciclinas A, B1, D1; Cdks1, 2, 4; E2F1, e Rb diminuiu após tratamento BA começando às 24 h em LNCaP e células PC3 (Fig. 4a). Em células LNCaP, o inibidor de Cdk p21 também diminuiu após tratamento BA mas em PC3, proteína p21 aumentada às 24 horas e retornou aos níveis basais em 48 e 72 h. Em contraste, o inibidor de Cdk P27 aumentou após o tratamento BA, sugerindo um papel no bloqueio do ciclo celular G1 /S. Resultados semelhantes foram obtidos em células DU145 (Recurso Fig. S4).

(A) análise de transferência de Western mostrou que o tratamento BA reduzido os níveis de proteína de ciclinas, Cdks, E2F1, e Rb em LNCaP e células PC3. Em contraste, o tratamento BA aumentaram os níveis de proteína p27 do inibidor de Cdk. (B) tratamento BA diminuiu proteínas pró-sobrevivência AR, AKT, survivina, e Mcl-1, que se correlacionou com um aumento CL-PARP em LNCaP e PC3. AR no PC3 era de transfecção transiente

tratamento BA aumentaram os níveis de clivada-PARP com o tempo em células PC, indicando níveis elevados de caspases activadas e apoptose (Fig 4B;.. Suplementar Fig S4). . Curiosamente, o tratamento BA diminuiu dramaticamente os níveis de proteína de AR em LNCaP e em células transfectadas com AR /DU145 PC3. Além disso, o tratamento BA diminuiu os níveis de proteínas pró-AKT de sobrevivência, a survivina, e Mcl-1. Em contraste, o tratamento BA não reduziu os níveis de proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 e Bcl-xL (Figura 4B;.. Suplementar Fig S4). No geral, estes resultados indicaram que a BA aumentaram seletivamente a degradação de várias proteínas de proliferação e pró-sobrevivência.

degradação de proteínas mediada-BA é dependente da UPS

Estudos anteriores sugerem que o aumento mediado-BA na actividade UPS é uma razão para a degradação da proteína melhorada [6], [8]. Nossos resultados confirmam que, em células LNCaP, as UPS inibidor MG132 bloqueou a diminuição mediada-BA na AR, AKT e proteínas Mcl-1. Além disso, MG132 antagonizou o aumento mediado por BA na morte celular por apoptose, conforme determinado por exclusão de tripano e análise por Western blot da clivagem de PARP-(Fig. 5A). Um mutante de ciclina D1 que não pode ser degradado pelo UPS era resistente à degradação mediada por BA, sugerindo ainda um papel para a UPS (Fig. 5B). No entanto, nossos resultados do ensaio de proteassoma mostrou que a BA não teve efeito direto na atividade UPS em células LNCaP (Fig. 5C). Em contraste com as células LNCaP, BA tratamento de células DU145 e PC3 resultou em actividade significativamente aumentada UPS (Recurso Fig. S5). No geral, estes resultados indicaram que a BA variavelmente actividade melhorada UPS em alguns (DU145 e PC3), mas não todas as células (LNCaP) PC.

(A) ensaio de exclusão com Trypan azul mostrou que 1 uM MG132 antagonizou a morte celular no ba células LNCaP tratados (24 h; *,

P Art 0,02). A análise Western blot mostrou que MG132 bloqueou o aumento mediado-BA de CL-PARP e a diminuição da AR, AKT, e proteínas de Mcl-1. (B) Análise de transferência de Western mostrou que transfectadas ciclina D1 mutante T286A mas não ciclina D1 proteína de tipo selvagem era resistente à degradação mediada por BA (24 h) em células LNCaP. (C) ensaio da actividade do proteassoma mostrou nenhum efeito significativo nas células LNCaP tratadas com ba para 8, 24, e 48 h. A adição de MG132 (MG) para BA resultou em diminuição da atividade.

BA inibe várias Dubs levando a proteínas totais aumentaram poli-Ub em células PC

Nas células LNCaP, um caminho possível BA pode aumentar a degradação selectiva de proteínas sem ativar diretamente a UPS está inibindo Dubs. Neste caso, a inibição da Dubs deve resultar em um acúmulo de proteínas totais de poli-Ub e aumentar a sua degradação pela UPS. Os resultados de Western blot mostrou que o tratamento de células LNCaP BA aumentaram proteínas totais poli-Ub, semelhante ao tratamento MG132 (Fig. 6A). Resultados semelhantes foram também observados em células DU145 e PC3 (não mostrado). Apesar do aumento da poli-Ub, não é claro por que o tratamento BA não tem nenhum efeito sobre a actividade UPS em células LNCaP (Fig. 5C). Em tumores de próstata Vagabundo, tratamento BA também aumentou proteínas Ub conforme determinado por IHC e diminuição da atividade DUB (Recurso Fig. S6). Os resultados de ensaio DUB mostraram que o tratamento de células LNCaP BA reduzida actividade DUB começando às 24 h. Em contraste, o tratamento de LNCaP com 1 nM de docetaxel, uma dose que aumentou a morte celular por apoptose [28], tinham menos efeito sobre a actividade DUB (Fig. 6B). Resultados semelhantes foram obtidos com o tratamento de BA DU145 e PC3 células com a excepção de que inibiu a actividade de BA DUB começando em um momento posterior (48 h) e docetaxel teve um efeito inibidor mais forte DUB em comparação com células LNCaP (Fig suplementar. S7). Em geral, a capacidade de 10 uM para inibir a actividade BA DUB correlacionada com a inibição da proliferação das células (não mostrado).

(A) análise de transferência de Western mostrou que o tratamento de células LNCaP BA (24 h) aumento total de poli- Ub proteínas semelhantes a células tratadas com MG132. (B) ensaio DUB BA mostrou que o tratamento de células LNCaP diminuiu significativamente a actividade DUB às 24 e 48 horas em relação às células de controlo tratadas (= 1) (*,

P

5 × 10

-5 ). Docetaxel (Doc, 1 nM) reduziu a atividade DUB muito menos do que em comparação com BA (*,

P Art 6 × 10

-5). Os lisados ​​de controlo pré-tratados com NEM 4 mM durante 1 h resultou numa diminuição da actividade DUB. (C) DUB rotulagem com análise Western blot com anticorpos anti-HA HA-UbVS e mostrou que a BA (10 uM), mas não doe (1 nM) inibiu vários dobragens em células LNCaP de 24 e 48 h. As bandas de proteína 1-6 mostrou uma diminuição da actividade com o tratamento BA Considerando banda 7 não. Os lisados ​​de controlo sem adição de HA-UbVS ou pré-incubadas com NEM durante 1 h, foram os controlos. Marcadores de peso molecular (kDa) são apresentados à esquerda. Coomassie mancha azul de proteína total foram carregando controles.

Para determinar ainda se BA pode inibir Dubs em células LNCaP, utilizou-se um ensaio de rotulagem DUB com HA-UbVS, um inibidor potente e irreversível, e específico da maioria dos Dubs [33]. Desde HA-UbVS única liga a Dubs ativos, a tag HA permite a rotulagem dos Dubs ativos presentes em células LNCaP após o tratamento BA e análise por western blot. Os nossos resultados mostraram que o tratamento de células LNCaP BA diminuiu várias dobragens em 24 e 48 horas em comparação com células de controlo (Fig. 6c). Em contraste, o tratamento de células LNCaP com docetaxel não teve nenhum efeito sobre a actividade DUB. Resultados semelhantes foram obtidos em células DU145 e PC3 (Fig complementares. S8A, B). No geral, estes resultados sugerem que a BA inibiu vários Dubs, resultando em aumento de proteínas poli-UB, que provavelmente foram rapidamente degradada pela via UPS.

BA não tem nenhum efeito sobre a atividade DUB em células não-cancerosas

BA é relatado para ser um agente contra o cancro mais selectivos em comparação com as células normais, mas os mecanismos pelos quais isto ocorre não foram determinadas [34], [35]. Porque os nossos resultados em camundongos TRAMP mostrou que o tratamento BA não reduziu os níveis de proteína AR na próstata não canceroso, buscou-se determinar o efeito da BA em células não-cancerosas, utilizando BJ prepúcio humano células de fibroblastos. células BJ tratados com BA, durante 72 h não aumentou a morte celular ou clivado-PARP em comparação com células de controlo tratadas (Fig. 7A). Em contraste, o tratamento de células BJ com uma doxorrubicina uM (uma droga que danificam o ADN) resultou em morte celular substancial e clivado-PARP. Os nossos resultados mostraram que o tratamento adicional BA não diminuiu os níveis de AR ou aumentar proteínas totais poli-Ub em células BJ como em células LNCaP (Fig. 7B, C). Finalmente, mostrou que a BA não teve nenhum efeito sobre a actividade DUB em células BJ, ao contrário do que foi observado em células PC (Fig. 7d e suplementar Fig. S8C). Resultados semelhantes foram obtidos utilizando IMR-90 e células MRC-5 de fibroblastos de pulmão de feto humano (Recurso Fig. S9).

(A) ensaio de exclusão com Trypan azul mostrou que a BA não aumentou a morte celular em fibroblastos após 72 BJ h. Em contraste, o tratamento de células BJ com doxorrubicina (Dox) aumento da morte celular. A análise Western blot mostrou que Dox mas não BA aumentaram cl-PARP. (B) Western blot mostrou que a BA não teve efeito sobre os níveis de proteína AR nas células BJ.