Abstract

A perda de metilação do genoma é uma característica comum de câncer, e o grau de hipometilação tem sido correlacionada com a instabilidade do genoma. metilação global de elementos repetitivos possivelmente surgiram como um mecanismo de defesa contra os elementos de DNA, incluindo parasitas retrotransposões e agentes patogénicos virais. Dadas as alterações de metilação global em ambas, infecção viral e câncer, examinamos os níveis de metilação do genoma na cabeça e carcinoma de células escamosas do pescoço (CECP), um câncer causalmente associada com o vírus do papiloma humano (HPV). Nós ensaiadas níveis hipometilação globais em 26 amostras CECP, em comparação com o tecido normal adjacente combinado, utilizando ensaios de metilação baseados em pirossequencia�o para repete LINE. Além disso, examinamos linhas celulares derivadas de uma variedade de tumores sólidos para a linha e SINE (

Alu

) repete. O grau de LINE e

Alu

hipometilação variou entre as diferentes linhas celulares de cancro. Houve apenas correlação moderada entre linha e

Alu

níveis de metilação, com a gama de variação nos níveis de metilação sendo maior para os elementos de linha. LINHA hipometilação foi mais pronunciado em HPV-negativos do que em tumores HPV-positivos. Além disso, a instabilidade genómica, tal como medido por análise de todo o genoma de perda de heterozigosidade (LOH) polimorfismo de um único nucleótido (SNP), foi maior em amostras de CECP com hipometilação LINHA mais pronunciada. hipometilação global foi variável para CECP. Sua correlação com tanto status do HPV e do grau de LOH como um substituto para a instabilidade do genoma pode refletir vias oncogênicas alternativos em HPV-positivos contra tumores HPV-negativos

Citation:. Richards KL, Zhang B, Baggerly KA, Colella S , Lang JC, Schuller DE, et ai. (2009) hipometilação Genome-Wide em Câncer de Cabeça e Pescoço é mais pronunciado em tumores HPV-negativos e está associada com a instabilidade genômica. PLoS ONE 4 (3): e4941. doi: 10.1371 /journal.pone.0004941

editor: Sebastian D. Fugmann, National Institute on Aging, Estados Unidos da América

Recebido: 17 Setembro, 2008; Aceito: 13 de fevereiro de 2009; Publicado: 18 Março 2009 |

Direitos de autor: © 2009 Richards et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pela Fundação Kleberg, Estado do Texas tabaco fundos de pesquisa, uma subvenção de pesquisa institucional do Texas tabaco fundos de liquidação (University of Texas MD Anderson Cancer Center) e DoD W81XWH-05-2-0027 a RK. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

metilação do ADN é um ADN modificação epigenética que ocorre através da acção da ADN metiltransferases em dinucleótidos CpG. regiões metiladas de ADN estão associadas com a remodelação da cromatina, ocorrendo geralmente em áreas de mais cromatina condensada e diminuiu a actividade de transcrição [1], [2]. O interesse renovado neste processo surgiu depois reconheceu-se que dois tipos de padrões de metilação aberrante estão presentes em células de cancro [1], [3]. O primeiro é específico para o gene hiper-metilação, onde as ilhas de CpG nas regiões promotoras de genes adquirem aumento metilação, geralmente levando a expressão reduzida do gene a jusante. A segunda é a de todo o genoma de hipo-metilação, uma grande percentagem dos quais ocorre em elementos de ADN repetitivos. Em malignidade, metilação global está muitas vezes aberrantemente reduzida, enquanto que a metilação específico do gene é muitas vezes aberrantemente aumentada. Enquanto os efeitos da hipermetilação do gene-específico (

por exemplo

, redução da expressão de um gene que é importante para o controlo do crescimento) são facilmente apreciado, os efeitos de redução da metilação global são mais vago [1], [3].

foi posta a hipótese de que a metilação do DNA inicialmente desenvolvido como um mecanismo de defesa contra agentes patogénicos virais de ADN e outros como uma forma de silenciar sequências de DNA estranho [4] – [6]. Isto é consistente com a observação de que LINE e SINE (

Alu

) elementos, provenientes de elementos transponíveis, são altamente metilado em células normais. A metilação do genoma viral do HPV na integração no genoma do hospedeiro tem sido relatada, e as alterações na metilação do ADN de HPV têm sido associados com a tumorigénese [7], [8].

metilação global também é clinicamente relevante, como demonstrado por associações entre os resultados clínicos e os níveis de metilação globais de um número de tipos de cancro [9] – [11]. De um ponto de vista mecanístico, metilação global parece estar relacionado com a progressão do cancro, uma vez que a perda de metilação global, tende a tornar-se mais pronunciada à medida que progridem lesões pré-cancerosas [12], [13]. Além disso, em células cancerígenas do cólon, perda de metilação linha é inversamente correlacionada com instabilidade de microssatélites e está directamente correlacionada com a instabilidade cromossômica [14], [15].

A hipótese de que os níveis de metilação globais em câncer, representados pelos níveis da linha e SINE (

Alu

) metilação, pode ser correlacionada com a infecção viral. Nós, portanto, analisou LINHA metilação em relação ao status do HPV no câncer de cabeça e pescoço. Em contraste com a cancros cervicais, as quais são quase todas associadas com a infecção pelo HPV, HNSCC viralmente é mediada em apenas um subconjunto de casos (25-30%) [16]. Para determinar o impacto da infecção viral em níveis de metilação globais em CECP, desenvolvemos ensaios de metilação baseada pyrosequencing para elementos de ADN repetitivos e comparado HPV-positivos com cancros HPV-negativos. publicações anteriores sugeriram que a metilação LINHA é variável em CECP, mas não encontrou uma associação entre níveis de status e metilação de DNA LINHA HPV [17], [18]. Aqui nós mostramos que hipometilação global é variável em CECP e correlaciona-se com tanto status de HPV e instabilidade genômica.

Resultados

LINE /SINE (

Alu

) ensaios são precisos e reprodutíveis , mas apresentou correlação apenas moderada entre lINE-1 e

Alu

níveis de metilação

para analisar os níveis de metilação globais, nós adaptamos a nossa análise de metilação ensaio baseado em pirossequencia�o (PMA) [19] para avaliar a metilação da Linha repetitivo e SINE (

Alu

) elementos, ensaios de metilação semelhante ao genoma-largas relatado anteriormente [20]. Para validar os ensaios, foi realizada uma série de ensaios: (1) misturar as experiências com quantidades conhecidas de ADN metilado /não metilado; (2) estudos de metilação em uma variedade de linhas celulares de cancro para comparar LINE para metilação SINE e para o levantamento de metilação global em uma ampla gama de doenças malignas; e (3) a metilação de amostras de diferentes idades e sexos para eliminar esses fatores como possíveis fatores de confusão das medições de metilação global.

incrementos gradual de DNA metilado foram preparadas misturando DNA universalmente não metilado (U2M.L) com universalmente metilado (UM.L) de ADN em várias proporções. As amostras misturadas foram então tratado com bisulfito e submetido a ensaios de

Alu

(SINE) nosso PMA LINE-1 (linha) e. Análise de regressão linear mostrou que LINE-1 e

Alu

níveis de metilação foram muito intimamente associada com níveis previstos pela fração de entrada de DNA metilado (

r

= 0,995,

p viajantes – valor 0,0005 para lINE-1, e

r

= 0,980,

p

-valor 0,0005 para

Alu

; Figura S1). Deve notar-se que, mesmo quando o ADN de entrada foi totalmente metilada, a percentagem de metilação máximo global tal como medido pelo ensaio de PMA é um pouco mais de 50%, não é 100%. Isto é porque os elementos repetitivos individuais têm divergido em sequência ao longo do tempo; e dinucleótidos CpG, se mutado para dinucleótidos TPG, são indistinguíveis de CpG não metilados após o tratamento com bissulfito. Este nível de ruído de fundo é tomado em consideração pela normalização cada resultado para o controle universalmente metilado (

ou seja

, relatando a percentagem de referência metilado, ou PMR).

Quatro piscinas de amostras de DNA normais ( a partir de leucócitos de sangue periférico) foram gerados para avaliar a influência da idade e sexo em lINE-1 e

Alu

níveis de metilação. Cada pool (mulheres ≤40 anos de idade, os machos ≤40 anos de idade, fêmeas 40 anos de idade, machos 40 anos) continham DNA de pelo menos cinco indivíduos. Não houve diferenças por sexo ou idade-dependente entre as piscinas de LINE-1 ou

Alu

níveis de metilação (dados não mostrados).

Cada linha-1 e

Alu

metilação ensaio foi testado num painel de 23 linhas de células cancerosas. Diferentes locais CpG foram comparados por meio de três distintas LINE-1 ensaios e três

Alu

ensaios distintos, cada um derivado de diferentes regiões do

Alu

seqüências consenso LINHA-1 e, respectivamente (Tabela 1). Como controle, também testamos sete linhas normais linfoblastóides celulares, que mostraram níveis normais de metilação (todo o 80% em nossa linha 1 ensaios). Em contraste, como esperado a partir de relatórios anteriores [12] – [14], [21], muitas das linhas de células tumorais mostraram hipometilação global, que foi mais pronunciado nos ensaios LINE-1 (Figura 1). Para verificar a consistência entre a linha e os níveis de metilação do SINE (representado por nossa linha-1 e

Alu

ensaios, respectivamente), que comparou o grau de correlação entre os resultados dos três LINE-1 ensaios, entre os resultados da três

Alu

ensaios, e entre os vários lINE-1 e

ensaios

Alu. análise de regressão linear mostrou que as LINE-1 resultados dos ensaios individuais foram altamente correlacionados entre si, por exemplo,

r

= 0,93 para a correlação entre os resultados do ensaio L1-2 e L1-3 (Figura S2A). O mesmo alto grau de correlação estava presente entre os resultados do

Alu

ensaios, por exemplo

r

= 0,82 para a correlação entre a Alu-1 e Alu-3 os resultados do ensaio (Figura S2B) . No entanto, LINE-1 Resultados de ensaio foram apenas moderadamente correlacionada com a

Alu

resultados do ensaio, por exemplo,

r

= 0,33 comparando L1-1 e Alu-1; Figura S2C). Um nível semelhante de correlação moderada entre LINE-1 e

ensaios

Alu foi relatado anteriormente em tumores neuroendócrinos [22].

A.

Alu

metilação utilizando o ensaio Alu-3. B. LINHA-1 utilizando o ensaio de metilação L1-3. Os resultados são relatados como a RMP (por cento referência metilado) normalizado para o ADN metilado referência universalmente. Universalmente não metilado (U2M), universalmente metilados (UM) controles e DNA de controlo normal da PBL também são mostrados.

LINE-1 hipometilação do CECP amostras de pacientes

Matching , tumor normal, primário, e, quando disponível, metástases em linfonodos de amostras de cabeça e pescoço do paciente (Tabela S1) foram testados usando nossos ensaios PMA lINE-1 (Figura 2). Devido à maior gama dinâmica do ensaio LINHA-1 e valores de amostra limitado, apenas a linha-1 Os ensaios foram realizados durante o resto do estudo. Em geral, os tumores primários e CECP linfonodos metastáticos foram hypomethylated comparação com os seus correspondentes tecidos normais adjacentes. Com o ensaio LINE1-1, o PMR tumor primário média foi de 65,5%, enquanto o PMR normais média foi de 90,0% (

p

-valor = 6,7 × 10

-8 usando um emparelhado

t

-teste). No entanto, houve um pouco de variabilidade nos tumores primários, variando de 31,2% (hipometilação grave) a 90,8% (normal). O PMR significativo nas metástases dos nódulos linfáticos (73,8%; 31,8% gama -93,8%) também foi altamente variável, até mesmo no que diz respeito ao tumor primário correspondente, por vezes inferior e, por vezes mais elevada do que a RMP do tumor primário com o qual está associado.

tumor emparelhados e amostras normais e, quando disponível, metástases linfáticas foram analisadas para lINE-1 metilação. valores da RMP são plotados usando o PMR amostra normal como o x-valor e tumor primário (círculos) ou metástase (triângulo) PMR como o valor y. As linhas horizontais representam valores da RMP para universalmente metilação (UM) e os controles não metilados (U2M), linfócitos normais (verde) e por quatro linhas de células de carcinoma epidermóide (amarelo). Os diagramas de caixa à direita mostram a média e distribuição dos tumores primários e metástases no subconjunto de amostras, onde combinava metástases e tumores primários estavam disponíveis.

tumores HPV-positivos reter mais metilação LINE-1 do que HPV tumores -negative

Porque não havia tanta variabilidade no tumor HNSCC PMR, a hipótese de que o nível de hipometilação global possa variar em diferentes subgrupos de CECP. Para explorar a relação entre perda de LINE-1 hipermetilação e status do HPV, comparamos o nível de metilação média LINE-1 de três grupos que diferiam por seu status HPV. O primeiro grupo (n = 8) foi negativo HPV (- /-); o segundo grupo (n = 8) continha DNA de HPV, foram ainda transcricionalmente silencioso no que diz respeito aos do oncogene viral E6, indicando falta de expressão do presente oncoproteína (+/-). O terceiro grupo de tumores (n = 8) foi positivo para o ADN de HPV e a expressão de E6 (+ /+). O nível médio de metilação dos três grupos de tumores é estatisticamente diferente, com um

p

-valor = 0,011 para a tendência (Figura 3).

Os diagramas de caixa de níveis de metilação (PMR) de tumores primários CECP (à direita em cada par) e tecido adjacente normal (à esquerda em cada par) são mostrados de acordo com o status do HPV. + /+, O HPV-positivas e expressam ARNm virais E6; +/-, HPV-positivo, mas transcricionalmente silencioso; e – /-, HPV negativo

Também comparamos os níveis de metilação globais em tecidos adjacentes normais combinadas dos mesmos três grupos.. Em contraste com os resultados para os tumores primários, não houve diferenças nos níveis de metilação globais nos tecidos normais correspondentes e, portanto, nenhuma correlação com o estado de HPV (Figura 3). Com base em uma associação previamente relatada entre LINE-1 metilação e estágio TNM [18], nós olhamos para tal associação em nosso conjunto de amostras, mas não encontrou nenhum (

p

-valor = 0,31).

Níveis de lINE-1 hipometilação e LOH em tumores CECP estão correlacionados

linhas celulares de cancro do cólon com hipometilação lINHA mais pronunciados foram previamente relatado para ter um maior grau de LOH [14], [15]. Para examinar se essa correlação realizada verdade em nossas amostras HNSCC paciente, foi realizada uma análise de LOH globais usando dados 10K SNPChip. Genótipos foram comparados entre o tecido normal adjacente e amostras de tumor combinados; loci informativos eram aqueles que eram heterozigóticos no tecido normal. A Figura 4 mostra um gráfico da percentagem de loci informativo para cada tumor primário com LOH versus o grau de metilação LINHA-1 na mesma amostra. Nós atender a uma tendência linear aos dados, que mostrou uma correlação de Pearson de -0,494, com um

p

-valor = 0,017. Como uma verificação de robustez, também calculada a correlação de Spearman (base-rank), que também foi significativa. O coeficiente de correlação de Spearman para esta relação foi -0,428 (

p

-valor = 0,042), estabelecendo que LOH foi de fato significativamente correlacionada com o grau de hipometilação LINE.

metilação LINE-1 é plotado como PMR, e LOH é a fracção de 10K SNP loci que mostram LOH em relação a todos os loci informativo. coeficiente de correlação de Pearson é -0,494 (

p

-valor = 0,01) para a correlação entre os dois valores.

Discussão

Nós desenvolvemos vários LINE (LINE- 1) e SINE (

Alu

) ensaios de metilação com iniciadores de PCR em regiões conservadas desses elementos repetitivos. Estes ensaios utilizam vários sites CpG (3-6) para determinar os níveis de metilação e permitem a amplificação simultânea de muitos elementos de linha individuais e SINE em todo o genoma humano como marcos genômicas representativas para uma análise de metilação global. Tal como esperado, os resultados a partir da linha 1-indivíduo ensaios foram muito bem correlacionada com os resultados de outros ensaios LINHA-1, apesar de medição metilação em diferentes regiões da sequência LINHA-1. O mesmo é verdadeiro para

Alu

ensaios, com alta correlação entre os resultados dos três ensaios diferentes. No entanto, quando a linha-1 e

Alu

níveis de metilação foram comparados uns com os outros, a correlação foi mais modesta, apenas cerca de 40%. As razões para esta menor correlação pode estar relacionada simplesmente a diferenças na sensibilidade do ensaio: Linha-1 ensaios variou de 0-50% metilado em estudos de mistura, enquanto o

Alu

ensaios tinham menos amplitude, variando de 0-30% metilado, possivelmente secundário a maior ruído de fundo inter-individual, devido à variação de sequência entre o indivíduo

Alu

elementos (Figura S1). Outra possibilidade é que não existe uma diferença funcional ou biológica entre os dois tipos de DNA repetitivo na sua manutenção metilação. repetições de linha são mais frequentes em regiões do gene pobres do genoma, enquanto

Alu

elementos são mais comuns em regiões ricas em genes [23]. Uma vez que a metilação global pode ser medida por uma variedade de métodos, estas diferenças inter-ensaio deve ser considerado quando se comparam os resultados obtidos utilizando diferentes tipos de ensaios e estudos.

Os nossos resultados mostram diminuições na metilação global, em linhas de células a partir de uma variedade de tipos de células de cancro (Figura 1), semelhante aos resultados previamente publicados para uma variedade de tipos de tumores [12] – [14], [21]. Vale a pena notar que as linhas celulares de cancro em geral tinham níveis mais baixos de metilação do que as amostras CECP, reflectindo talvez mais tempo para acumular a perda de metilação ou a natureza clonal destas linhas celulares. No entanto, algumas linhas de células (por exemplo, RKO) teve pouca ou nenhuma perda de metilação. Isto implica, como para os tumores CECP primária, que existe uma variabilidade na biologia subjacente. Mais investigação sobre o que faz com que esta variabilidade poderia fornecer informações importantes sobre as vias de e o papel das alterações epigenéticas na progressão do câncer.

Nossos resultados demonstram uma correlação positiva entre a manutenção da metilação linha normal e HPV-positividade. Além disso, a manutenção da metilação linha normal também foi correlacionada com menos LOH ou instabilidade do genoma. Se LOH é vista como um substituto para a instabilidade cromossoma (CIN), este resultado é consistente com o resultado relatado anteriormente que os cancros do cólon, também têm uma associação entre CIN e perda de LINHA hipermetilação [14], [15]. Assim, é tentador especular que a metilação LINE e CIN são causalmente relacionada, talvez via conhecida associação de metilação com embalagens mais densamente cromatina, que pode se traduzir em maior fidelidade durante a segregação cromossômica e, portanto, menos LOH. No entanto, nossos resultados e resultados previamente relatados são puramente correlata; estudos funcionais serão necessários antes que esta relação causal pode ser estabelecida.

O novo achado em nossos resultados é que HPV-positividade está correlacionada com a manutenção da metilação LINE. Um estudo epidemiológico recente identificação de fatores de risco para LINE-1 hipometilação relataram nenhuma associação significativa entre o estado de DNA do HPV e LINE-1 níveis de metilação [17]. No entanto, não houve diferenças metodológicas entre isso e o nosso estudo, incluindo o uso de tanto o DNA de E6 de HPV e o estado de ARN na atribuição do estatuto de HPV, a utilização de um ensaio de metilação diferente, e a utilização do nível de metilação como variável contínua na análise. Embora Furniss e seus colegas não mostraram uma associação direta, eles mostraram que os resultados variaram de acordo com LINE-1 níveis de metilação para tumores HPV-negativos [23]. Mais estudos são necessários para esclarecer a associação entre infecção por HPV e metilação LINE. Uma hipótese possível é que em uma tentativa de silenciar o vírus HPV, células infectadas induzir uma resposta metilação mais exuberante, remetendo às origens da metilação como um mecanismo de defesa viral. Embora este irá novamente requerem estudos mecanicistas ou talvez estudos em tipos adicionais de cancros mediados por vírus (por exemplo, hepatite B e C, quando comparada com HCC mediada por vírus não-HCC induzida, ou EBV + linfoma contra linfoma EBV) para estabelecer a causalidade, os nossos resultados junto com os de Furniss e colegas [17] certamente proporcionar mais apoio para a hipótese de que HNSCC HPV-positivos e HNSCC HPV-negativos representam entidades biológicas distintas que surgem por meio das vias oncogênicas separadas.

Em resumo, nós desenvolvemos vários novos lINHA (lINE-1) e SINE (

Alu

) ensaios de todo o genoma de metilação, que nós aplicados para determinar o estado de metilação de uma variedade de linhas celulares de cancro e amostras de tumor primário CECP. Nós achamos que linhas celulares de cancro em geral, têm diminuído os níveis de metilação de elementos repetitivos. Ainda mais variabilidade na LINE-1 metilação foi observado nas amostras CECP. Importante, nós descobrimos uma correlação entre HPV-negatividade, o aumento da instabilidade genômica, e perda de metilação do genoma. Esta correlação reforça o conceito de que os cancros HPV-positivos e HPV-negativos são biologicamente distinta e fornece uma base para futuros estudos para definir melhor o mecanismo biológico subjacente a estas conclusões.

Materiais e Métodos

Paciente amostras e linhas celulares

tumor Matched /amostras de tecidos normais adjacentes, e quando as metástases em linfonodos cervicais disponíveis a partir de pacientes com CECP foram coletados na Universidade Estadual de Ohio, como descrito anteriormente (Tabela S1) [24]. O ADN genómico foi extraído a partir da fase de ADN-proteína dos tecidos TRIzol-extraídos de acordo com as sugestões do fabricante (Invitrogen). O DNA foi extraído usando o kit PureGene (Gentra) em peletes de células a partir de quatro linhas celulares CECP (SCC-4, SCC-9, SCC-15 e SCC-25), linhas celulares de cancro do pulmão (H1395 cinco, H520, H2170, SK- MES-1 e SW-900), uma linha de mama de células de cancro (MCF7), uma linha celular de cancro do colo do útero (HeLa), linhas celulares de cancro três cerebrais (U251, SK-N-AS e M059K), linha celular de cancro uma uterino ( AN3CA), uma linha de células de sarcoma (HT1080), linha de células de câncer de um rim (HEK293) e linhas celulares de cancro de seis pontos (LoVo, SW48, HCT-15, DLD-1, COLO 320DM e RKO) de acordo com as sugestões do fabricante. Além disso, o ADN da linha de células linfoblastóide BL1395 foi utilizado como um controlo correspondente para H1395. Todas as linhas de células estão disponíveis de ATCC (Manassas, VA).

piscinas normais e controles metilados

Quatro grupos de amostras normais foram gerados representando diferentes sexos e idades. Amostras de DNA foram obtidas de doadores de sangue anônimos e foram um presente do Dr. Michael J. Siciliano (University of Texas M. D. Anderson Cancer Center). Três das piscinas (mulheres com mais de 40 anos de idade, do sexo feminino com 40 anos ou menos, e os machos de 40 ou menores de idade) foram cada um composto por cinco indivíduos por piscina. A quarta piscina (homens com mais de 40 anos de idade) era composta por seis indivíduos. Comercialmente preparado universalmente metilado e o ADN não metilado universal (UM.C e U2M.C, respectivamente) foram obtidos a partir de Chemicon. UM.L (DNA metilado universalmente) foi gerado como um controlo positivo tratando DNA normal de leucócitos no sangue periférico (PBL) com o CpG metilase

M.Sss

I (New England Biolabs) [25]. U2M.L (ADN não metilado universalmente) foi gerado como um controlo negativo, amplificando o mesmo DNA usado para gerar o ADN de controlo positivo utilizando o kit GenomiPhi (GE Healthcare) como descrito pelo fabricante.

iniciadores e condições de PCR

iniciadores de PCR e iniciadores de sequenciação foram projetados usando software PSQ Ensaio projeto (Biotage) [26]. Três ensaios para SINE (

Alu

) elementos e três ensaios para a Linha 1-elementos foram projetados (Tabela 1). A PCR foi realizada numa reacção de 25 ul contendo Qiagen HotStart Taq master mix (Qiagen) usando 1 ml de bissulfito de ADN tratado (10 ng de ADN equivalentes). Para reduzir o custo por ensaio, o protocolo de amplificação foi desenvolvido utilizando uma abordagem universal iniciador biotinilado. As concentrações finais eram de 10 nM de iniciador do iniciador atado com o iniciador universal, 100 nM do primário sem cauda, ​​e 90 nM de iniciador biotinilado universal em cada reacção [19]. A amplificação foi realizada nas seguintes condições: desnaturação a 95 ° C durante 5 min, seguido de 45 ciclos a 95 ° C durante 30 seg, 45 ° C (SINEs) ou 53 ° C (linhas) durante 1 min, 72 ° C durante 45 seg, e uma extensão final a 72 ° C durante 7 min [19].

PyroMethA (PMA) e metilação avaliação

conversão de bissulfito de ADN genómico foi feito como anteriormente relatado [ ,,,0],19]. Resumidamente, 0,5-1,0 ug de ADN genómico foi tratado usando o kit de ADN CpGenome modificação (Chemicon), incluindo o DNA de sulfonação, desaminação, dessalinização, dessulfona�o e recuperação. ADN tratado com bissulfito foi armazenado a -20 ° C até à sua utilização. PMA é uma tecnologia baseada em pirossequenciao que pode analisar metilação de CpG em locais múltiplos num único ensaio. Depois de uma amplificação por PCR utilizando o ADN tratado com bisulfito, pirossequenciao foi realizada utilizando o sistema PSQ96HS (Biotage) de acordo com o protocolo do fabricante, incluindo único filamento de proteína de ligação (reagentes PyroGold). Os resultados foram analisados ​​usando o software Q-CpG (Biotage), que calcula a porcentagem de metilação (

mC /(

Mc + C)) para cada site CpG, permitindo comparações quantitativas. O índice de metilação (chamado MI) foi calculado como o valor médio de

mC /(

Mc + C) para todos os locais CpG examinados no ensaio. Em geral, não foi muito boa concordância dos níveis de metilação entre os locais CpG individuais no mesmo ensaio. -Tratada bissulfito UM.L foi utilizado como a referência universal metilado. dados PMA para estes ensaios de metilação globais são apresentados como uma percentagem do valor de referência metilado (PMR), normalizando o MI de cada amostra para o MI da referência universalmente metilado (UM.L) DNA [25].

comercial DNA metilado universalmente (UM.C) e DNA universalmente não metilado (U2M.C) (Chemicon) também foram utilizados para realizar esta análise, eo resultado foi linear (

r

= 0,983,

p

-valor 0,0005 para lINE-1; Figura S1). No entanto, disponível comercialmente U2M não estava completamente não metilada, uma vez que uma amostra pura tinha U2M.C metilação residual de cerca de 26%, a partir de diferentes U2M.L preparados no nosso laboratório, o qual tinha 0% de metilação esperado. Nós, portanto, utilizado o nosso próprio DNA universalmente não metilado (U2M.L) para todos os estudos posteriores.

Detecção de HPV16 E6 DNA e RNA E6 para determinar o status HPV

Quantitative PCR em tempo real foi realizada para detectar, quer de HPV16 E6 de ADN ou de ADNc de E6 utilizando o mesmo iniciador /sonda para ambos. Os iniciadores foram concebidos utilizando o serotipo de HPV16, que responde por ≥90% de todos os casos CECP HPV-positivos [27]. Para controlar possíveis contaminações do ADN genómico no cDNA, a amplificação de ADNc a partir de ARN tratado com ADNase, que tinha sido preparado utilizando o First Strand Synthesis System SuperScript (Invitrogen), ambos com e sem a adição de transcriptase reversa foram comparados. A PCR foi realizada em 25 ul de reacção contendo iQ master mix Supermix (Biorad), utilizando 25 ng de ADN genómico ou 5 uL de ADNc. iniciador de sentido directo (5′-CTGCAATGTTTCAGGACCCA-3 ‘) e o iniciador reverso (5′-TCATGTATAGTTGTTTGCAGCTCTGT-3′) foram adicionados a uma concentração final de 200 nM cada. O Vermelho do Texas sonda marcada em tempo real (5’-TR-AGGAGCGACCCAGAAAGTTACCACAGTT-3 ‘) foi adicionado a uma concentração final de 320 nM. A fluoresceína foi adicionada a cada reacção a uma concentração final de 22:00. Cada reacção foi realizada em triplicado. A amplificação foi realizada nas seguintes condições: desnaturação a 95 ° C durante 8,5 min, seguido de 50 ciclos a 95 ° C durante 15 seg, 60 ° C durante 1 min e analisada em tempo real, usando uma máquina de iCycler PCR e software ( Biorad). As amostras que não amplificam foram marcados como negativos, e todas as amostras foram agrupados em 3 categorias, com base nestes resultados: (+ /+), positivos para ambos E6 DNA e RNA de E6; (+/-), Positivo para o DNA E6, mas transcricionalmente silencioso; e (- /-), negativo para o DNA e RNA de E6. status de HPV foi determinado com sucesso por 24 das amostras CECP 26, e estes foram utilizados para análises posteriores utilizando o status do HPV.

10K SNPChip LOH análise

CECP ADN genómicos foram extraídos utilizando o padrão TriZol- protocolo de extracção; eles foram ainda purificados por precipitação com etanol antes e após a amplificação do genoma completo utilizando o kit de GenomiPhi (GE Healthcare). A Affymetrix 10K

Xba

série 131 contém aproximadamente 11.500 SNPs com um espaçamento médio de 210 kb. protocolos Affymetrix padrão foram seguidos para estes ensaios. Resumidamente, cerca de 250 ng de ADN genómico foi digerido com

Xba

I e depois ligado a adaptadores. A seguir, a amplificação de um iniciador foi realizada por PCR utilizando o sistema GeneAmp 9700 (Applied Biosystems). Após purificação com Qiagen MinElute UF 96, um total de cerca de 20 ug de produto de PCR foi fragmentado e marcado com biotina. A hibridação foi realizada na Affymetrix GeneChip A hibridação forno a 48 ° C durante 16-18 horas. Arrays foram lavadas e coradas com a Affymetrix GeneChip Fludics Station 400 e foram digitalizadas com a Affymetrix GeneArray 2500 Scanner. processamento de imagens foi realizada com software GCOS 1.0 e genótipos foram gerados com GTYPE 2.0 ou software superior.

A análise estatística

A fim de avaliar a associação entre os níveis de metilação e níveis de carga de HPV (a análise semelhante foi também utilizado para analisar a associação entre níveis de metilação e fase TNM), procedeu-se da seguinte forma. Todos os valores de metilação das amostras foram convertidos em fileiras. Um valor em falta para o ensaio LINE1-1, por P2 amostra, foi imputado utilizando o valor P2 do LINE1-3 (correlação entre o LINE1-1 e ensaios LINE1-3 é 0,98). Estas fileiras foram então dimensionado (ponderado) por carga de HPV, com pesos de 0, 1 e 2 para – /-, +/- e + /+, respectivamente. A associação “score” final foi a soma destas fileiras ponderadas. A distribuição nula para esse escore foi avaliada por meio de simulações em que repetidamente alocados amostras de grupos HPV de forma aleatória. Corremos um milhão de simulações, e definimos a nossa

p

-valor como duas vezes a proporção de casos em que a pontuação simulação foi tão grande ou maior do que o que se viu. Nossa simulado

p

-valor era 0,011.

Informações de Apoio

Tabela S1.

características clínicas e moleculares de amostras CECP

doi:. 10.1371 /journal.pone.0004941.s001

(0.12 MB DOC)

Figura S1.

gama dinâmica de PMA LINE-1 e Alu Ensaios. A mistura de experiências foram realizadas para determinar os níveis de metilação PMA medidos com proporções variáveis ​​de ADN universal metilado e não metilado. UM.C e U2M.C representam comercialmente disponíveis (Chemicon) universalmente metilados e não metilados DNAs, respectivamente. UM.L e U2M.L foram gerados a partir do mesmo DNA por na modificação vitro em nosso laboratório

doi:. 10.1371 /journal.pone.0004941.s002

(0,10 MB TIF)

Figura S2.

A análise de correlação de ensaios de metilação global de seno e LINE.