genes

Abstract

Cancro-testículo (CT) são expressos em vários cancros, mas não em outros do que em células da linha germinal tecidos normais. Embora desmetilação de ADN de CpG promotor proximal de genes CT está ligada à sua expressão em cancro, os mecanismos que conduzem a desmetilação são desconhecidos. Para elucidar tais mecanismos optamos por estudar a linha de células Caco-2 do cancro colorectal durante o curso de sua diferenciação espontânea

in vitro

, como encontramos genes CT, em particular

PAGE2, 2B

e

SPANX-B

, ser regulado para cima durante este processo. A diferenciação destas células resultou num mesenquimal-a-epitelial (Met) como evidenciado pelo ganho de marcadores epiteliais CDX2, Claudina-4 e E-caderina, e uma perda concomitante de marcadores mesenquimais vimentina, fibronectina-1 e Transgelin. PÁG2 e SPAN-X-regulação foi acompanhado por um aumento no-translocação dois expressão dez de onze (TET2) e citosina 5-hidroximetilação, bem como a dissociação da proteína heterocromatina 1 e o Polycomb repressivo complexo 2 de proteína EZH2 do promotor proximal regiões destes genes. Reversão de diferenciação resultou em diminuição da regulação da

PAGE2, 2B

e

SPANX-B

, e indução de (EMT) marcadores epiteliais-a-mesenquimal transição, demonstrando a natureza dinâmica do CT regulação de genes neste modelo

Citation:. Yilmaz-Ozcan S, Sade a, B Kucukkaraduman, Kaygusuz Y, Senses KM, Banerjee S, et al. (2014) epigenéticas mecanismos subjacentes à expressão dinâmica de genes do cancro-testículo,

PAGE2

,

2B

e Transição

SPANX-B

, durante mesenquimais-to-epitelial. PLoS ONE 9 (9): e107905. doi: 10.1371 /journal.pone.0107905

editor: Keping Xie, da Universidade do Texas MD Anderson Cancer Center, Estados Unidos da América

Recebido: 17 de maio de 2014; Aceito: 22 de agosto de 2014; Publicação: 17 de setembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Yilmaz-Ozcan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por nr concessão. 112S023 do Comité Científico e Tecnológico Conselho de Investigação da Turquia (TUBITAK) para AOG, uma Young Investigator Award da Academia de Ciências Turco para SB, e por bolsas TUBITAK-BIDEP a SYO e BK. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

-cancro testicular (CT) ou de genes da linha germinal-cancro são expressos em tumores originários de vários tecidos, bem como em células da linha germinativa e trofoblastos normais, mas são geralmente silencioso em outros tecidos normais do adulto [1] – [3]. Mais de 100 genes diferentes CT podem ser agrupados de acordo com a homologia em famílias [2]. Apesar da falta de semelhança de sequência entre os genes CT de famílias diferentes, re-expressão de todos os genes CT em tumores tem sido associada com a desmetilação de resíduos de CpG dentro de suas regiões promotoras-proximal [4]. Esse mecanismo compartilhado da regulação da expressão é mais provável a razão da sua expressão de coordenadas no cancro [5] – [7]. No entanto, o mecanismo exato pelo qual a desmetilação de ADN ocorre em regiões promotoras do gene CT-proximal em cancros é desconhecido. genes CT mostram principalmente um padrão de expressão heterogênea em tumores [8] – [10]; em contraste com a sua expressão em testículos, o qual é demarcado e ordenada [11]. Um estudo em que decorrem-like e não-tronco como células de câncer de mama foram mortos de forma seletiva, revelou que a expressão do gene CT é geralmente uma característica de células mais diferenciadas, não estaminais [12]. Da mesma forma, no melanoma, um subgrupo de células com mais recursos epiteliais expressar genes CT, quando as células com características mesenquimais não [13] fazer. Curiosamente, células de melanoma pode alternar entre estas duas classes

in vivo

, sugerindo que a heterogeneidade do tumor, tal como definido pela expressão do gene CT, pode representar uma fase de transição semelhante ao alternar entre epiteliais e mesenquimais fenótipos. Com efeito, mesenquimal-a-epitelial de transição (TEM) está associada com a indução da expressão do gene CT [14]. Para definir mecanismos envolvidos na regulação da expressão do gene CT no câncer e durante MET, optamos por estudar o modelo de diferenciação espontânea Caco-2 que demonstra características de MET e EMT durante a diferenciação e desdiferenciação, respectivamente. Nossos dados revelam que a regulação dinâmica dos dois genes CT,

PÁGINA

e

SPANX-B

neste sistema modelo, envolve alterações de Polycomb complexo repressivo 2 (PRC2) e proteína heterocromatina 1 ( HP1) de ocupação dentro de suas regiões promotoras-proximal, com as alterações concordantes em TET expressão e citosina hidroximetilação (níveis HMC).

Métodos

linhas de celular, indução de diferenciação e diferenciação des

a linha celular Caco-2 foram obtidas a partir da seiva Enstitusu (Ancara, Turquia). HCT116 (rectal) e linhas celulares de cancro Mahlavu (hepatocelular) foram obtidos a partir de LGC Standards, Middlesex, Reino Unido. Uma linha celular de cancro do pulmão (SK-LC-17) foi de Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, Nova Iorque, EUA. células Caco-2 foram cultivadas em EMEM e outros em meio RPMI, suplementado com 20% de FBS, 2 mM de L-glutamina, MM aminoácidos não essenciais 0,1, 1,5 g /L de bicarbonato de sódio e piruvato de sódio 1 mM. Todos os meios de cultura de células e suplementos foram adquiridos a partir de Biochrom AG, Berlim, Alemanha. As primeiras células atingiram confluência dia foi designado dia 0. As células cultivadas em culturas paralelas foram usadas para determinar as alterações fenotípicas nos dias 0, 5, 10, 20 e 30, pós-confluência. Medidas adicionais de diferenciação para as células utilizadas neste estudo foram relatados em outros lugares [15]. Para induzir desdiferenciação, células no dia 20 de diferenciação foram destacadas e replated em cerca de 50% de confluência e RNA e proteínas foram colhidos 5 dias após repique.

In silico

análise do CT e EMT expressão

dados de expressão de genes contidos GSE1614 [16] foi GC-RMA normalizados utilizando GeneSpring v. 11.0. a expressão do gene CT foi analisada com base em 31 conjuntos de sondas em que corresponde a 23 genes CT a partir de 7 famílias (Figura S2). Uma interpretação foi gerado com uma lista entidade composta por genes relacionados EMT, tal como definido por Loboda et ai. [17], em três momentos diferentes. Genes para validação foram selecionados entre aqueles para os quais diferenças significativas de expressão (p 0,05) foi observada por uma maneira análise de variância e correção de Bonferroni FWER, quando as células em proliferação foram comparados com os no dia 15.

quantitativa RT- PCR

o ARN total foi isolado utilizando o reagente Trizol (Ambion, Foster City, CA, EUA) e tratou-se com ADNase I (Ambion, Foster City, CA, EUA). 200 ng de ARN foi transcrito de forma reversa utilizando revert-Aid kit de síntese de ADNc de primeira cadeia (Thermo Fisher Scientific, Boston, MA, EUA). As reacções de PCR foram realizadas utilizando um termociclador ABI 7500 (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EUA). Todas as reacções foram realizadas de acordo com as recomendações do fabricante. Gene TaqMan Ensaios de Expressão (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EUA) foram utilizados para o seguinte: GAPDH (4352934E), SPANX-B (Hs02387419_gH), PAGE2 e 2B (Hs03805505_mH), GAGE ​​(Hs00275620_m1), SSX4 (Hs023441531_m1), NY-ESO-1 (Hs00265824_m1), e de MAGE-A3 (Hs00366532_m1). SYBR Green Master Mix com corante de referência ROX (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EUA) foi utilizado para determinar

CDH1, CDX2, CLDN4, VIM, FN1

e

TAGLN

expressão (Tabela S1) . As condições de amplificação para estes ensaios foram de 50 ° C durante 2 min., 95 ° C durante 10 min., seguido de 40 ciclos de 94 ° C durante 15 seg., 60-65 ° C durante 1 min. A expressão relativa foi calculada pelo método ΔΔCt [18]. Todas as amostras foram analisadas em triplicado e todas as experiências foram repetidas pelo menos duas vezes.

Análise

metilação do promotor

O ADN genómico foi isolado por tratamento proteinase K, seguindo um protocolo de extracção com fenol-clorofórmio. tratamento bissulfito de 200 ng de ADN genómico foi realizada utilizando o kit DNA Metilação Zymo ouro (Zymo Research, Irvine, CA, EUA). Bissulfito modificado ADN foi armazenado a -20 ° C e usado para PCR dentro de 2 meses. Duas rondas de amplificação de DNA foram realizadas usando uma polimerase Taq polimerase Hot Iniciar ADN (New England Bioscience /NEB, Ipswich, MA, EUA), utilizando um Perkin Elmer 9700 termociclador (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EUA). Os iniciadores utilizados são apresentados na Tabela S1. Os produtos de PCR foram gel extraído utilizando o kit de extracção de gel QIAGEN (Qiagen, Hilden, Alemanha) e clonado em pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). O DNA de plasmídeo foi purificado usando o QIAprep spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha) a partir de, pelo menos, dez clones e analisados ​​por sequência IONTEK (Istambul, Turkey).

5-hidroximetil análise citosina

Caco-2 de ADN genómico (ADNg) foi cortada por sonicação com sonda (30 seg. na, 30 s. largo, 5 ciclos) para obter 200-600 pb. fragmentos avaliada por 1% de análise electroforética em gel de agarose. A imunoprecipitação foi realizada utilizando o kit de hMEDIP (Abcam, Cambridge, Reino Unido) de acordo com as instruções do fabricante. 5 pg de ADN de controlo foi cravado em 500 ng de gDNA para usar como um controlo interno. Os controlos positivos e negativos do kit foram incluídos em todas as experiências. 2 uL do ADN eluído foi utilizado como molde para a RT-PCR quantitativo utilizando 2 X SYBR Green Master Mix com corante de referência ROX (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EUA) com os iniciadores indicados nas Tabelas S1 e S2. eficiências de iniciadores foram controlados. As condições de amplificação foram de 50 ° C durante 2 min., 95 ° C durante 10 min. seguido por 40 ciclos de 94 ° C durante 15 seg., 60 ° C durante 1 min. DNA genômico compartilhada foi incluído na RT-PCR quantitativo para calcular input%.

imunofluorescência microscopia

As células ligadas a lâminas de vidro por centrifugação usando o Shandon CytoSpin3 (Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA) foram imediatamente fixados em formaldeído a 2% /PBS, à temperatura ambiente durante 15 min. As células fixadas foram permeabilizadas em 0,2% de Triton X-PBS durante 10 min. seguida de bloqueamento com BSA a 1% em 0,1% PBS-Tween durante 1 hora. As incubações com o anticorpo primário, diluídos a 1:50, foram realizadas durante a noite a 4 ° C. O anticorpo secundário foi adicionado a 1:200, após lavagem em 0,1% PBS-Tween durante 5 min. por 3 vezes, e incubados com as células durante 45 min. à temperatura ambiente (ver Tabela S3 para a lista completa de anticorpo). amostras coradas foram montadas com meio de montagem (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA) contendo solução DAPI. As linhas celulares utilizadas como controlos positivos foram Mahlavu (PAGE-2, 2B e SPANXB), MDA-MB 231 (VIM), MCF-7 (TAGLN) e SW620 (CDX2, FN1). Os controlos negativos foram combinações de anticorpos primários com anticorpos secundários un-relacionados. Todas as imagens foram obtidas utilizando um dispositivo de captura de imagem AxioCam MRC5 (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanha).

análise de Western

Os lisados ​​celulares (extraiu-se com tampão RIPA) separados em 4-12% Novex Bis geles de SDS-tris (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) foram transferidas para membranas Immobilon PSQ-(Millipore Corp. Bedford, MA, EUA) com um sistema de transferência de western Invitrogen (Invitrogen. Carlsbad, CA, EUA). Após bloqueio com 5% de leite em pó em PBS-T a 0,02%, as transferências foram incubadas com o anticorpo primário durante a noite a 4 ° C. diluições de anticorpos primários foram 1:1000 para CDX2, fibronectina, vimentina e transgelin, 1:2500 para β-actina e 1:100 para SPANX-B e PAGE-2, anticorpos 2b. HRP conjugada com anticorpo secundário (Abcam, Cambridge, Reino Unido) foi utilizado a uma diluição 1:5000 e incubou-se à temperatura ambiente durante 1 hora. Os sinais foram detectadas usando o ensaio de luminescência ECL (BioRad, Hercules, CA, EUA).

Cromatina imunoprecipitação

imunoprecipitação da cromatina (ChIP) foi realizada como previamente descrito [15]. Resumidamente, células constituintes de formaldeído com ligações cruzadas foram precipitadas por proten A contas de Sepharose acopladas a anticorpos contra EZH2, HP-1 ou H3K27m3 (Abcam, Cambridge, Reino Unido), bem como de controlo específica do isotipo. O ADN precipitado foi amplificado utilizando primers específicos para

PAGE2

,

-2

ou

SPANX-B

sequências de promotor (Tabelas S1 e S2), na sequência de-reticulação.

resultados

expressão do gene CT durante Caco-2 diferenciação espontânea (Caco-2 SD)

A linha de células de cancro colo-rectal indiferenciado Caco-2 sofre diferenciação enterocytic após atingir confluência

in vitro [19], [20]. diferenciação progressiva foi observado até 30 dias pós-confluência como evidenciado pelo aumento da regulação de vários genes associados à diferenciação incluindo sacarase-isomaltase, fosfatase alcalina e antigénio carcinoembryogenic (CEA), (Figura S1) [15]. Um

in silico

análise da expressão do gene CT, tal como definido por 31 sondas no conjunto de dados GSE1614, que contém dados de expressão gênica para o modelo SD Caco-2 obtidas durante a diferenciação (proliferando (2

nd dia), -post-proliferação indiferenciada (8

th dia), e pós-proliferação diferenciado (15

th dia)) [16], revelou modesto aumento da regulação de quase todos os genes CT durante a diferenciação (Figura S2). Nós escolhemos para validar a mudança na expressão das famílias gene /genes seis CT por RT-PCR quantitativo em diferenciar as células Caco-2

in vitro

.

GAGE, MAGE-A3, NY-ESO-1