Abstract

Fundo

A epigenética é definida como mudanças hereditárias na expressão gênica que não são baseadas em mudanças na a sequência de ADN. modificação pós-tradução de proteínas histonas é um importante mecanismo de regulação epigenética. O PRK1 quinase (proteína cinase C relacionadas com quinase 1, também conhecido como PKN1) fosforila a histona H3 em treonina 11 e está envolvido na regulação da sinalização do receptor de androgénio. Assim, tem sido identificado como um novo alvo de drogas, mas pouco se sabe sobre inibidores PRK1 e as consequências da sua inibição.

Metodologia /principal achado

Usando uma abordagem de triagem biblioteca orientada, identificamos a lestaurtinib candidato clínico (também conhecido como PEC-701) como um novo inibidor de PRK1. Com base em um modelo 3D gerado da quinase PRK1 usando o homólogo da PKC-teta (proteína cinase C teta) como um modelo de proteína, a interacção com chave de lestaurtinib PRK1 foi analisado por meio de estudos de docking molecular. Além disso, os efeitos sobre a fosforilação da histona H3 e treonina expressão de genes dependente de androgénio foi avaliada em células de cancro da próstata.

Conclusões /Significado

Lestaurtinib inibe PRK1 muito potente in vitro e in vivo. Aplicada à cultura de células que inibe a histona H3 treonina e expressão de genes dependente de androgénio, uma característica que não tenha sido ainda conhecido. Assim os nossos resultados têm implicação tanto para a compreensão da actividade clínica de lestaurtinib, bem como para os inibidores PRK1 futuras

citação:. J Köhler, Erlenkamp L, Eberlin A, T Rumpf, Slynko I, E Metzger, et ai . (2012) Lestaurtinib Inibe a histona fosforilação e expressão gênica andrógeno-dependentes em células cancerosas da próstata. PLoS ONE 7 (4): e34973. doi: 10.1371 /journal.pone.0034973

editor: Irina Agoulnik, Universidade Internacional da Flórida, Estados Unidos da América

Recebido: 09 de fevereiro de 2012; Aceite: 10 de março de 2012; Publicação: 20 de abril de 2012

Direitos de autor: © 2012 Köhler et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm financiamento ou apoio ao relatório

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a epigenética é definida como alterações hereditárias na regulação do gene que não são determinadas por alterações no genoma [1]. processos epigenéticos tem implicações claras para a patologia da doença humana [2], e, portanto, novos inibidores destes são altamente interessante para a descoberta de medicamentos [3]. Entre diversas modificações de histonas [4], a fosforilação de histonas não é tão bem estudada, especialmente no que diz respeito à descoberta de medicamentos. A maior parte dos relatórios estão em Aurora cinases que são bastante envolvidos no controlo da mitose [5]. Outra quinase envolvidas na mitose, que age sobre as histonas é haspin [6], [7]. As cinases [8] PKC-betaín e PRK1

A (também denominado PKN1) [9] desempenham um papel importante na activação de transcrição de genes [10], no decurso de sinalização do receptor de androgénio e PRK1 é considerado para ser um alvo promissor para o tratamento de cancro da próstata. Na busca por novos inibidores PRK1 foi realizada uma triagem biblioteca orientada para identificar novos hits e avaliar os inibidores da quinase de referência em comparação. Identificamos a lestaurtinib candidato clínica (também conhecido como CEP-701) como um novo potente inibidor da quinase PRK1 epigenética.

Resultados

Focada Screening Biblioteca

Como uma partida ponto para a busca de novos inibidores PRK1, usamos a biblioteca Biomol quinase e fosfatase inibidor (n = 84, veja a Figura S4, S5 e S6) para uma triagem inicial a 100 concentração limite nM. Este rastreio identificou apenas a bisindolyl-maleimida (BIM) Ro318220 e a estaurosporina estruturalmente relacionados como acessos (mais de 40% em relação a ligação a estaurosporina a 100 nM) (ver Figura 1 e Tabela 1). Ro318220 já era conhecido para inibir PRK1 [9]. Nós rastreados ainda um 200 composto biblioteca in-house da comercialmente disponíveis e genérico inibidores da quinase, resp. candidatos inibidores. Esses inibidores incluídos padrão quinase como erlotinib, lapatinib, vatalanib, SB203580 e SB216763 (ver Figura 1), que têm sido utilizados ao perfil diferentes quinases antes. Os inibidores de K252a e lestaurtinib e, adicionalmente, SB216763 (interação dados não mostrados) foram seleccionados para o estudo de ancoragem com base na sua semelhança estrutural com a estaurosporina e Ro318220. Os análogos de estaurosporina todas mostram um modelo de ligação semelhante. K252a inibe a trkA, VEGFR2 e MLK1 na região de dois dígitos nM e é conhecido por ter uma selectividade mais de PKC sobre 10-20fold [11]. Lestaurtinib foi relatado como inibindo a trkA, B e C [12], JAK [13] e FLT3. Devido à inibição de FLT3, é estudado clinicamente em mielofibrose e AML [14], [15]. Lestaurtinib K252a e foram ambos ligados por PRK1 com afinidade elevada (ver Tabela 1). Lestaurtinib foi escolhido para posterior avaliação biológica em nosso estudo devido ao seu estado de desenvolvimento avançado e mostraram inibição do gene andrógeno transcrição do gene responsivo.

Modelação Molecular

Um modelo de recursos humanos proteína C quinase relacionada 1 (PRK1) foi gerado por modelagem por homologia para racionalizar nossas descobertas de novos estudos de otimização. O modelo baseou-se na semelhança do PRK1 a proteína cinase C teta (PKC-teta) e foi usada para estudos de encaixe. Uma vez que as estruturas cristalinas disponíveis de subtipos de PKC em complexo com inibidores mostram toda a conformação quinase activa, o modelo PRK1 representa também a conformação activa com o motivo clássica DFG-na (Figura 2) [16]. Os 84 compostos da biblioteca de inibidor de cinase de Biomol, que foram testados no ensaio in-vitro, foram acopladas na bolsa de ligação ao ATP de PRK1. Foram utilizados três métodos de ancoragem diferentes (GOLD [17], Glide [18] e ParaDockS [19]) e cinco funções de pontuação diferentes (ChemScore, GoldScore, GlideScore, ParaDockS p-Score e pontuação AMBER GBSA [20], [21]) . No total, 63 compostos poderia ser encaixado com sucesso no bolso de ligação ATP. Em geral, os diferentes métodos de acoplamento produziram resultados semelhantes, mesmo se a classificação dos compostos foi encontrado para ser diferente (Tabela S1). Os dois inibidores activos da Biomol coleção composto, estaurosporina e Ro318220, foram topo do ranking por algumas das funções de pontuação. Geralmente, em estudos de encaixe e Virtual de uma melhor discriminação entre activos e chamarizes é observada usando uma pontuação de consenso com base numa variedade de diferentes métodos de pontuação [22], [23]. No presente estudo, nós também calculada uma pontuação de consenso utilizando as cinco funções de pontuação normalizada Chemscore, Goldscore, Glidescore, ParaDockS p-score e pontuação GBSA. Usando o marcador de consenso, uma clara discriminação entre os inibidores da estaurosporina altamente activa (Pontuação 9,23) e Ro318220 (Pontuação 9,51) e os compostos inactivos (incluindo os inibidores da quinase inactivos mostrados na Figura 1) pode ser obtido. A única molécula que deu uma alta pontuação semelhante foi o relacionado bisindolilmaleimida derivado 31 (Score de 8,84, Tabela S1, Figura S5), que não apresentaram in vitro a atividade abaixo de 100 nM (dados não mostrados).

a superfície molecular da bolsa de ligação é mostrado. Além das ligações de hidrogênio com a região charneira, o grupo amino protonado de estaurosporina doa ligações de hidrogênio (como laranja linhas tracejadas) para Asp744 e uma molécula de água conservada (mostrada em vermelho).

O arranjo de acoplamento de estaurosporina no local activo da PRK1 mostra que o ligante está completamente enterrado na bolsa de ligao de ATP (Figura 2). Mais importante, a lactama e grupos maleimida de estaurosporina e Ro318220, respectivamente, formam duas ligações de hidrogénio para Glu696 e Ser698, que são parte da região de charneira de PRK1 (Figura 3A e 3D). interacções de Van-der-Waals são observados com a Met695 resíduo gatekeeper, bem como com Val629, Phe626, Leu747, Phe904 e, respectivamente. Além disso, as ligações de hidrogénio entre o grupo amino protonado de estaurosporina, bem como o grupo de tioureia Ro318220 e Asp744 pode ser observada. O grupo amino de estaurosporina, também está envolvido numa ligação de hidrogénio com uma molécula de água conservada e co espinha dorsal de Asp744.

interacções comuns dos inibidores são ligações de hidrogénio que envolvem Glu696 e Ser698 da região de charneira, e Van- interacções der Waals com-o gatekeeper resíduo Met695, bem como com Val629, Phe626, Leu747, Phe904 e. Além disso, alguns dos inibidores de interagir com Asp744, Asn745 e uma molécula de água conservada (esfera vermelha) nas proximidades do Mg

2 + local da quinase vinculativo. A espinha dorsal é mostrado como uma fita roxa. Apenas aminoácidos relevantes são exibidos. As ligações de hidrogênio são mostrados como linhas coloridas laranja tracejadas.

A análise dos poses para conexão de aparelhos de K252a e lestaurtinib mostraram que ambos os compostos interagem da mesma forma com os bolsos de ligação do ATP como estaurosporina (Figura 3B e 3C ). Para além da interacção com a região de dobradiça, os substituintes polares no sistema de anel de tetra-hidrofurano interagir com uma molécula de água conservada ligada a Asp744 e Asn745.

Celular Ensaios

Em seguida, analisamos o efeito de lestaurtinib sobre células de câncer de próstata LNCaP andrógeno responsivo (ver Figura 4) [24]. Um efeito sobre a sinalização mediada pelo receptor de androgénio foi medida usando a quantificação da expressão de ARNm de vários genes-alvo do receptor de androgénio conhecido. blocos Lestaurtinib a expressão de transmembrana protease, serina 2 (

TMPRSS2)

[25], Insulin-like growth factor-1 (

IGF1-R27)

[25], receptor de quimiocinas CXC 4 (

CXCR429)

[26], proteína homeobox NKX-3.1 (

NKX3.1)

[27], quinase associado a células germinais masculinas

(MAK30)

[28] , fibrossarcoma musculoaponeurotic oncogene homólogo (

MAF)

[

29

], subfamília receptor nuclear 4, grupo a, membro 1 (

N4A1)

[29], Gene regulamentada em cancro da mama I

(GREB1)

[30] e proteína de ligação FK506 5 (

FKBP5)

[31] a 5? M, mas não reduz a expressão do gliceraldeído-3-fosfato independente de androgénios desidrogenase (

GAPDH)

gene [31]. Na mesma faixa de concentração, lestaurtinib causou uma hipofosforilação na histona H3 treonina 11 (Figura S7).

A expressão de genes alvo do receptor andrógeno

TMPRSS2

,

IGF1-R

,

NKX3.1

,

CXCR4

,

MAK

,

MAF

,

N4A1

,

GREB1

e

FKBP5

medido por qRT-PCR em androgénio (R1881) estimuladas células de cancro da próstata LNCaP são reduzidos pelo tratamento com lestaurtinib (concentração final de 5 uM). A expressão de ARNm de

gene GAPDH

foi utilizada como um controlo. As barras representam a média + SD (n = 5). P-value: ns = não significativo; * = 0,05; ** 0,01; ***. 0,001

Discussão

histonas modificações tornaram-se um foco de esforços de descoberta de drogas. Inibidores das enzimas que estabelecem essas modificações também são ferramentas valiosas para sondar as vias de sinalização. Identificou-se a lestaurtinib candidato clínico como um inibidor da quinase que afecta PRK1 regulação epigenética e a sinalização do receptor de androgénio. Este novo modo de acção do lestaurtinib não tem sido conhecido até agora e pode ser importante para compreender a sua actividade em ambientes clínicos. As semelhanças estruturais do lestaurtinib em comparação com estaurosporina tornam possível que outras quinases que PRK1 podem contribuir para os efeitos reguladores do gene observada em células LNCaP. No entanto, é de grande importância que lestaurtinib tem um efeito sobre modificações das histonas epigenética e reduz a expressão do gene dependente de androgénio de forma significativa em células de cancro da próstata. Este fato deve ser levado em consideração para futuras avaliações em ambientes clínicos.

Além dos efeitos in vivo de lestaurtinib, a identificação de lestaurtinib e K252a como inibidores PRK1 novos ea falta de inibição da quinase estabelecidas com andaimes como anilinoquinazolinas, anilinophthalazines ou diarylimidazoles fornece informações valiosas para a concepção de inibidores mais e mais seletiva PRK1 como potenciais terapias para cancros dependentes de androgénio.

Materiais e Métodos

Kinase Assay

inibidores de cinase foram adquiridos da Sigma-Aldrich (Lestaurtinib) e Biomol (Ro318220) e usados ​​como obtido. A pureza foi 93% (w /w) em todos os casos conforme indicado pelo fornecedor. rastreio inibidor foi realizada com o LanthaScreen ™ Eu Quinase Binding Assay Kit (Invitrogen) com as concentrações de ensaio final de 5 nM para PRK1 (Proqinase, Freiburg), 2 nM LanthaScreen Eu-anti-GST Anticorpo (Invitrogen) e 10 nM de quinase Tracer 236 (Invitrogen). O ensaio foi realizado em 384 poços placas de microtitulação (Perkin Elmer, Rodgau). O volume final do ensaio foi de 15 uL. A detecção foi feita com EnVision 2102 Multilabel Reader (PerkinElmer, Rodgau, Excitação: 340 nm, 1

st emissão: 665 nm, 2

nd Emissão: 615 nm, tempo de atraso de 100 uS, Tempo de Integração 200 us). A biblioteca inibidor da quinase foi comprado de Biomol (tamanho acadêmica, n = 84 – ex-CAT # 2831A, Figura S4, S5, S6). IC

50 determinações foram realizadas três vezes independentes, cada uma em triplicado.

métodos computacionais

cálculos Al0l foram realizados em um Pentium IV 2.2 GHz com base cluster Linux. Uma vez que a estrutura cristalina da quinase PRK1 humana (UniProt entrada Q16512) não é conhecida, foi gerado um modelo de homologia. Uma pesquisa BLASTP [32] foi realizada para a sequência de aminoácidos PRK1 humano. A maior semelhança foi encontrado para a PKCtheta cinase relacionada. A identidade global de sequências entre a sequência PRK1 humana e a sequência derivada da PKC-teta é de 49% com apenas pequenas aberturas ou inserções na região alinhada. O alinhamento de sequências foi feita com ClustalW [33] (Figura S1). O modelo foi gerado com o Modelador de programa usando as coordenadas da estrutura de raios-X PKC-teta 2jed (Resolução 2,32 A) na conformação ativa. A sobreposição do modelo PRK1 ea estrutura-PKC theta raio X-rendeu um valor RMSD de 0,73 Å para os átomos da estrutura que ilustram a alta similaridade estrutural de ambas as quinases. A qualidade estereoquímica do modelo PRK1 resultante foi analisada utilizando o programa PROCHECK [34]. átomos de hidrogênio e cargas parciais AMBER foram atribuídos. O modelo foi usando o campo de força AMBER [35] minimizado energia. O refinamento levou a um modelo com excelente qualidade estereoquímica com 90,1% dos valores do ângulo phi e psi nas regiões mais favorecidas, e 8,5% nas regiões adicionalmente permitidos (Figura S2). Nenhum resíduo no modelo está localizado na região não permitida.

Ligand Docking

Foram utilizados três programas de ancoragem diferentes (OURO 4.1 [17], Glide [18] e ParaDockS [19]) para doca todas as moléculas para o sítio de ligação de ATP PRK1. Para todos ancoragem corre foram utilizadas as configurações padrão do programa. O local de ligação para PRK1 foi definido em Glu696 com um raio de 15 de uma cobertura da bolsa de ligação de ATP. Uma molécula de água conservada observada nas estruturas de raios-X de PKCbeta PKCtheta e foi considerado como sendo parte da proteína. Goldscore, Chemscore, Glidescore, ParaDockS p-Score e AMBER GBSA [20], [35] pontuação foram escolhidos como funções de aptidão. Para cada molécula, foram realizadas 30 corridas de encaixe. As soluções resultantes foram agrupados na base dos valores RMSD átomo pesado (1 a). Em primeiro lugar, testou-se os programas de acoplamento é capaz de reproduzir o modo de ligao dos ligandos ligados NVP-XAA228, Biomol 33 (Ro318220), e estaurosporina como observado nas estruturas de raios-X da PKC? Teta e PKC-beta, respectivamente ( códigos PDB 2jed.pdb, 1xjd.pdb [36] e 1i0e.pdb [37]). A mais alta precisão foi obtido usando o programa de OURO e Goldscore como função de fitness. Os valores RMSD entre a solução de ancoragem Goldscore topo do ranking e a estrutura cristalina dos inibidores são 0,78 Á, 0,71 Â e 0,49 Á (átomos pesados), respectivamente, o que demonstra a possibilidade de utilização dos programas de encaixe aplicadas para reproduzir as estruturas de determinados experimentalmente da proteína-quinase complexos inibidor.

dinâmica molecular simulações

A estabilidade dos complexos PRK1-inibidores derivados foi examinada por meio de simulações de dinâmica molecular (MD). A estaurosporina inibidor mais activo foi utilizado para esta simulação. MD simulações foram realizadas utilizando AMBER 10 e o campo de força AMBER 1999 [38], [39]. Os parâmetros de campos de força ligando foram retiradas do campo de força geral âmbar (GAFF), ao passo que AM1 ESP cargas parciais atómicas foram designados para o inibidor. Os complexos foram embebidas em uma caixa de moléculas de água TIP3P com uma margem de 10 Â. Antes das simulações MD livres, a dois passos de relaxamento foram realizados; na primeira etapa, mantivemos a proteína fixo com uma restrição de 500 kcal mol

-1

-1. Na segunda etapa, as estruturas inibidoras foram relaxadas para 0,5 ps, durante o qual os átomos de proteína foram contidos para o raio-X coordena com uma constante de força de 500 kcal mol

-1

-1. No passo final, todas as restrições foram removidos e os complexos foram relaxado durante 1 ps. A temperatura do sistema relaxado foi, em seguida, equilibrou-se a 300 K por meio de 20 ps de MD utilizando 2 FS intervalos de tempo. Um limite periódica volume constante foi definido para equilibrar a temperatura do sistema, a dinâmica de Langevin [40] utilizando uma frequência de colisão de 10 ps

-1 e um limite de velocidade de 5 unidades de temperatura. Durante a rotina de equilíbrio de temperatura, o complexo na caixa solvente foi restringida às coordenadas iniciais com uma constante de força fraca de 10 kcal mol

-1

-1. As coordenadas finais da rotina da temperatura de equilíbrio (após 20 PS) foram então usados ​​para completar um 1 ns molecular de rotina dinâmica usando 2 FS passos de tempo, durante o qual a temperatura foi mantida a 300 K por a dinâmica de Langevin usando uma frequência de colisão de um PS

-1 e um limite de velocidade de 20 unidades de temperatura. A pressão do sistema solvatada foi equilibrada em 1 bar, a uma certa densidade num limite periódica pressão constante por um método de escalonamento pressão isotrópica empregando um tempo de relaxação da pressão de 2 ps. O intervalo de tempo das simulações MD livres foi de 2 fs com um corte de 9 Å para a interação não-ligados, e agitar [41] foi empregado para manter todas as ligações que envolvem átomos de hidrogênio rígida. interacções electrostáticas, foram calculados usando o método de partículas de malha Ewald [42]. A simulação MD do complexo PRK1-estaurosporina foi realizada no total para 10 ns. A trama RMSD é mostrado na Figura S3.

Database

As estruturas 3D de os compostos Biomol (Figura S4, S5, S6) foram gerados utilizando o programa de Omega (OPENEYE Software). Todos os isómeros e tautómeros possíveis foram geradas, o que resultou em 265 estruturas 3D. Todos os isómeros gerados foram utilizados para o estudo de encaixe.

AMBER GBSA Scoring

As poses ancorados estavam usando o campo de força AMBER eo modelo contínuo GBSA [21] minimizado energia. Para cada molécula o melhor pose de pontuação foi seleccionado para comparação com os dados biológicos. A minimização foi realizada utilizando uma combinação de descida mais íngreme e algoritmo gradiente conjugado com uma raiz quadrada média de gradiente a 0,001 kcal /mol. encargos AM1-BCC foram designados para os inibidores, e o campo de força Amber99 foi aplicado para a proteína. O ponto de corte não-aderente foi fixado em 16 Å. Todos os átomos pesados ​​da proteína estavam amarrados com uma constante de força de 100 kcal /mol, enquanto que os átomos de inibidor foram relaxadas durante o processo de minimização de energia. O Δ energia livre de ligação

G

é calculado como: onde Δ

E

MM é a diferença de energia entre o complexo ea soma das energias para o ligando livre e proteína livre , Δ

G

solv é a diferença na energia GBSA solvatação do complexo e a soma das energias de solvatação para o ligando livre e proteína livre, e Δ

G

SA é a diferença na energia de superfície do complexo e a soma das energias de área de superfície para o ligando livre e proteína livre.

Análise RT-qPCR

Efeitos sobre genes-alvo do receptor de androgénio eram determinado utilizando PCR em tempo real quantitativa. As células LNCaP foram lavadas uma vez com PBS e, em seguida, após jejum de 24 horas em RPMI 1640 fenol-vermelho livre de, suplementado com 0,5% de soro de vitelo fetal despojado duplo (dsFCS). As células foram então tratadas ou não com lestaurtinib (concentração final de 5 uM) conforme indicado. Se as células não foram tratados com lestaurtinib, DMSO foi adicionado como veículo. 10 minutos após a adição de lestaurtinib ou o veículo, as células foram tratadas durante a noite com ou sem R1881 (10

-9 M), como indicado. ARN tratado com ADNasel, isolado utilizando Trizol (Invitrogen), foi utilizado para a transcrição reversa. PCR quantitativa foi realizada num LightCycler 480 (Roche). A formação do produto foi detectada por incorporação de SYBR Green ROX I, utilizando como referência passiva (ABgene). Para qRT-PCR, foram utilizados os seguintes iniciadores:

TMPRSS2

[25] 5′-TCACACCAGCCATGATCTGT-3 ‘e 5′-CTGTCACCCTGGCAAGAATC-3’;

IGF1-R

[25] 5′-CTGTATGCCTCTGTGAACC-3 ‘e 5′-TAGACCATCCCAAACGAC-3’;

NKX3.1

[27] 5′-AGAACGACCAGCTGAGCAC-3 ‘e 5′-AAGACCCCAAGTGCCTTTCT-3’;

CXCR4

[26] 5′-CTGTGAGCAGAGGGTCCAG-3 ‘e 5′-ATGAATGTCCACCTCGCTTT-3’;

MAK

[28] 5′-TGGACTTGCAAGAGAATTAAGGT-3 ‘e 5′-CTTCAGGGGCACGATACC-3’;

MAF

[29] 5′-AGCGGCTTCCGAGAAAAC-3 ‘e 5′-GCGAGTGGGCTCAGTTATG-3’;

N4A1

[29] 5′-ACAGCTTGCTTGTCGATGTC-3 ‘e 5′-GGTTCTGCAGCTCCTCCAC-3’;

GREB1

[30] 5′-AAGCTGAGCAGCACAGACAA-3 ‘e 5′-GGCTTCTCTTCTCCGAGGTAG-3’;

FKBP5

[31] 5′-TTTTTGAGATTGAGCTCCTTGA-3 ‘e 5′-TTGTGTTCACCTTTGCCAAC-3’;

GAPDH

[31] 5′-GAGTCCACTGGCGTCTTCAC-3 ‘e 5′-GTTCACACCCATGACGAACA-3’. As barras representam a média + SD (n = 5). P-value: ns = não significativo; * = 0,05; ** 0,01; *** .

0,001

Análise Western Blot

LNCaP do adenocarcinoma da próstata humano foram cultivadas em meio RPMI 1640 (PAA) contendo soro de bovino fetal (PAA) a 10% (v /v), penicilina (PAA) 1% (v /v), estreptomicina (PAA) 1% (v /v), L-glutamina (PAA) 1% (v /v) a 37 ° C e 5% de CO

2. 2,5 * 10

6 as células foram semeadas em placas de cultura de tecidos (10 cm) e incubadas em meio RPMI 1640 (PAA) contendo carvão despojado de soro de vitelo fetal (PAA) a 10% (v /v), penicilina (PAA) 1% ( v /v), estreptomicina (PAA) 1% (v /v), L-glutamina (PAA) 1% (v /v). 24 h após a sementeira lestaurtinib ou Ro318220 (concentração final em cada caso 4,5 uM) dissolvido em meio de crescimento (carvão despojado de soro bovino a 10% (v /v), penicilina a 1% (v /v), estreptomicina a 1% (v /v) , L-glutamina a 1% (v /v), 1% de DMSO (v /v), dihydrotestesterone 0,1 nM) e incubou-se durante 18 h. células LNCaP incubadas com DMSO (1% (v /v)) foram utilizadas como um controlo. A seguir ao tratamento inibidor, as células foram lavadas uma vez com PBS gelado, lisadas com tampão de isolamento núcleos (Sacarose 250 mM, Tris-HCl 20 mM, NaCl 150 mM, IGEPAL-CA 630 0,1% (v /v), CaCl

2 0,2 mM, MgCl

2 1,5 mM, DTT 1 mM, pepstatina 1 ^ M, mistura de Inibidor de Protease Cocktail (Sigma), PhosStop® (Roche), pH 8,0). As histonas foram extraídos ácido (H

2SO

4 0,4 ​​N, DTT 1 mM, pepstatina 1 ^ M, Mistura de Inibidor de Protease Cocktail (Sigma), PhosStop® (Roche)) durante a noite.

As concentrações de proteína de extractos de histona foram determinadas utilizando BCA Protein Assay (Pierce). 5 ug de proteínas foram separadas por electroforese em SDS-gel (15% de gel de poliacrilamida) e transferido para uma membrana de PVDF Roti®-(Roth). A membrana foi então bloqueada com leite seco não gordo (Roth, 5% (w /v), TBS, Tween 20 a 0,1% (v /v)) e sondadas com anti-H3T11ph (Activo Motif) 1:1000 e anti- H3 (Upstate) 1:5000 como um controlo de carga. Canon CanoScan Lide 50 foi usado para adquirir a imagem do blot e Adobe Photoshop 5.0 foi usado para processar a imagem.

Informações de Apoio

Figura S1.

alinhamento de sequências entre PKC-teta (Sbjct) e PRK1 (consulta).

doi: 10.1371 /journal.pone.0034973.s001

(TIFF)

Figura S2. análise

PROCHECK.

doi: 10.1371 /journal.pone.0034973.s002

(TIFF)

Figura S3.

RMSD enredo da simulação MD da PRK1-estaurosporina complexa usando AMBER10. A linha cinza representa a trama RMSD para a proteína C-alfa-PRK1 átomos, enquanto que a linha preta mostra a oscilação da estrutura inibidor

doi:. 10.1371 /journal.pone.0034973.s003

(TIFF)

Figura S4.

Os compostos da biblioteca de Biomol, os Compostos 1-30.

doi: 10.1371 /journal.pone.0034973.s004

(TIFF)

Figura S5.

Os compostos da biblioteca de Biomol, compostos 31-60.

doi: 10.1371 /journal.pone.0034973.s005

(TIFF)

Figura S6.

Os compostos da biblioteca de Biomol, compostos 61-84.

doi: 10.1371 /journal.pone.0034973.s006

(TIFF)

Figura S7.

Efeitos de lestaurtinib Ro318220 e na fosforilação de H3T11 em células LNCaP após 18 h.

doi: 10.1371 /journal.pone.0034973.s007

(TIFF)

Tabela S1. valores

pontuação obtida para 63 compostos Biomol ancorados e muito mais do inibidor da quinase testado sete.

doi: 10.1371 /journal.pone.0034973.s008

(DOC)