Abstract
Estudos anteriores demonstraram o papel do tumor-supressor da proteína de ligação de selênio 1 (SBP1), mas os mecanismos subjacentes não são claras. Neste estudo, verificou-se que a indução de SBP1 mostrou uma inibição significativa do crescimento de células do cancro colo-rectal e metástases em ratinhos. Nós ainda mais empregada etiquetas isobáricos para relativa e absoluta quantificação (iTRAQ) para identificar proteínas que estavam envolvidos em efeitos anti-câncer SBP1 mediadas em tecidos tumorais. Foram identificadas 132 proteínas diferencialmente expressas, entre eles, 53 proteínas foram regulada e 79 proteínas foram reprimidos. Importante, muitas das proteínas diferencialmente alterados foram associados com o metabolismo lipídico /glicose, que também foram ligadas a glicólise, MAPK, Wnt, NF-kB, entalhe e vias de sinalização epitelial-mesenquimal transição (EMT). Estes resultados revelaram um novo mecanismo que SBP1 mediada por inibição câncer é através da alteração /glicose vias de sinalização metabólicas lipídicas
Citation:. Ying Q, Ansong E, Diamante AM, Lu Z, Yang W, X Bie (2015 ) Análise quantitativa proteômica revela que os efeitos anti-câncer de proteína de ligação Selenium 1
In Vivo
estão associados com Vias Metabólicas. PLoS ONE 10 (5): e0126285. doi: 10.1371 /journal.pone.0126285
Editor do Academic: Chih-Hsin Tang, China Medical University, TAIWAN
Recebido: 13 Janeiro, 2015; Aceito: 31 de março de 2015; Publicado: 14 de maio de 2015
Direitos de autor: © 2015 Ying et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pelas bolsas do National Science Foundation Natural da China (concessão # 91229115 e 81272251), uma subvenção para a equipe inovadora da Ciência e Tecnologia, Província de Henan, China
competir interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
A proteína de ligação de selênio humana 1 (SBP1, SELENBP1) pertence à classe de proteínas contendo selénio em que o selénio está firmemente associado com o péptido em vez de incorporada co-traducionalmente como uma selenocisteína aminoácidos (seg) em outra classe de contendo selénio de proteína-glutationa peroxidase 1 (GPx1). O gene SBP1 humano codifica uma proteína de 472 amino ácidos que tem um peso molecular igual a 56 kDa. Ele é expressa numa variedade de células e tecidos (fígado, coração, pulmão, e rim) e localizada no núcleo e /ou citoplasma, dependendo do tipo de célula, o grau de diferenciação, e a sinalização ambiental [1-4]. Diminuição SBP1 foi encontrado na maioria dos cancros humanos incluindo câncer de fígado, câncer de próstata, câncer de mama, câncer de pulmão e câncer colorretal [5]. Esta redução de SBP1 está associado a resultados clínicos pobres. No entanto, as funções biológicas de SBP1 em cancros humanos permanecem obscuros.
tem sido relatado que SBP1 é um alvo de hipoxia-inducible factor-1 α (HIF1α) para responder às espécies de oxigénio reactivas (ROS) [3] . SBP1 também pode regular negativamente uma atividade da glutationa peroxidase (GPx1) sem alterar a sua expressão da proteína através de uma interação física proteína [6]. proteína de von Hippel-Lindau (pVHL) – interagindo enzima deubiquitinating 1 (VDU1) foi encontrada recentemente como outro parceiro da proteína de SBP1, que estava envolvido em vias ubiquitination- e mediada por desubiquitinação degradação de proteínas [7]. Todo este trabalho sugere que SBP1 podem interagir com outras proteínas através de diferentes vias de sinalização.
Para obter uma compreensão mais abrangente de funções SBP1 sobre o cancro, que empregou um método de proteômica, etiquetas isobáricos para quantificação relativa e absoluta (iTRAQ) . iTRAQ é atualmente uma das técnicas mais robustas que quantifica proteínas com base na rotulagem peptídeo. Ao contrário do método de proteómica à base de gel, exposições iTRAQ muito melhor sensibilidade e permite a identificação e quantificação precisas de proteínas a partir de várias amostras dentro de amplas gamas dinâmicas de abundância de proteína [8].
para eliminar possíveis efeitos secundários da transfecção, nós estabeleceu uma linha inducible SBP1 estável celular usando um sistema de expressão de Tet-on inducible gene que faz com que a expressão SBP1 altamente controlável e atinge um nível muito elevado de indução em células. foi observado tumor papel inibição da SBP1
in vivo
. As proteínas diferencialmente expressos em tumores de xenoenxerto de ratinho induzida por SBP1 foram ensaiadas por iTRAQ e as alterações de algumas proteínas identificadas foram validados por imunotransferência. Nossos resultados revelaram um mecanismo anti-câncer novela de SBP1
in vivo
, que estava ligado ao metabolismo lipídico /glucose e associado com MAPK /Wnt, NF-kB, entalhe e EMT vias de sinalização.
Materiais e Métodos
Ética Declaração
Este estudo foi aprovado pelo Comitê animal Care e Use o Xinxiang Medical University. Todos cirurgia foi realizada sob anestesia pentobarbital e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.
cultura celular
A linha de células de carcinoma do cólon humano HCT116 foi obtida a partir de ATCC (American Type Culture Collection, EUA) e mantidas em meio 5a de McCoy (Mediatech, Manassas, VA). GP2-293 linha celular foi adquirida da Clontech (Mountain View, CA) e mantidas em meio DMEM (Life Technologies, Carlsbad, CA). Todos os meios foram suplementados com 10% de FBS, 100 U /mL de penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina. Todas as células foram cultivadas a 37 ° C com 5% de CO
2 numa incubadora humidificada (Thermo Fisher Scientific).
O plasmídeo construção
Para gerar o plasmídeo de expressão retroviral pRetroX-Tight-Pur -SBP1, cDNA SBP1 humano foi amplificado e subclonado no vector pRetroX-Tight-Pur (Clontech, mountain View, CA) utilizando locais de restrição NotI e EcoRI. Foram utilizados os seguintes iniciadores: 5′-frente ATAGCGGCCGCTACAGCATGGCTACGAAAT-3 ‘e inverso 5′-ACGAATTCGCTCAAATCCA GATGTCAGAGC-3’. Dois plasmídeos pRetroX-Tet-On Avançados (Tet no vetor ativador) e pVSV-G (vector Packaging) foram adquiridos em Clontech (Mountain View, CA).
embalagem Retrovirus
As células de embalagem GP2-293 foram cultivadas em 25cm
2 frascos e transfectadas utilizando Lipofectamine 2000 (Life Technologies) com 6 ug pVSV-G e ou 2 ug pRetroX-Tight-Pur-SBP1 ou 2 ug pRetroX-Tight-On Avançado. Quarenta e oito horas após a transfecção, vírus contendo sobrenadante foi recolhido e congelado a -20 ° C. linha celular HCT116-TetSBP1 foi gerado por infecção de células HCT116 com o vírus contendo tanto pRetroX-Tight-Pur-SBP1 e pRetroX-Tight-On Avançado. Única colónia foi escolhido após selecção com 400 ug /ml de G418 (Sigma) e 1 ug /mL de puromicina (Sigma). linha celular HCT116-Act foi gerado por infecção de células HCT116 com o vírus contendo pRetroX-Tight-On Avançado. Única colónia foi escolhido após seleção com 400 ug /ml de G418 (Sigma).
análise Immunoblotting
células HCT116-TetSBP1 e HCT116-ACT foram tratados com 1 ug /mL de doxiciclina (Sigma) para 72 horas antes da análise. As células recolhidas foram lisadas em tampão de lise 1x celular (Cell Signaling, Danvers, MA) contendo PMSF 1 mM (Cell Signaling). ligado de células purificadas de cada linha celular foi mantida em ebulição com NuPAGE LDS Amostra tampão (Life Technologies) e 10x Agente Redutor (Life Technologies) durante 5 minutos antes de serem carregadas num gradiente de 4-12% Bis-Tris em gel de poliacrilamida desnaturante (Life Technologies). Após a separação da amostra por electroforese, as proteínas foram transferidas para uma membrana Immobilon-FL (Millipore) por meio de electrotransferência. anticorpos e diluições primárias incluindo SBP1 a 1: 1000 (rato, MBL International, Woburn, MA), β-actina de 1: 10000 (rato, Sigma), DKK1 em 1: 1000 (de coelho, Proteintech, Chicago, IL), ANXA4 a 1: 1000 (de coelho, Proteintech, Chicago, IL), PPIA a 1: 1000 (de coelho, Proteintech, Chicago, IL), FABP4 a 1: 1000 (de coelho, Proteintech, Chicago, IL), UGDH a 1: 1000 ( coelho, Proteintech, Chicago, IL), ALDH2 a 1: 1000 (de coelho, Proteintech, Chicago, IL), p21 a 1: 1000 (de coelho, Proteintech, Chicago, IL), fosfo-Akt (Ser473) a 1: 1000 ( coelho, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), Akt a 1: 1000 (de coelho, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), fosfo-FOXO1 a 1: 1000 (de coelho, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), fosfo-JNK a 1: 1000 (de coelho, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), de JNK em 1: 1000 (de coelho, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), PC-Jun para 1: 1000 (de coelho, Cell Signaling Technology, Danvers, MA ), fosfo-Ciclina D1 de 1: 1000 (de coelho, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), ciclina D1 em 1: 1000 (de coelho, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), fosfo-p53 (Ser15) a 1: 1000 (coelho, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), torção de 1: 1000 (de coelho, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), β-catenina em 1: 500 (de cabra, Santa Cruz, Santa Cruz, CA), e GPX1 a 1: 1000 (rato, MBL International, Woburn, MA) foram incubadas com a membrana, a 4 ° C durante a noite. O anticorpo secundário apropriado (Beyotime Instituto de Biotecnologia, China) foi aplicada (1: 1000, coelho ou rato), à temperatura ambiente durante 1 h. Sinal foi detectado utilizando BeyoECL Plus (Instituto Beyotime de Biotecnologia, China).
In vivo
nu tumorigênese ratos e metástase ensaio
Para o experimento de xenotransplante, HCT116-Act e HCT116 -TetSBP1 células foram tratadas com doxiciclina 1 ug /ml durante 72 horas e em seguida 2 x 10
6 células em 100 ul de PBS foram injectadas subcutaneamente em /c ratinhos CD-1 fêmea de 6-8 semanas de idade BALB Nu nos lados diferentes ( HCT116-Act foi no lado esquerdo e HCT116-TetSBP1 foi no lado direito). A doxiciclina (200 ug /mL) dissolvido em 5% de sacarose fornecido como água potável foi trocado a cada 3 dias. Quatro semanas após a injecção, os tumores foram isolados e o peso (g) e o volume (mm
3) dos tumores foram determinados. Os tumores foram armazenadas a -80 ° C até ser utilizado para a análise de imunotransferência e iTRAQ.
Para produzir a metástase pulmonar experimental, as células HCT116-ACT e HCT116-TetSBP1 foram tratadas com doxiciclina 1 ug /ml durante 72 horas e, em seguida, 2 × 10
6 células em 100 ul de PBS foram injectadas na veia lateral da cauda de ratinhos BALB /c ratinhos CD-1 do sexo feminino Nu 6-8 semanas de idade. A doxiciclina (200 ug /mL) dissolvido em 5% de sacarose fornecido como água potável foi trocado a cada 3 dias. Seis semanas mais tarde, os ratinhos foram sacrificados sob anestesia. Os pulmões foram recolhidos e fixados em formalina a 10%. Para a avaliação da morfologia do tecido, hematoxilina e eosina (HE) foi realizada em secções de amostras embebidas.
Extracção de proteínas, a digestão e rotulagem iTRAQ
proteínas totais foram extraídas a partir de tecido de tumor de HCT116-Lei injetado (Act) e HCT116-TetSBP1 injetaram em ratos (TetSBP1) usando o seguinte protocolo. Três réplicas biológicas foram realizadas para cada amostra e misturados em conjunto para a extracção de proteínas. O tecido tumoral foi fervido em tampão TED (4% de SDS, 100 mM de Tris-HCl, 1 mM de DTT, pH 7,6) durante 5 min, homogeneizada utilizando FastPrep-24 (MP Biomedicals, 6 m /s, 30, dois ciclos) e, em seguida sonicada ( 100w, 30 seg on, 30 seg off, 10 ciclos). O homogenato foi centrifugado a 12000 g durante 10 min a 4 ° C. As concentrações proteicas foram ensaiadas de acordo com o método de Bradford [9]. Uma quantidade igual de proteínas foi preparado para cada amostra. a digestão de proteínas foi realizada de acordo com o procedimento descrito por FASP Wisniewski, Zougman et ai. [10] e o péptido resultante mistura foi marcada utilizando o reagente iTRAQ 4-Plex de acordo com as instruções do fabricante (Applied Biosystems). Resumidamente, 200 ug de proteínas de cada uma das amostras foram incorporados em 30 ul de tampão de DST (4% de SDS, DTT 100 mM, 150 mM Tris-HCl pH 8,0). O detergente, DTT e outros componentes de baixo peso molecular foram removidos utilizando tampão UA (ureia 8 M, Tris-HCl 150 mM, pH 8,0) por ultrafiltração repetida (unidades Microcon, 30 kD). Em seguida, 100 ul de 0,05 M em tampão de iodoacetamida UA foi adicionado para bloquear os resíduos de cisteína reduzida e as amostras foram incubadas durante 20 minutos na escuridão. Os filtros foram lavados com 100 ul de tampão UA três vezes e, em seguida, 100 ul de tampão de DS (triethylammoniumbicarbonate 50 mM a pH 8,5) duas vezes. Finalmente, as suspensões de proteína foram digeridas com 2 ug de tripsina (Promega) em 40 ul de tampão DS durante a noite a 37 ° C, e os péptidos resultantes foram recolhidos como um filtrado. O teor de péptido foi avaliado por luz UV densidade espectral a 280 nm utilizando um coeficiente de extinção de 1,1 de solução que foi calculada com base na frequência de triptofano e tirosina em proteínas vertebrados 0,1% (g /l). Para a etiquetagem, cada reagente iTRAQ foi dissolvido em 70 ul de etanol e adicionou-se a respectiva mistura de péptidos. As amostras foram marcadas como (TetSBP1) -114, (lei) -115, e foram multiplexados e seco sob vácuo.
A cromatografia líquida (LC) de ionização -electrospray (ESI) MS análise em tandem (MS /MS) através Q exactive
A mistura de péptidos foi dessalinizada em cartuchos C18 (Sigma), em seguida, concentrada por centrifugação a vácuo e reconstituída em 40 ul de 0,1% (v /v) de ácido trifluoroacético. MS experiências foram realizadas num espectrómetro de massa Q Exactive que foi acoplado a fácil NLC (Thermo Fisher Scientific). 10 ul da amostra foram injectados para análise nanoLC-MS /MS. A mistura de péptidos (5 ug) foi carregado numa coluna de fase C18-invertida (coluna Thermo Scientific fácil, 10 cm de comprimento, 75 um de diâmetro interior, resina de 3 um) em tampão A (ácido fórmico 0,1%) e separadas com um gradiente linear de tampão B (acetonitrilo a 80% e 0,1% de ácido fórmico) a um caudal de 250 nl /min controlada pela tecnologia IntelliFlow mais de 240 min. dados de MS foram adquiridos utilizando um método top10 dependente dos dados escolher dinamicamente os íons mais abundantes precursoras da verificação pesquisa (300-1800 m /z) para fragmentação HCD. Determinação do valor alvo é baseado em preditivo Controle Automático de Ganho (pAGC). duração da exclusão dinâmica foi de 60 s. scans da pesquisa foram adquiridos em uma resolução de 70.000 a m /z 200 e resolução de espectros HCD foi definido para 17.500 em m /z 200. energia de colisão Normalizado foi de 30 eV e da relação underfill, que especifica o percentual mínimo do valor alvo provável a ser atingido no momento de preenchimento máximo, foi definida como 0,1%. O instrumento foi executado com o modo de reconhecimento de péptidos habilitado
identificação e proteína iTRAQ quantificação
espectros MS /MS foram pesquisados utilizando o motor MASCOT (Matrix Ciência, Londres, Reino Unido; a versão 2.2). Encaixado em Proteome Discoverer 1.3 (Thermo Electron, San Jose, CA.) contra UniProt banco de dados Humano (136615 sequências, baixado em 07 de maio de 2014) eo banco de dados engodo. Para a identificação da proteína, foram usadas as seguintes opções: tolerância da massa dos péptidos = 20 ppm, tolerância MS /MS = 0,1 Da, Enzima = tripsina, clivagem perdida = 2, modificação Fixo: Carbamidomethyl (C), iTRAQ 4-Plex (K), iTRAQ 4-plex (N-term), modificação variável: Oxidação (M), FDR≤0.01. Considerando que vários espectros MS /MS de um peptídeo jogo, normalização das intensidades de sinal de cada um espectro MS /MS foi realizada para encontrar a proporção mais provável para a expressão de um péptido. Para alterações quantitativas, um corte de 1,2 vezes foi criado para determinar se-acumulada e down-acumulada proteínas, com um valor de p 0.05.
análise bioinformática
Análise funcional de proteínas identificadas foi realizado utilizando Gene Ontology anotação (GO) (https://www.geneontology.org/) e proteínas foram classificados de acordo com suas características biológicas processo, função molecular e localização celular [11]. As proteínas diferencialmente acumulados foram ainda atribuídos à Enciclopédia Kyoto de genes e genomas de banco de dados (KEGG) (https://www.genome.jp/kegg/pathway.html) [12].
Resultados
indução SBP1 em camundongos nus inibiu o crescimento do tumor de xenoenxertos
Os níveis de expressão SBP1 em HCT116-Act e as células HCT116-TetSBP1 foram determinados por immunoblotting análise. Como mostrado na Fig 1A, linha celular HCT116-TetSBP1 expressa elevado nível de SBP1 após a indução da doxiciclina, em comparação com as células HCT116-ACT. Para testar se SBP1 superexpressão tinham função supressora tumoral
in vivo
conforme relatado anteriormente [13], foram realizados experimentos de xenotransplante em ratinhos nus CD1 Nu (n = 10 no total). células HCT116-ACT e HCT116-TetSBP1 foram tratadas com doxiciclina 1 ug /ml durante 72 horas e em seguida 2 x 10
6 células em 100 ul de PBS foram injectadas subcutaneamente em 6-8 semanas de idade BALB /c CD-1 fêmea Nu ratinhos nos diferentes lados, respectivamente. HCT116-Act foi no lado esquerdo e HCT116-TetSBP1 foi no lado direito. Para manter persistentemente a indução de SBP1, doxiciclina (200 ug /mL) dissolvido em 5% de sacarose fornecido como água potável foi trocado a cada 3 dias. Quatro semanas após a injecção, os tumores foram isolados, e o peso do tumor (g) e o volume (mm
3) foram analisados. Descobrimos que os tamanhos dos tumores derivados de células HCT116-TetSBP1 eram muito menores do que aqueles nas células HCT116-ACT grupo controle (Fig 1B e 1C). Além disso, o peso de tumores derivados das células HCT116-TetSBP1 foi significativamente reduzida, em comparação com HCT116-Act (Figura 1D). Estes resultados sugerem fortemente que o
in vivo
indução de SBP1 mostraram inibição do tumor em ratos.
(A) SBP1 induzida pela doxiciclina nas células HCT116-TetSBP1 foram validados por análise de imunotransferência. (B) As fotografias ilustram tumores representativos em xenoenxertos com indução SBP1 (TetSBP1, direita) em comparação com tumores sem indução SBP1 (Act, à esquerda). 10 ratos no total. (C-D) resultados de indução SBP1 em um declínio do volume do tumor e peso. Os resultados foram analisados com o teste t de Student e apresentados como média ± DP. ** P . 0,01
SBP1 indução suprimida metástase de tumor
in vivo
Para examinar a inibição SBP1 de metástase do tumor, o HCT116-Act e HCT116-TetSBP1 as células foram tratadas com 1 ug /mL de doxiciclina durante 72 horas e em seguida 2 x 10
6 células em 100 ul de PBS foram injectadas na veia lateral da cauda de ratinhos CD-1 com 6-8 semanas de idade BALB /c nu fêmea (n = 5 para cada grupo). Para manter persistentemente a indução de SBP1, doxiciclina (200 ug /mL) dissolvido em 5% de sacarose fornecido como água potável foi trocado a cada 3 dias. Após 6 semanas, os ratinhos foram anestesiados e pulmões de ratinho foram colhidas, fixadas e dissecados. Nós descobrimos que os ratos transplantados com células HCT116-ACT tinha nódulos metastáticos pulmonares visíveis, enquanto que nenhum rato no grupo HCT116-TetSBP1 mostrou metástase pulmonar visível (Fig 2A). Após coloração com hematoxilina e eosina (HE), o número de nódulos metastáticos pulmonares foram contadas. Os resultados mostraram que os ratos com indução SBP1 (grupo HCT116-TetSBP1) resultou em uma diminuição significativa nos nódulos metastáticos pulmonares (Fig 2B), indicando uma inibição metastático SBP1
in vivo
.
( A) imagens representativas de pulmões e hematoxilina e eosina (HE) -staining dos pulmões isolados de ratinhos que receberam uma injecção na veia da cauda de células HCT116-ACT (ACT) e células HCT116-TetSBP1 (TetSBP1). Cada grupo contém 5 ratos. Setas ilustra os nódulos visíveis e nódulos metastáticos no pulmão. Barra de escala = 200 pm. (B) indução SBP1 inibe a metástase de tumor
in vivo
. O número de nódulos metastáticos pulmonares foram contadas sob microscópio e analisados com o teste t de Student. Os resultados são apresentados como média ± DP. ** P . 0,01
identificação quantitativa e bioinformática análise de proteínas de tecido de tumor ensaiadas por iTRAQ
Para determinar os mecanismos de inibição SBP1 mediada do crescimento de tumores e metástases em camundongos, extraímos proteína total do tecido tumoral de HCT116-Act injectado (Act) e HCT116-TetSBP1 injetaram em ratos (TetSBP1) e perfis de proteínas foram conduzidos utilizando iTRAQ. Em última análise, foram identificados 9147 peptídeos exclusivos, 2015 grupos de proteínas e 1975 proteínas. A distribuição de comprimentos e número de péptidos, a massa e a cobertura sequência de proteínas são fornecidos (S1 Tabela).
As alterações no perfil de proteínas em resposta à indução SBP1 foram analisados. 132 proteínas mostrou uma diferença significativa (p 0,05) com um FDR de menos de 1%, incluindo 53 proteínas regulada e 79 proteínas reprimidos. informações relevantes e detalhadas são fornecidas (S2 Tabela). Estas proteínas diferencialmente acumulados enriquecida 1364 anotações por meio de análise GO, e foram classificadas em três grupos: processo biológico, função molecular e componente celular (Fig 3A). As principais categorias de processo biológico incluído processo celular, processo único organismo, regulação biológica, metabolismo e resposta a estímulos. Com base em funções moleculares diferentes, estas proteínas foram divididos nos grupos de actividade de ligação, catalítica, actividade molécula estrutural, actividade reguladora enzima, actividade de transportador e a actividade antioxidante. Estas proteínas foram também envolvidos em diferentes componentes celulares, incluindo células, organelos, complexo macromolecular, membrana e lumen fechado por uma membrana. Estas proteínas diferencialmente acumulados foram classificados utilizando o banco de dados KEGG. As principais vias envolvidas nas proteínas diferencialmente expressos resultantes de indução SBP1, incluindo misregulation transcricional em câncer, junção apertado, lisossoma, processamento de proteínas no retículo endoplasmático, HIF 1-via de sinalização, via de sinalização PI3K-Akt, percursos em câncer, proteoglicanos no cancro , microRNAs em câncer, e glicólise /gluconeogénese, e outros percursos. Estudos recentes têm demonstrado que o metabolismo lipídico /glicose é altamente associado com a carcinogênese [14-17]. Por isso, em seguida, analisaram as proteínas em sua maioria mudou isso ligados ao metabolismo lipídico /glicose a partir dos tumores do rato de xenotransplante. Curiosamente, treze lipídios proteínas relacionadas com o metabolismo e sete proteínas relacionadas com o metabolismo da glicose foram significativamente alteradas por indução SBP1 em tumores do rato de xenotransplante. Todas estas proteínas relacionadas com o metabolismo lipídico /glicose foram ilustrados na figura 3B com base em suas funções biológicas através da análise Gene Ontology (GO)
Todas as 132 proteínas diferencialmente acumulados (A) foram classificadas em três grupos:. Processo biológico, função molecular e componente celular por meio de análise GO. (B) O número de lípidos /proteínas relacionadas com o metabolismo da glicose foram mostrados através de análise GO.
Alterações de proteínas associadas ao metabolismo lipídico /glicose em resposta à indução SBP1
Como mostrado na Figura 3B, foram seleccionados treze proteínas relacionadas com o metabolismo de lípidos, incluindo cinco proteínas sobre-regulada e oito proteínas regulados negativamente (Tabela 1). As proteínas mais regulada por indução SBP1 incluídos DKK1 que inibe a via de WNT [18], DHCR7 que controla a síntese de D colesterol e vitamina [19], ANXA4 que inibe a via de NF-kB e de IL-8 [20], e AGPAT5 que inibe a proliferação de células de cancro da mama [21]. Todas estas proteínas têm sido relatados para mostrar efeitos anti-cancerígenos potenciais. Considerando que, outras proteínas, tais como LPCAT2 que é altamente expresso em células inflamatórias [22], BPIFA3 que é altamente expresso em cancro do pulmão [23], PPIA que activa via NFkB [24], e FABP4 que tem papel pró-angiogénico [25 ], foram regulados negativamente em SBP1 tumores sobre-expressão de xenoenxerto. Em contraste, sete proteínas relacionadas com o metabolismo da glicose foram significativamente regulada negativamente em SBP1 tumores superexpressão de xenotransplante, incluindo GAA, GAPDH, ALDH2, Tiorredoxina, ENO3, UGDH e lumican (Tabela 2).
Para validar as alterações diferenciais das proteínas relacionadas com o metabolismo de lípidos /glucose ensaiadas a partir iTRAQ proteomic análise em tumores de xenoenxerto de ratinho, foram realizadas análises immunoblotting. Consistente com os observados a partir do perfil iTRAQ, duas proteínas (DKK1 e ANX4) foram significativamente aumentados e quatro proteínas (PPIA, FABP4, ALDH2 e UGDH) foram significativamente diminuída em tumores de sobre-expressão de xenoenxerto SBP1 (S1 FIG). A alta consistência indicou a alta confiabilidade dos resultados iTRAQ. dados MS /MS destes seis proteínas são fornecidos (S2 Fig).
inibição Tumor de SBP1 foi associada a múltiplas vias de sinalização
in vivo
Para determinar os mecanismos adicionais de indução SBP1 inibição mediada do crescimento do tumor e metástases, analisou-se o crescimento do tumor e das vias de sinalização associados a metástase tumoral utilizando amostras de proteínas de xenoenxertos de ratinho, que também foram utilizadas para a análise proteomic iTRAQ. Em primeiro lugar, GPX1 foi regulada negativamente em tumores TetSBP1 (Fig 4), consistentes com os observados em tecidos de câncer de próstata humanos [26], mas era diferente dos
in vitro
estudos que mostraram que superexpressão SBP1 não afetou GPX1 Os níveis de proteína em células HCT116 embora as atividades GPX1 foram significativamente reprimidos [6]. Este encontrar correlação inversa novamente sugerida entre SBP1 e GPX1
in vivo
não
in vitro
. Em segundo lugar, a indução da SBP1 levou à activação de JNK1 /Wnt via, em termos de aumento da fosforilação da JNK1 e c-Jun, e a diminuição da expressão da beta-catenina e seus alvos a jusante da ciclina D1, em particular, fosforilado ciclina D1 foi significativamente regulada negativamente ( Fig 4). Além disso, os inibidores de beta-catenina p53 (p53 fosforilado, P-p53) e p21, um alvo a jusante de p53 directa, foram aumentadas em resposta à indução SBP1 em tumores do rato TetSBP1 (Figura 4). Em terceiro lugar, a indução de SBP1 levou a uma redução significativa de TWIST (Figura 4), um regulador crítico para EMT e metástase.
Vários marcadores típicos de diferentes vias de sinalização foram examinadas utilizando análise de amostras de proteína proteomic iTRAQ. Estas vias de sinalização relacionadas ao câncer respondem de forma diferente à indução SBP1.
Discussão
expressão reduzida de SBP1 tem sido observado em vários tipos de cancros humanos, incluindo colorretal, pulmão, esôfago, estômago, cancros da mama e do fígado, ea redução da SBP1 está associada a menor sobrevida [5]. Diminuição de SBP1 aumento da motilidade celular, promoveu a proliferação celular, e suprimiu a diferenciação das células
in vitro
, embora os ratos com deficiência genética SBP1 (isto é SBP1 camundongos knockout) não apresentaram fenótipos óbvias [3,27,28]. Em contraste, o aumento da expressão em células SBP1 por transfecção de plasmídeo expressando-SBP1 poderia leva a senescência, a inibição da proliferação de células cancerosas, a migração e o crescimento do tumor em murganhos imunocomprometidos [3,13,29,30]. Os nossos estudos anteriores mostraram que SBP1 foi diminuída em tumores colorrectais mais em comparação com tecidos não tumorais ao passo que tem níveis variáveis de expressão em diferentes linhas celulares de cancro [6,13,29]. Por exemplo, SBP1 é altamente expresso em LS174T, Caco-2, HT-29 e células MCF-7, mas não detectável em HCT116. Então linha de células de cancro do cólon humano HCT116 foi usada para superexpressão SBP1 em nosso estudo. Neste estudo, usando um sistema indutível e modelo de xenoenxerto de ratinho, verificou-se que
in vivo
indução de SBP1 mostrou efeitos significativos anti-cancro, incluindo inibiu o crescimento tumoral e metástases em ratinhos nus. As vantagens de usar este SBP1 Tet-on sistema de expressão de genes indutíveis são listados como se segue: 1) O sistema de expressão de gene indutível faz SBP1 superexpressão controlável, assim, as células são mantidas sem interferência SBP1 e o dano de transfecção pode ser minimizado quando sobre-expressão é necessária; 2) No presente estudo, a expressão SBP1 tem nenhuma modificação etiqueta e a proteína expressa permanece no estado natural. Todos estes observação sugeriu que tanto SBP1 endógena e ectópica pode servir como um potencial supressor de tumor.
Para determinar os mecanismos moleculares subjacentes, o ensaio de rótulo iTRAQ proteomic técnica foi empregue. Entre as proteínas identificadas 1975, 132 proteínas foram expressas diferencialmente no tecido tumoral induzida SBP1. Uma análise mais aprofundada reduzimos as proteínas diferencialmente expressos em sete proteínas relacionadas com o metabolismo da glicose relacionada metabolismo e treze lipídicas. Entre as proteínas relacionadas com o metabolismo de lípidos treze, cinco foram regulados positivamente (DKK1, HSP60, DHCR7, ANXA4 e AGPAT5) e oito foram regulados negativamente (LPCAT2, GPX5, GAPDH, NMe2, ALDH2, BPIFA3, PPIA e FABP4). Nas proteínas regulados positivamente por indução SBP1, DKK1 é conhecido como um inibidor da via Wnt /β-catenina [18]. A sobre-regulação de DKK1 poderia quinase Jun N-terminal activa (JNK) e induzir a apoptose [31,32], e pode regular negativamente EMT através da inibição TWIST [33]. De facto, os nossos estudos anteriores demonstraram que a activada de JNK1 também pode regular negativamente β-catenina através da GSK3-beta [34]. Além disso, a expressão aumentada de DKK1 poderia levar a infra-regulação da ciclina D1, um alvo a jusante directa de beta-catenina. Nosso trabalho anterior também demonstrou uma interação regulamentar entre JNK1 e p21 [35]. Nisto verificou-se que como uma resposta à regulação positiva de DKK1 e JNK1, p21 e p53 seu alvo a montante foram também aumentou (Fig 4). Curiosamente, na via de sinalização de Wnt /beta-catenina, existe uma interacção entre o regulador negativo de beta-catenina /Ciclina D1 e p53 /p21 [36]. Entre as proteínas relacionadas com o metabolismo lipídico validado, ANXA4 foi regulada positivamente e PPIA foi reprimidos. Tem sido relatado que ANXA4 poderia suprimir a actividade transcricional de NF-kB através da interacção com a subunidade p50 de NF-kB [20] e citoquinas (por exemplo, IL-8 [37]). Em contraste, PPIA poderia activo via de NF-kB e de sinalização inflamatória [24]. Numerosos estudos têm mostrado que fortemente activação de NF-kB e inflamação crónica desempenhar um papel crucial na formação e progressão [38] do cancro. Outra proteína foi regulada negativamente FABP4. Tem sido relatado que medeia FABP4 VEGFA-dependentes efeitos pró-angiogénicos, que está ligada a sinalização Notch durante a carcinogénese e metástase [25].
Todos os sete proteínas relacionadas com o metabolismo da glicose em tecido foram reprimidos-tumoral induzida SBP1 , incluindo GAA, GAPDH, ALDH2, tioredoxina, ENO3, UGDH e lumican. UGDH (UDP-glucose desidrogenase) catalisa a oxidação de UDP-glucose para dar ácido UDP-glucurónico, um precursor de ácido hialurónico (HA) e outros glicosaminoglicanos (GAGs) na matriz extracelular. Um estudo anterior demonstrou que a diminuição UGDH inibe a agregação e migração celular [39]. Além disso, foi relatado que ALDH2 inactivação poderia aumentar a citotoxicidade produzida por peroxidação lipídica [40]. Estes resultados sugerem que a regulação baixa de UGDH e ALDH2 pode ser atribuída aos efeitos anticancerígenos de SBP1.
Em resumo, usando um sistema de inducible SBP1 e
in vivo
modelo do rato, nossos estudos têm claramente mostrados papéis que a inibição do tumor de SBP1 estão associados com alterações de proteínas relacionadas com o metabolismo lipídico /glicose através do envolvimento de múltiplas vias de sinalização, revelando um mecanismo molecular romance de inibição de tumor por SBP1.