Abstract

Fundo

modelos pré-clínicos de cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) requerem maior relevância clínica para estudar os mecanismos de doenças e terapias inovadoras. Buscou-se comparar e aperfeiçoar modelos de ratos ortotópico bioluminescentes de humano localizadas NSCLC.

Métodos

atímicos

ratinhos nus foram submetidos à injeção subcutânea (grupo 1-SC, n = 15, controle), a injecção ortotópico percutânea (grupo 2-PI, n = 30), a implantação cirúrgica ortotópico de tumores crescidos subcutaneamente (grupo 3-SOI, n = 25), ou injecção ortotópico transpleural (grupo 4-toi, n = 30) de As células A549-luciferase. Bioluminescente

in vivo

imagem foi então realizada semanalmente. Que circulam células tumorais (CTCs) foram pesquisados ​​utilizando o sistema Cellsearch® em modelos SC e TOI.

Resultados

Grupo 2-POI foi associada com pleural direta inesperada disseminação da solução celular em 53% dos os casos, proibindo uma avaliação mais aprofundada de qualquer tumor pulmonar localizada. Grupo 3-SOI foi caracterizado por alta mortalidade peri-operatória, tumores pulmonares inicialmente localizadas, e evolução local. Grupo 4-TOI foi associada à baixa mortalidade peri-operatória, tumores pulmonares inicialmente localizadas, extensão regional loco e metástases à distância. CTCs foram detectados em 83% dos

camundongos

nus portadores de tumores NSCLC subcutânea ou ortotópicos.

Conclusões

transpleural injeção ortotópico de células A549-luc em

nu

rato pulmão induz tumor localizado, seguido por extensão linfático e mortalidade específica, e permitiu que a primeira identificação do tempo de CTCs em um modelo de ratos NSCLC

Citation:. P Mordant, Loriot Y, Lahon B, Castier Y, Lesèche L, Soria JC, et ai. (2011) Bioluminescent camundongo ortotópico os modelos de regionalização de Human Non-Small Cell Lung Cancer: Viabilidade e Identificação de células circulantes de tumor. PLoS ONE 6 (10): e26073. doi: 10.1371 /journal.pone.0026073

editor: Wafik S. El-Deiry, Penn State Hershey Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 24 de junho de 2011; Aceite: 19 de setembro de 2011; Publicação: 11 de outubro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Mordant et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. PM tem foi apoiado pela Sociedade Francesa de Cirurgia Torácica (SFCTCV). BL foi apoiado pela Fundação Francesa de Investigação Médica (FRM) e Geração Thorax. Este projecto foi apoiado pelo cancro da Associação Francesa de Investigação (ARC para MCV e ED) eo Roussy Fundação Gustave (Fondation Gustave Roussy para MCV e ED). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) é a principal causa de mortalidade relacionada ao câncer em todo o mundo. Apesar de numerosos ensaios clínicos de medicamentos pré-clínicos promissores, nenhum grande surto foi feito na gestão NSCLC nas últimas décadas. Embora não haja medicina baseada em fortes evidências apoiando o uso clínico de citotóxico, em torno de 3 tipos de agentes mostraram eficácia consistente, mas limitada (platina, taxanos, gemcitabina). Mais recentemente, terapias direcionadas renunciaram esperanças importantes dada a sua capacidade de atingir diretamente mecanismos de sobrevivência específicos de células cancerosas. Em nítido contraste com a robustez do racional subjacente translacional biológica, clínica deste conhecimento em benefício clínico ainda permanece desafiador desde terapias direcionadas mostrou apenas um benefício de sobrevivência marginal quando se considera toda a população pacientes NSCLC [1] – [4]. Depois destes ensaios iniciais, análises retrospectivas moleculares de tecido de tumor levou à definição de subgrupos de pacientes que respondem ao favoravelmente tratamentos experimentais, com a administração de certos cancros sendo revolucionou [5]. Entre os pacientes com NSCLC, que recebem erlotinib, a presença de uma mutação do EGFR aumento da resposta ao agente de [6], [7], mas refere-se apenas 16% dos pacientes [8]. Mais recentemente, a inibição da quinase de linfoma anaplasic (ALK) foi relatada como resultando na redução do tumor ou doença estável na maior parte dos pacientes com NSCLC ancorando genes de fusão EML4-ALK, mas refere-se apenas 2 a 7% do NSCLC [9]. No entanto, nesse meio tempo, consideráveis ​​esforços têm sido gastos em tratamentos activos ensaio ensaios clínicos em tumores resistentes a [2], [3], [10] – [12]

A discrepância entre os valores da clínica. lógica, a quantidade de dados pré-clínicos, por um lado ea baixa produção de sua transferência em ensaios clínicos sugerem que a relevância dos modelos pré-clínicos podem ser questionada. Especialmente, testes pré-clínicos devem ter um impacto positivo mais bem defenido contra o valor preditivo negativo [13]. Atual em modelos pré-clínicos in vivo não estão refletindo os passos de progressão maligna do tecido normal à lesão pré-cancerosa e depois para o cancro (localizada e, em seguida, metastático). modelo ideal deve imitar a história natural de cancro humano, a fim de melhorar a nossa compreensão da patogénese do cancro, prever a eficácia do tratamento investigados e identificar qual o tratamento serão ajustadas a que o paciente antes da concepção de ensaios clínicos. Neste contexto, os modelos de xenoenxertos continuam a ser as pedras angulares de experimentos pré-clínicos e vai ganhar a partir do qual as melhorias técnicas, juntamente com o desenvolvimento recente de desenho assistido por computador de drogas, modelagem de computador e animais geneticamente modificados [14]. xenoenxertos NSCLC humanas podem ser implantadas em animais imunodeficientes ou por via subcutânea (SC) ou ortotopicamente. Por um lado, xenotransplantes SC de câncer de pulmão são fáceis de executar e acompanhar, mas não têm relevância sobre (i) a história natural do câncer devido à ausência de linfática ou extensão metastática, e (ii) a previsão da eficácia do medicamento em ensaios clínicos como testemunhado pela alta proporção de ensaios clínicos negativos [13]. Por outro lado, os modelos ortotópicos de cancro do pulmão são tecnicamente mais difícil, nem sempre imitar a história natural do câncer de pulmão, mas aumentar a esperança considerável sobre a seleção da droga [15]. O recente aumento da nossa compreensão, na conversa transversal do estroma tumoral [16] – [18] e seu envolvimento na resistência aos medicamentos, metástase, escape imunológico, angiogênese sugere fortemente que os modelos ortotópicos deve fornecer informações valiosas que não se poderia obter de sub modelos -cutaneous.

Considerando tumores torácicos, o desafio técnico é crescer “células tumorais pulmonares dentro do peito”. Várias técnicas podem ser usadas para este objectivo, incluindo a administração intra traqueal [19] ou de injecção percutânea ortotópico [20] de células NSCLC na solução, e o implante ortotópico cirúrgica do tumor subcutaneamente cultivados provenientes de linha de células NSCLC [21]. Administração intratraqueal está associada com inicial difusa propagação das células de ambos os pulmões, o que interfere com a progressão e o processo de metástase do pulmão, por conseguinte, favorecendo modelos percutâneas e cirúrgicas. No entanto, a viabilidade técnica e história natural destes dois modelos nunca foram comparados. Este estudo procurou comparar e aperfeiçoar estes dois xenoenxertos modelos ortotópicos de cancro do pulmão, com o objetivo final de reproduzir progressão NSCLC humana, desde tumor intraparenquimatoso inicialmente localizadas, para o desenvolvimento de metástases e piora geral. Para este efeito, comparou-se quatro modelos de xenoenxertos, incluindo a injecção SC usado como controlo, injecção percutânea ortotópico e implantação ortotópica cirúrgica, como descrito anteriormente, e injecção ortotópico transpleural como um novo modelo. Para permitir acompanhamento longitudinal da progressão do tumor e posterior avaliação da eficácia do tratamento, foi utilizada uma linha de células transfectadas com luciferase e executou

in vivo

bioluminescente de imagem. Viabilidade foi avaliada pela mortalidade peri-operatória e taxa de enxerto. relevância clínica foi avaliada pela posição inicial intra parenchymatous, extensão loco-regional, extensão metastática, a sobrevivência mediana e aspecto histológico. Em uma análise exploratória, a identificação de células tumorais circulantes (CTCs) foi realizada utilizando o ensaio Cellsearch® (Veridex LLC, EUA).

Materiais e Métodos

linha celular

a linha celular de adenocarcinoma do pulmão humano A549 estavelmente transfectadas com luciferase (A549luc) foi adquirido a partir de células Caliper Lifesciences Corp. foram cultivadas em meio completo, constituído por 10% (v /v) de soro bovino fetal, 2 mmol de L-glutamina, e 50 unidades /mL de penicilina-estreptomicina, em meio RPMI (todos da Invitrogen). As células foram cultivadas a 37 ° C e 5% de CO2 numa incubadora, testado como micoplasma livre utilizando um kit de detecção de micoplasma de PCR (MycoProbe, R D Systems, MN, EUA), e testados quanto a luciferase positivo utilizando a aplicação directa de 2 mL de uma solução de 150 ug /ml de luciferina (Firefly luciferina, Caliper Lifescience Corp, EUA), seguido por imagiologia bioluminescente imediato (sistema IVIS, Caliper Lifescience Corp, Figura 1a).

a. As células A549 transfectadas estavelmente com luciferase foram testadas por aplicação directa de uma solução salina de soro (lado esquerdo, o controlo) ou luciferina (lado direito), e analisados ​​depois de imagiologia óptica (1 min após a adição de luciferina, exposição 1 minuto, forma escaninho). b. Os animais foram divididos em 4 grupos, injecção subcutânea (Grupo 1-SC), a injecção ortotópico percutânea sob controlo radiológico (grupo 2-PI), o implante ortotópico cirúrgica após entubação orotraqueal e toracotomia (grupo 3-SOI), e injecção ortotópico transpleural depois camada costal exposição cirúrgica (grupo 4-TOI).

Animais

ratinhos atímicos fêmea, de seis semanas de idade foram adquiridos a partir Janvier (Elevage Janvier, Mayenne, França), e manteve em condições adequadas. Uma vez que chegamos em nosso biotério, os ratos foram divididos em 4 grupos, submetidos a implante de enxertos seguindo os protocolos descritos abaixo (Figura 1b), e subsequente imagem de bioluminescência. Por taxa de mortalidade procedimento, a taxa de enxerto, foram determinados loco-regional e progressão metastática. O final da experiência foi definido como caquexia, dispneia, ou agravamento clínico. Os animais foram então sacrificados sem dor. tumor primário, pulmões e gânglios mediastinais foram cirurgicamente colhidos, fixo usando, um concentrado à base de água livre de formalina (Finefix, Milestone S.r.l., Sorisole, Itália), e embebidos em parafina. O exame histológico foi então realizada. mortalidade relacionada com o cancro foi avaliada. Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética local (CEEA IRCIV /IGR n ° 26, registrado no Ministério Francês de Pesquisa), e estavam em conformidade com a Directiva Europeia 86/609 /CEE e as leis e regulamentação francesa.

subcutânea (SC) (grupo 1 – SC)

Uma solução de 3 × 10

6 A549luc células em 200 ul de meio de cultura foi injectada por via subcutânea na região do flanco esquerdo dos animais ( n = 15), utilizando-se de 1 ml seringas de tuberculina com 30 g de agulhas hipodérmicas (Becton Dickinson, NJ, EUA)

percutânea injeção ortotópico (grupo 2 -. POI)

Animals (n = 30) foram anestesiados com isoflurano e colocado numa posição de decúbito dorsal. Sob o controlo radiográfico, 3 × 10

6 A549luc células de uma solução contendo 30 mL de meio de cultura, 10 mL de meio de contraste (Omnipaque 300, GE Healthcare SA, França), e 10 uL de rato sarcoma de matriz extracelular (Matrigel, BD Biosciences, NJ, EUA) foram injectados por via percutânea no pulmão esquerdo dos animais utilizando-se 1 ml seringas de tuberculina com 30 g de agulhas hipodérmicas (Becton Dickinson, NJ, EUA). Os ratos foram então deixe descansar em um tapete de aquecimento até se recuperar totalmente

implantação ortotópica cirúrgico (grupo 3 – SOI).

Como um primeiro passo, 3 células × 10

6 A549luc foram Injectaram-se subcutaneamente na região do flanco de 3 animais dadores. Uma vez que os tumores SC atingiu 50 mm3, os tumores foram colhidos e subdividido em 1 mm

3 peças que constituem enxertos tumorais. Os animais receptores (n = 25) foram anestesiados com injecção intraperitonial de xilazina (20 mg /kg) e cetamina (100 mg /kg), entubados utilizando um cateter IV 22 g, ventilados mecanicamente (volume de curso 200 ml, taxa de respiração = 120 golpes /min, ventilador Minivent Tipo 845, Harvard Apparatus, MA, EUA) e colocado em uma posição de decúbito lateral direito. A incisão da pele de 2 cm foi efectuada abaixo da omoplata esquerda e uma dissecção cortante dos músculos do peito foi executada, a fim de expor a camada costal. A 0,5 centímetros intercostais incisão entre as terceira e quarta costela na parede torácica foi feita, ea parede torácica foi aberta. O pulmão esquerdo foi retomada por uma pinça, pinça com uma braçadeira de carótida (Scanlan International, MN, EUA), incisão com bisturi, eo tumor foi introduzida imediatamente para o parênquima pulmonar. A incisão do parênquima pulmonar foi fechado com cola cirúrgica (Bioglue, Gamida, França). A incisão da parede torácica foi fechada por uma sutura de polipropileno 4-0 (Prolene, Ethicon Inc, EUA). Os ratos foram então deixe descansar em um tapete de aquecimento até se recuperar totalmente

transpleural injeção ortotópico (grupo 4 – TOI).

Animals (n = 30) foram anestesiados com injeção intraperitoneal de xilazina (20 mg /kg) e cetamina (100 mg /kg), e colocado numa posição de decúbito lateral direito. A incisão da pele de 2 cm foi efectuada abaixo da omoplata esquerda, e uma dissecção cortante dos músculos do peito foi executada, a fim de expor a camada costal. Ao observar o movimento pulmão esquerdo através da pleura, 3 × 10

6 A549luc células de uma solução contendo 10 mL de meio de cultura, e 10? L de rato sarcoma de matriz extracelular (Matrigel, BD Biosciences, NJ, EUA) foi injectado directamente através do espaço intercostal para o pulmão, a uma profundidade de 3 mm, usando uma agulha 29 G permanentemente ligado a uma seringa de insulina de 0,5 mL (Becton Dickinson, NJ, EUA). A incisão na pele foi fechada por uma sutura de polipropileno 4-0 (Prolene, Ethicon Inc, EUA). Os ratos foram então deixe descansar em um tapete de aquecimento até se recuperar totalmente.

imagem de bioluminescência

a imagem de bioluminescência foi detectada a partir de células A549 luciferase expressando (A549luc) após a implantação dos xenoenxertos em ratinhos. Luciferina (Firefly luciferina, Caliper Lifescience Corp, EUA) foi utilizado como o substrato para a luciferase de células tumorais que expressam e injectada intraperitonealmente a uma concentração de 150 mg /kg em PBS, 15 minutos antes da imagiologia. Os ratos foram então anestesiados com isofluorano a 2% e visualizados utilizando uma câmara CCD arrefecida (sistema IVIS, Caliper Lifesciences Corp, EUA). Os tempos de exposição variaram entre 1 minuto e 1 segundo. As imagens foram quantificados como fótons /s usando o software Vivendo Imagem (Caliper Lifesciences Corp, EUA). imagiologia bioluminescente foi realizada em um dia, em seguida, semanalmente, e, em seguida, imediatamente antes do sacrifício. taxa de implantação xenoenxerto foi definida como o número de tumor primário em imagiologia 2 semanas após o enxerto dividido pelo número de animais vivos após o procedimento. Subsequente extensão loco-regional, linfáticos e metástase haematog�ea taxas foram determinadas durante a 2 meses de acompanhamento, e confirmado por exame patológico no final dos experimentos.

Identificação de CTCs

Para melhor caracterizar SC e os modelos de injeção transpleural, buscou-se identificar CTCs nestes modelos, utilizando 2 grupos adicionais. No grupo 1 CTC, atímicos

ratinhos nus foram submetidos a injecção SC de células A549luc em ambos os flancos (n = 6). No grupo CTC 2, os animais foram submetidos a anestesia geral, peito incisão da parede, e a injecção de células transpleural no parênquima do pulmão esquerdo (n = 15). Após 2 semanas, a imagem de bioluminescência foi realizada, e foram identificados animais portadores de tumor. Durante a terceira semana, 6 animais portadores de tumor de cada grupo foram escolhidos aleatoriamente e anestesiado. Um punção de sangue venoso de 600 mL foi realizada no seio cavernoso e foi testado quanto à CTC usando o sistema CellSearch® e um protocolo modificado com base no kit CellSearch® celular epitelial (Veridex LLC, EUA). Resumidamente, para identificar CTC humanos no sangue de murganhos, cada 600 uL de amostras de sangue ratos foi misturado com 7 ml de sangue humano saudável. Em seguida, cada amostra foi automatizado enriquecidas em células que expressam a molécula de adesão de células epiteliais (EPCAM) com esferas magnéticas revestidas com anticorpo, e as células foram marcadas com o corante ácido nucleico fluorescente 4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindole dicloridrato (DAPI) . Os anticorpos monoclonais marcados por fluorescência específicos para os leucócitos (CD45-allophycocyan) e células epiteliais (citoqueratina 8,18,19-ficoeritrina) foram usadas para distinguir as células epiteliais a partir de leucócitos. Celular Enriquecimento e rotulagem foram realizadas utilizando o CellSearch® Autoprep. A identificação e contagem de CTCs foi realizada utilizando o CellSearch® Analyzer II. CTC foram definidos como as células nucleadas com falta de CD45 e que expressam a citoqueratina 8, 18, 19. Como controlo negativo, foi analisada uma solução contendo 600 uL de sangue não-tumor do rato rolamento e sangue humano saudável. Como um controlo positivo, 50 e 500 células A549luc foram analisados ​​em uma solução contendo 600 uL de meio e 7 mL de sangue humano saudável.

Análise estatística

variáveis ​​contínuas normalmente distribuídos foram expressos como médias ± desvio-padrão, e comparados com testes t desemparelhados. Os dados categóricos foram expressos como contagens e proporções, e comparados com os testes exato de Fisher. Todos os testes foram dois lados e um valor de p 0,05 foi considerado significativo. Todas as análises de dados foram realizadas com o software livre R (https://www.r-project.org, R Foundation for Statistical Computing, Viena, Áustria).

Resultados

Viabilidade

viabilidade foi avaliada por determinação da mortalidade peri-operatória e taxa de enxerto. A mortalidade perioperatória foi nula no grupo 1-SC utilizado como um controlo, e significativamente mais elevada no grupo 3-SOI (60%, p 0,001), mas não nos grupos 2-PI (6%, p = 0,79) ou 4- TOI (3%, p = 0,72). Avaliar o efeito de uma curva de aprendizado na mortalidade peri-operatória do grupo 3-SOI, observou-se uma diminuição não significativa na mortalidade entre os 10 primeiros animais e os antigos 15 animais (mortalidade de 80% vs 47%, respectivamente, p = .21 ). Não foi observada diferença significativa entre os grupos 2-POI e 4-TOI em relação à taxa de mortalidade peri-operatória (p = 0,99, Tabela 1). A taxa de enxertamento foi de 100% no grupo de 1-SC utilizado como um controlo, e significativamente inferior no grupo 2-PI (68%, p = 0,037), grupo 3-SOI (60%, p = 0,034) e grupo 4 -TOI (65%, p = 0,027). Não foi observada diferença significativa entre os 3 grupos experimentais em relação à taxa de enxerto (p = 0,90, Tabela 1).

relevância clínica

relevância clínica foi avaliada pela posição da inicial tumor, a imagem latente de extensão do tumor, análise de sobrevivência e exame histológico. O tumor inicial foi confinado ao tecido SC no grupo 1-SC e do parênquima do pulmão no grupo 3-SOI. No grupo 2-PI, 53% dos animais foram submetidos a semeadura pleural durante a injecção percutânea ortotópico e desenvolvido extensão regional loco inicial para ambos os pleura. Como o objetivo deste estudo foi obter um modelo de NSCLC intrapulmonar localizada, essa semeadura pleural imediata desclassificado da técnica. No grupo 4-toi, o tumor foi inicialmente confinado ao parênquima pulmonar (Tabela 1, Figura 2A e 2B). a imagem de bioluminescência encontrados curvas irregulares no grupo 1-SC e 3-SOI, com alta entre individual e variações cronológicas. Nenhum animal desenvolvido loco-regional ou extensões metastáticos durante o acompanhamento. No grupo 2-POI, nenhuma curva de bioluminescência foi traçado por causa da semeadura pleural perioperatória. Um animal desenvolvido metástase óssea. No grupo 4-TOI, a imagem de bioluminescência encontrada, uma curva exponencial normal após o dia 21. Sete por cento dos animais desenvolveram extensão loco-regional para pleura homolateral como uma evolução do tumor primário. Um animal metástase óssea desenvolvido (Tabela 1, Figura 2a). A análise de sobrevida revelou que a sobrevida mediana não foi alcançado após um seguimento de 2 meses no grupo 1-SC e 3-SOI. No grupo 2-POI, nenhuma curva de sobrevivência foi traçado por causa da semeadura pleural perioperatória. No grupo 4-toi, sobrevivência mediana foi de 40 dias (Tabela 1, Figura 2c). O exame histológico revelou tumores redondos SC com uma forma regular, alta proporção de carcinoma indiferenciado, algumas rupturas capsulares, e poucos vascular ou êmbolos linfáticos no grupo 1-SC. No grupo 2-POI, foram obtidos tumores intraparenquimatosas regulares, com uma baixa proporção de carcinoma indiferenciado, um elevado número de rupturas capsulares e vascular ou êmbolos linfáticos. No grupo 3-SOI, foram obtidos tumores intraparenquimatosas irregulares, com uma baixa proporção de carcinoma indiferenciado (+), rupturas capsulares (++) e um elevado número de vascular ou êmbolos linfáticos. Os resultados foram similares no grupo 4-TOI e grupo 2-POI (Figura 3, Tabela 2).

a. Evolução dos fótons COUNT (expresso como 10

6 fótons /s) ao longo do tempo, a partir do dia 0 (implantação) para o dia 63 (final do bioluminescente acompanhamento). Para cada tempo, a média e desvio padrão dos animais vivos são relatados. No grupo 2-PI, injecção percutânea levou a semeadura pleural em 53% dos casos, como raios-X de pós-operatório mostrou agente de contraste em qualquer espaço pleural esquerda, cavidade pleural direita (continuidade anatómica), ou ambos. b. evolução representante do sinal bioluminescente, a partir do dia 14 até o dia 42. No grupo 2-POI, semeadura pleural criado um sinal localizado na base direita do tórax, contrariando com o objetivo principal deste estudo. No seguimento subsequente como foram realizados para este grupo. c. A curva de sobrevivência a partir do momento da implantação do tumor para 2 meses, utilizando o método de Kaplan-Meier e 95% de intervalo de confiança de barras. A sobrevivência de 2 meses é de 100% no grupo de 1-SC, 40% do grupo 3-soi, e 65% no grupo 4-toi.

cirúrgico de implantação ortotópica (Grupo 3) resultou em localizada tumores infiltrantes, ao passo que a injecção ortotópico percutânea (grupo 2) e de injecção ortotópico transpleural (grupo 4) resultou em nódulos arredondadas localizadas. O exame histológico revelou uma elevada proporção de carcinoma indiferenciado no grupo tumor 1-SC, mas uma baixa proporção nos 3 grupos experimentais. Além disso, os 3 grupos experimentais foram associados com mais ruptura de cápsula e embolia vascular que o grupo 1-SC.

Identificação de CTCs

taxas de implantação xenoenxertos foram de 100% no CTC grupo 1 (SC, n = 6) e 60% no grupo CTC 2 (TOI, n = 9). Três ensaios Cellsearch® foram realizados em cada grupo de controlo e 6 ensaios Cellsearch® foram realizados em cada grupo experimental. Os controlos negativos demonstrou zero ou um CD45-, DAPI +, + CKPE células por ensaio (dados não apresentados). Os controlos positivos demonstraram uma correlação entre o número de células tumorais em solução e a contagem Cellsearch® CTC (Figura 4a e 4b). Em CTC grupo 1-SC, 5 ensaios (83%) foram positivos para detecção de CTCs (CTCs faixa de nível 2-5, média de 2,5 ± 1,76). No grupo CTC 2-TOI, 5 ensaios foram positivos para detecção de CTCs (CTCs faixa de nível de 2-21, significa 9,5 ± 9,35). Todos juntos, 3 semanas após a implantação do tumor, CTC foram detectados em 83% de

ratinhos nus portadores de tumores SC ou NSCLC ortotópicos (Figura 4C e 4D). Ao comparar os grupos, a diferença nos níveis CTC mostrou uma tendência de significância estatística (p = 0,058, Figura 4c, Tabela 2).

a. Representação da coloração de células circulantes utilizando o ensaio Cellsearch®. CTC são definidos como CD45-, DAPI +, e células CKPE +. – Linha superior: como controlo positivo, e 50 500 células A549luc foram analisados ​​em uma solução contendo 600 uL de meio e 7 mL de sangue humano saudável. Aqui, como um exemplo, tanto CD45-, DAPI +, células CKPE + são células de tumor. – Linha inferior: representação dos resultados dos grupos experimentais. Aqui, como um exemplo, este CD45-, DAPI +, + CKPE célula é um CTC. b. A correlação entre o CellSearch ® CTC contagem e o número de células tumorais em solução. Como controlos, 0 (controlo negativo), 50 e 500 (controlos positivos) A549luc células foram analisadas em uma solução contendo 600 uL de meio e 7 mL de sangue humano saudável. Esta experiência demonstrou uma correlação entre a contagem de Cellsearch® CTC e o número de células tumorais em solução (R ​​

2 = 0,99857). c. Número de CTC de acordo com o grupo experimental, CTC grupo 1 (SC) ou CTC grupo 2 (ortotópico). A positividade geral do ensaio CellSearch ® é comparável em ambos os grupos (83%), com uma tendência para mais CTC no ortotópico em vez de no modelo subcutâneo. d. Representação do sinal bioluminescente e número de CTC detectada em cada um dos 12 animais.

Discussão

local de implantação do tumor e os impactos método de desenvolvimento do tumor e cinética

Comparando SC, injeção ortotópico percutânea e modelos de implantação ortotópicos cirúrgicos com a intenção de aperfeiçoar o acompanhamento da progressão do tumor usando a imagem de bioluminescência, enfrentamos os limites destes modelos, incluindo discrepância órgão (SC), a semeadura pleural frequentes (injeção ortotópico percutânea) e alta perioperatório mortalidade (implante ortotópico cirúrgica). Além disso, nenhum destes modelos de permitir um seguimento fiável-se de progressão tumoral utilizando imagiologia bioluminescente. Por isso, desenvolvemos um modelo de injeção ortotópico transpleural, combinando baixa mortalidade perioperatória, a taxa de enxerto razoável, escassez de semeadura pleural e progressão do tumor com metástase para o qual a progressão do tumor pode ser monitorado por imagem de bioluminescência. Além disso, este estudo permite a identificação dos CTC em modelos murinos de NSCLC, pela primeira vez até à data. Acreditamos que além de imagiologia funcional, a aplicação na pré-clínica em estágio vivo de CTCs contribuirá para definir biomarcadores da carga tumoral e eficácia do tratamento em ensaios clínicos subsequentes.

modelos de xenoenxertos SC

xenoenxertos SC a partir de linhas celulares derivadas de humanos para animais imunodeficientes têm sido o padrão ouro de experimentos pré-clínicos de cancro por décadas [14]. Este modelo apresenta várias vantagens, incluindo viabilidade técnica (ausência de anestesia, fácil de realizar a injeção) e acessibilidade tumor (medição direta do tumor SC permitindo acompanhamento longitudinal). No entanto, os modelos de SC são limitadas pela discrepância entre a origem xenotransplante e microenvironnement de acolhimento, incluindo matriz extra-celular, sinais parácrinos e, portanto, não modelam a teoria de Paget “semente e solo” [22]. Esta discrepância foi encontrado para impactar a resposta do tumor a agentes citotóxicos e radioterapia [23], [24] e, certamente, o impacto de resposta a novos agentes anti-cancro. Esta discrepância pode ser de importância crítica em NSCLC, foram hipóxia e neoangiogénese desempenhar um papel importante na progressão do tumor [25], e ocorrem de modo diferente em SC e xenoenxertos intratorácicas [26]. Por último, apenas uma minoria dos modelos SC divulgar e progresso para o estágio metastático, a ausência de progressão de localizada a fase metastática através da extensão dos linfonodos loco-regional é, portanto, uma das principais limitações dos modelos de SC, enquanto a principal causa (2/3) de morte por cancro é a doença metastática.

Estas diferenças têm importantes implicações para a progressão do tumor, com poucas células tumorais circulantes e sem metástases em nossos experimentos, apontando um grande limite para avaliação de medicamentos, com dois riscos. O primeiro risco é a empurrar para a clínica uma molécula ou uma combinação de drogas com pouca ou nenhuma eficácia. Como um exemplo, a combinação de inibidores de quimioterapia e EGFR provou eficácia em modelos SC de NSCLC [27], [28], mas nunca chegaram a eficácia significativa em ensaios clínicos, incluindo pacientes com NSCLC não seleccionadas sobre o status de EGFR [3], [10] , [29]. O segundo risco é parar o desenvolvimento de medicamentos promissores. A título de exemplo, antagonista de HIF-1alfa PX-478 não apresentou actividade mensurável contra xenoenxertos SC NSCLC, mas a progressão inibida e propagação do cancro do pulmão ortotópico humano de células pequenas e adenocarcinoma do pulmão em ratinhos, e finalmente é testado em fase um ensaio [30].

em conjunto, esses dados sugerem que xenoenxertos SC não são inteiramente adequadas para o estudo pré-clínico do NSCLC, e só deve ser utilizada e analisada com cuidado. Conclusões semelhantes foram retirados de testes de drogas pré-clínicos SCLC [31].

modelos ortotópicos anteriores

Para tirar a influência da especificidade do órgão e tumor micro environnement em conta, modelos ortotópicos têm sido progressivamente desenvolvido ao longo nos últimos 20 anos, com o objectivo final de obter um único tumor de pulmão intraparenquimatoso que imitam a situação clínica e permitir acompanhamento longitudinal. Intravenosos [32], intrabronquial [33] – [35] e administração intrapleural [36], [37] de pulmão linhas celulares de cancro resultou em pleural, avançado localmente ou tumores múltiplos síncrona. Portanto, esses modelos podem ser interessante para estudar estas situações especiais, mas não pode ser alargada a intrapulmonar localizada NSCLC, constituindo a maioria dos pacientes com NSCLC e a base da progressão do tumor.

modelos de ratos geneticamente modificadas (GEMMs) também foram desenvolvidos para estudar NSCLC em ratinhos. Estes animais são normalmente p53 mutada, favorecendo a instabilidade genética e a formação do tumor, e desenvolver tumores pulmonares movidas pelo EGFR [38], KRAS [39], PIK3CA [40], BRAF [41] activação oncogénica ou na presença de fusão EML4-ALK oncogene [42]. KRAS cancro do pulmão mutada pode ser observado em estirpes de ratinho que transportem alelos oncogénicas de KRAS que podem ser activados apenas em um evento de recombinação espontâneo em todo o animal [43], ou depois da activação esporádica KRAS através Cre-lox mediada por recombinação somática após a entrega mediada adenoviral Cre recombinase no epitélio pulmonar [39]. Ambos os modelos permitem o desenvolvimento de cancro do pulmão com mutação KRAS num curto período de tempo. No entanto, estes modelos são limitados pela sua distância a situação clínica, como mutações de um ou dois oncogenes ou genes supressores de tumores estão longe de ser a progressão passo múltiplos de cancro pulmonar que ocorre na inflamação crónica subjacente. Além disso, os modelos GEMM resultar em centenas de NSCLC primária no mesmo período de tempo esses são difíceis de seguir e quantificar durante os testes pré-clínicos e de imagem não-invasiva. Apesar destes inconvenientes, GEMM têm a vantagem, para refinar a definição de oncogenes e de tomar em consideração a resposta imune. Estudos recentes têm relatado que GEMM pode ser de interesse ao estudar a eficácia dos tratamentos comuns NSCLC [44].

O implante cirúrgico do fragmento NSCLC para o pulmão de ratos imunodeficientes via toracotomia foi relatada pela primeira vez em 1992 [21], [45], [46].