Abstract

Fundo

reação do tumor-estroma está associada à ativação dos fibroblastos. Nemosis é um novo tipo de activação de fibroblastos. Isso leva a um aumento da produção de factores de crescimento e proteínas pró-inflamatórias e proteolíticas, enquanto ao mesmo tempo as proteínas do citoesqueleto são degradados. Aqui usamos emparelhado células recorrentes carcinoma epidermóide oral (SCC) normal de fibroblastos da pele e fibroblastos associados ao câncer (CAF) e primário e para estudar a resposta nemosis.

principais conclusões

Fibroblasto nemosis foi analisados ​​por proteínas e expressão gênica e a regulação parácrina com ensaio de formação de colónia. Uma das estirpes de fibroblastos normais, FB-43, regulada positivamente de COX-2 em nemosis, mas FB-74 células não o fez. Em contraste, a CAF-74 esferóides expressa COX-2, mas CAF-43 células não o fez. proteína alfa-SMA foi expressa em ambas as linhagens CAF e no FB-74 células, mas não no FB-43 fibroblastos. Seus níveis de mRNA foram reprimidos em nemosis, mas as FAC começou a recuperar a expressão. FSP1 ARNm foi regulada negativamente em fibroblastos normais e células CAF-74, mas não em fibroblastos CAF-43. Serina-protease FAP foi regulada em todos os fibroblastos, ainda mais em FAC nemotic. VEGF, HGF /SF e mRNA FGF7 níveis foram regulados positivamente com o grau variável na nemosis. FAC aumentou a formação de colónias de linhagens de células de tumor primárias UT-SCC-43A e UT-SCC-74A, mas fibroblastos normais inibiram o crescimento independente de ancoragem de células UT-SCC-43B e SCC-UT-74B recorrentes.

Conclusões

resposta Nemosis, como observado por COX-2 e a indução do factor de crescimento, e a expressão de marcadores CAF ct-SMA, FSP1 e FAP, varia entre populações de fibroblastos. A expressão dos marcadores de CAF difere entre fibroblastos normais e FAC em nemosis. Esses resultados reforçam a heterogeneidade dos fibroblastos e à evolução das propriedades promotoras de tumor de FAC

Citation:. Räsänen K, Virtanen I, Salmenperä P, Grenman R, Vaheri A (2009) As diferenças de Nemosis Resposta do normal e câncer-Associated fibroblastos de pacientes com Oral carcinoma espinocelular. PLoS ONE 4 (9): e6879. doi: 10.1371 /journal.pone.0006879

editor: Immo A. Hansen, New Mexico State University, Estados Unidos da América

Recebido: 09 de junho de 2009; Aceito: 06 de agosto de 2009; Publicação: 01 de setembro de 2009

Direitos de autor: © 2009 Räsänen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios da Fundação finlandesa Cultural, Magnus Ehrnrooth Fundação, o finlandês Fundação Diabetes Research, EVO Research Grant, Organizações Cancer finlandesa e Academia da Finlândia. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

microambiente tumoral desempenha um papel importante na progressão do cancro e fibroblastos são conhecidos por serem os principais componentes do estroma tumoral. Recentemente, foi sugerido que os fibroblastos estromais inicialmente inibir fases precoce da carcinogénese e depois, sob a influência parácrina do epitélio transformadas tornam-se activas levando a promoção do crescimento de cancro. A dependência de carcinomas em fibroblastos do estroma diminui à medida que progride o cancro, em parte, através de um comutador em células epiteliais de parácrino para autócrino regulação [1], [2]. Entre os fibroblastos activados são fibroblastos associados ao cancro (CAF), que são caracterizados pelo aumento do índice mitótico, mutações em genes supressores de tumor, tais como p53 e pelo aumento da secreção de factores de crescimento, quimiocinas e componentes da matriz extracelular (ECM) [2], [3], alterações que todos estão envolvidos no crescimento e invasão tumoral [4] marcadores CAF .Widely utilizados incluem a actina de músculo liso-α (α-SMA), fibroblasto uma proteína específica (FSP1, também conhecido como S100A4) e proteína de activação de fibroblastos (FAP, também conhecido como seprase) [5]. a-SMA, um componente do citoesqueleto, é o marcador mais utilizado para os fibroblastos activados. Torna-se incorporada fibras de stress aumentando assim a actividade contráctil dos fibroblastos [6]. FSP1 pertence à super-S100 família de proteínas de ligação de cálcio. Ela promove o crescimento do tumor através do controlo do ciclo celular e integridade do citoesqueleto [7]. FAP é uma protease de serina que não é expressa em tecidos adultos normais, mas a sua expressão é induzida em fibroblastos activados que respondem a ferida reacção de cura do tumor e de estroma [8]. No entanto, é bem estabelecido que os fibroblastos são heterogêneos [9], [10] e que FAC diferente expressam estes marcadores [11], [12].

Nemosis, um fenómeno de ativação de fibroblastos (para revisão ver Vaheri et ai. 2009 [13]), anteriormente tem sido estudada utilizando fibroblastos dérmicos normais [14] – [19]. A formação de um esferóide fibroblastos provoca miríade de genes a serem expressos diferencialmente nestas fibroblastos activados. Dois padrões distintos pode ser encontrado na expressão: i) expressão de factores de crescimento e proteolíticas e proteínas pró-inflamatórias e aumenta ii) a expressão de componentes do citoesqueleto diminui. Com base nos resultados anteriormente publicados, ciclo-oxigenase-2 (COX-2), que é conhecida por estar associada com a inflamação e as fases precoce da carcinogénese, e factor de crescimento de hepatócitos /factor de dispersão (HGF /SF), que tem sido mostrado para promover a célula tumoral invasão, foram consideradas proteínas característicos da nemosis. agrupamento espontânea de fibroblastos em esferóides também pode ser induzida por meio condicionado de células de tumor [14], [15]. Nós mostramos anteriormente que a cultura de esferóides de fibroblasto sob a influência de queratinócitos HaCaT benignos inibe nemosis, como pode ser visto pela expressão reprimida da COX-2, enquanto que as células HaCaT malignas têm um efeito promotor da nemosis em fibroblastos normais, manifesta-se como supra-regulação melhorada sobre a COX-2 , HGF /SF e VEGF (fator de crescimento endotelial vascular) [17].

Cabeça e carcinoma de células escamosas do pescoço (CECP) é a sexta neoplasia maligna mais comum em todo o mundo e para a sobrevivência geral do paciente é pobre. Isto é principalmente devido às altas taxas de recorrência do cancro e invasão local, em parte, causada por mutações do gene p53, que pode ser encontrado em mais do que 70% de HNSCCs [20], [21]. Cirurgia e radioterapia são as linhas mais usadas de tratamento e atualmente a terapia alvo molecular único aprovado para o câncer de cabeça e pescoço é cetuximab (Erbitux; ImClone Systems Inc., New York, NY), um inibidor de anticorpo monoclonal do receptor do factor de crescimento epidérmico ( EGFR). No entanto, nem todos os pacientes com CECP beneficiar de terapias alvo EGFR, uma vez que a sobre-expressão, mas não parece mutação para determinar a resposta ao tratamento. Fase 3 de testes para CECP estão em andamento para a segmentação VEGF (Bevacizumab, inibidor de anticorpo monoclonal) e para p53 (INGN 201, a terapia genética) [22], [23]. Outro alvo potencial é COX-2 que tem sido encontrado para ser elevados em carcinoma de células escamosas oral (CCEO) e foi mostrado para diminuir a radiossensibilidade do tumor [24]. Estudos utilizando estirpes de células de pacientes emparelhados mostraram que existe uma correlação em radiosensitivities entre células CEs, fibroblastos da derme e fibroblastos associados ao cancro recolhidas a partir do mesmo indivíduo, e que estas diferenças individuais na sensibilidade à radiação pode prever o resultado da radioterapia [25], [ ,,,0],26].

com base nos resultados anteriores, que sob a influência de células malignas fibroblastos nemotic normais começam a se assemelhar a FAC, o objetivo deste trabalho foi estudar a resposta nemosis da pele autóloga e fibroblastos associados ao câncer, a comparar a expressão de marcadores da CAF entre estas estirpes fibroblastos e seu destino em nemosis e investigar como essas populações de fibroblastos diferentes influenciar as células SCC orais combinados-paciente. Nosso estudo mostra que ambos os fibroblastos normais e associados ao câncer mostram variação entre os indivíduos, vistos como diferentes níveis de expressão da CAF basais e diferentes respostas do fator de crescimento em nemosis, e ter um impacto diferenciado sobre as células SCC. O comportamento dos marcadores CAF estudados em nemosis seguido a resposta geral nemosis: citoesqueleto α-SMA e FSP1 foram reprimidos e proteolítica FAP foi regulada. A única exceção foi uma das estirpes CAF que upregulated FSP1 em nemosis. As principais diferenças sistemáticas entre fibroblastos normais e associados ao câncer foram os níveis basais de fatores de crescimento diminuiu em FAC ea capacidade da FAC nemotic para começar a recuperar a expressão α-SMA eo aumento da expressão FAP em nemosis comparação com suas contrapartes normais.

Resultados

populações de fibroblastos diferentes mostram diferenças na resposta a nemosis

em primeiro lugar queríamos investigar a expressão do marcador nemosis anteriormente utilizado COX-2 nas quatro populações de fibroblastos. Não houve expressão basal de COX-2 em qualquer das estirpes de fibroblastos, e que não foi induzida em cultura em monocamada. No entanto, quando cultivadas como esferóides os fibroblastos normais FB-43 começaram a expressar a COX-2 após 48 horas (Figura 1A), mas esta não foi observado em outros fibroblastos normais estirpe FB-74 (Figura 1C). Resultados opostos foram observados com os fibroblastos associados ao cancro, em que nenhum de COX-2 foi expressa no CAF-43 esferóides de fibroblastos (Figura 1B), mas as células CAF-74 começou a manifestar a COX-2 após 24 horas (Figura 1D). Estes resultados diferem dos publicados anteriormente e indicam que a COX-2 não deve ser usado apenas para medir a resposta nemosis.

Os fibroblastos foram cultivados como esferóides ou monocamada durante o tempo indicado. (A) FB-43 esferóides começou a produzir COX-2 após 48 horas e não α-SMA foi produzido, enquanto que as células CAF-43 (B) não induziu COX-2, mas expressou α-SMA. Ambos FB-74 (C) e CAF-74 (D) produzido α-SMA, mas de COX-2 apenas foi induzida em 74 CAF-esferóides. Todos os tipos de fibroblastos expressa quantidades iguais de vimentina. (E) Todas as células UT-SCC expressa COX-2, mas apenas 74A e 74B mostrou induzida níveis de p53.

Também olhou para os níveis de proteína de vimentina e α-SMA nestas células. Todos os quatro populações de fibroblastos expressa vimentina em quantidades iguais, como esperado, uma vez que os fibroblastos

in vitro

são considerados em estado de cicatrização de feridas lembrando. Ambas as estirpes CAF expressou α-SMA, CAF-74 pouco mais de CAF-43. Curiosamente, também as células normais FB-74 expressa α-SMA, mas não a expressão da proteína foi detectada na outra estirpe de células de fibroblastos normais FB-43. downregulation dependente do tempo da α-SMA foi visto em esferóides, mas não em culturas de monocamada, causada pela degradação do citoesqueleto nestes fibroblastos passando nemosis. Isto está de acordo com os resultados anteriores por Bizik et al. [14], onde diminuição dos níveis de actina foram utilizados como um marcador da degradação do esferóide. GAPDH foi usada como um controlo de carga.

A Figura 1E é uma imunotransferência das quatro linhas celulares de carcinoma UT-SCC. Todos eles expressa COX-2, mas curiosamente única UT-CCS 74A e 74B tinha um nível de proteína p53 induzida, sugerindo uma mutação de p53. Nós não conseguimos detectar a p53 em qualquer das populações de fibroblastos, uma noção de que concorda com o relatório por Qiu et al. [27] em que eles não poderiam detectar alterações genéticas somáticas no FAC.

expressão diferente de marcadores da CAF em linhagens de fibroblastos

Uma vez que os níveis de proteína de α-SMA variou entre diferentes populações de fibroblastos, nós decidiu investigar também a expressão de outros marcadores FSP1 CAF e PAF amplamente utilizado. padrão destes três genes em fibroblastos cultivados como esferóides durante 0, 24, 48 e 72 horas a expressão do gene foi analisada quantitativa utilizando PCR em tempo real. Q-PCR foi escolhido como o método através imunotransferência por causa da sua maior sensibilidade. GAPDH foi usada como um gene de referência que a expressão de genes alvo foi normalizada para, após o qual foram calculados os rácios relativos de expressão de dobra. O nível de expressão basal do α-SMA, FSP1 e FAP foi significativamente inferior (P 0,01) em Caf-43 do que as células normais no FB-43 fibroblastos (Figura 2A). No entanto, como pode ser visto na Figura 2B, tal não foi o caso com a CAF-74 fibroblastos, em que, em comparação com FB-74 células α-SMA rácio expressão era igual, FSP1 1,4 vezes maior e a relação de expressão FAP surpreendentemente 10 vezes mais elevada (P 0,01)

A expressão gênica de marcadores CAF foi estudada usando Q-PCR.. rácios de expressão (A) α-SMA, FSP1 e FAP foram significativamente menores (P 0,01) em células Caf-43 em comparação com células FB-43, mas igual ou superior a 74 CAF-fibroblastos. (B), quando cultivada como esferóides todos os fibroblastos subregulado expressão α-SMA, mas FAC começou a recuperar a expressão às 72 h (P 0,05 em FB-43 vs. CAF-43 e FB-74 vs. CAF-74) ( C) FSP1 foi regulada negativamente em fibroblastos normais e em Caf-74 células, mas não em Caf-43 células, (D) e FAP foi regulada positivamente em todas as linhas de células que atravessam nemosis, ainda mais em FAC (P 0,05 em 72 h CAF -43, quando comparado com 72 horas FB-43). Colunas: média; barras de erro; SEM.

Nemosis resposta dos marcadores CAF entre essas populações de fibroblastos também mostrou variação. O nível de α-SMA foi drasticamente reprimidos em esferóides, reflectindo os níveis de proteína e indicando a decomposição do citoesqueleto nestes esferóides. Isso também era verdade para FB-43 células, para os quais não foi possível detectar a expressão da proteína. Diferindo dos fibroblastos normais, as FAC começou a recuperar a expressão α-SMA às 72 horas; quando comparado com fibroblastos normais, o aumento foi estatisticamente significativa (P 0,05) (Figura 2C). FSP1 ARNm diminuída, como esperado, em ambas as estirpes de células de fibroblastos normais e em células Caf-74, mas surpreendentemente aumentada em 43 CAF-esferóides (Figura 2D). O terceiro FAP marcador CAF foi induzida em nemosis em todas as populações de fibroblastos, seguindo a impressão digital geral nemosis. Esta indução foi maior em esferóides CAF do que em esferóides de fibroblastos normais (P 0,05 em CAF-43 vs. FB-43, não é estatisticamente significativa em 73 células, devido à grande variação entre as amostras) (Figura 2E)

. a expressão diferencial de factores de crescimento em fibroblastos normais e associados ao cancro

a outra característica da nemosis é o aumento da produção de vários factores de crescimento, incluindo VEGF, HGF /SF e FGF7 (KGF). Portanto utilizou-Q-PCR para estudar os níveis de expressão destes genes nas quatro populações de fibroblastos. Ambas as estirpes CAF tinham baixos níveis basais de expressão de VEGF, HGF /SF (P 0,05) e FGF7 (P 0,01) do mRNA, em comparação com os fibroblastos normais emparelhados (Figura 3A e 3B). Quando cultivados como esferóides todos os quatro populações de fibroblastos mostrou upregulated VEGF, HGF /SF e a expressão de ARNm FGF7. indução de VEGF foi mais elevada em células CAF-74 (mais de 15 vezes) (Figura 3C), enquanto que a indução máxima de HGF /SF foi visto em células CAF-43 (acima de 30 vezes) (Figura 3D). níveis FGF7 foram regulados de forma ligeiramente diferente; mais de 6 vezes de indução foi observado em FB-43 células, outras células tinham uma média de indução 5 vezes, e curiosamente na CAF-74 células no ponto de tempo 72 horas esta indução tinha descido para 2,5 vezes (Figura 3E) .

expressão do gene fator de crescimento foi estudada usando Q-PCR. (A e B) ambas as linhas celulares CAF tinham reduzido de expressão de HGF /SF (P 0,05) e FGF7 (P 0,01) e todos os três factores de crescimento foram regulados positivamente de forma variável em nemosis (C – VEGF, D – HGF /SF e e – FGF7). Colunas: média; barras de erro; SEM.

regulação parácrina entre fibroblastos e células SCC

Anchorage independente crescimento de linhas celulares de carcinoma UT-SCC foi testada usando o ensaio de soft-agarose. Durante o período de observação de três semanas todas as quatro linhas celulares de carcinoma de colónias formadas, mas clara diferença entre as linhas de células de tumores primários e recorrentes foi observado (Figura 4). Quando cultivadas em paz, ambas as linhas celulares de tumores recorrentes UT-SCC-43B e UT-SCC-74b formada por duas vezes a quantidade de colônias em comparação com linhagens de células tumorais primárias UT-SCC-43A e UT-SCC-74A; a diferença foi estatisticamente significativa em ambos os casos (P 0,05). A monocamada subjacente de fibroblastos normais FB-FB-43 e 74 aumentaram ligeiramente o número de colónias de células de carcinoma 43A e 74A, respectivamente. Aumento do número de colónias foi ainda aumentada quando as células 43A e 74A SCC foram cultivadas sob a influência da CAF-43 e CAF-74 (P 0,05), respectivamente. Curiosamente, quando a cultura das células 43B e 74B SCC mais invasivas com FB-FB-43 e 74 fibroblastos, uma diminuição no número de colónias foi observado; este efeito foi mais pronunciado com 74b células (p 0,05 em PC-74 em comparação com o controlo). CAF-43 e CAF-74 fibroblastos restaurado o número de colónias a mesmo nível de controle, mas não aumentar ainda mais a formação de colónias de células SCC recorrentes.

formação de colónias UT-SCC foi estudado com o ensaio de soft-agarose . Todas as células UT-SCC formado colónias em agarose macia, recorrente SCC (B e D) duas vezes mais que as células SCC primários (A e C) (P 0,05). fibroblastos normais aumentou o número de colónias de células de carcinomas primários e esta foi adicionalmente aumentada com células CAF (P 0,05) (A e C). Recorrente formação de colónias de células SCC foi inibir com fibroblastos normais (P 0,05 em PC-74 em comparação com o controlo) e restaurado para controlar o nível por FAC (B e C). Colunas: média; barras de erro; SEM

Os UT-SCC colônia resultados de formação estavam na linha entre as células obtidas a partir dos dois indivíduos.; no entanto, houve variação entre os indivíduos quando se observa de perto as culturas monocamada de fibroblastos subjacentes. esferóide formação espontânea foi observada na cultura em monocamada subjacente de FB-43 e CAF-43 fibroblastos quando co-cultivadas com células tanto 43B SCC (Figura 5A-D) e 43A. FB-74 e CAF-74 não formam espontaneamente esferóides em qualquer uma das condições acima, mas eles não crescem mais rápido quando co-cultivadas com mais 74b células malignas (Figura 5G-H). As Figuras 5I-J apresenta a formação espontânea de esferóide 43 com fibroblastos de células 43A e 43B SCC. Com ambas as linhas de células UT-SCC, 43 CAF-células formadas significativamente mais do que os esferóides FB-43 fibroblastos (P 0,05). As duas linhas de células SCC diferentes não influenciou significativamente a formação de fibroblastos esferóide; apesar de um ligeiro aumento foi visto em CAF-43 esferóides com células 43B SCC recorrentes. Nenhum dos tipos de fibroblastos (FB-43, CAF-43, FB-74 e CAF-74) colónias em agarose macia formados.

imagens representativas das culturas de fibroblastos monocamada subjacentes. agrupamento espontânea (setas) é visto em PC-43 e células CAF-43 sob a influência das células SCC emparelhado 43A (A e B) e 43B (C e D). Em contraste, FB-74 (E e G) e CAF-74 (F e H) não formar esferóides. Barra de escala 60? m. O número de esferóides formada foi calculada a partir das culturas em monocamada de fibroblastos (I e J). CAF-43 células formadas significativamente mais esferóides de células FB-43 (P 0,05). Colunas: média; barras de erro; SEM.

Para elucidar a razão para o comportamento diferente das estirpes de fibroblastos em culturas em monocamada, e particularmente a taxa de crescimento lento de Caf-74 células, foi realizada SA-beta-gal (SA- p-gal) coloração. actividade SA-β-gal é o marcador mais utilizado para a senescência celular. senescência prematura induzida pelo stress é causado pelo stress oxidativo, danos no DNA e activação do oncogene [28]. Como esperado, as células CAF-74 mostraram forte coloração SA-β-gal. CAF-43 fibroblastos foram bem positivo, mas CAF-74 foi significativamente maior (P 0,01). As células senescentes (Figura 6)

imagens representativos de culturas de fibroblastos em monocamada coradas para a actividade de SA-β-gal. FB-43 (A) e FB-74 (C) mostram pouca ou nenhuma coloração; FAC são positivos (B e D). A barra de escala 200? M. CAF-74 tinham significativamente mais (P 0,01) células SA-β-gal em comparação com a CAF-43 (E). Colunas: média; barras de erro; SEM.

Discussão

carcinomas primários são considerados órgãos não organizados que são compostas de vários tipos de células, incluindo as células cancerígenas, os fibroblastos e outras células mesenquimais, e células relacionadas com imunidade e vasculatura. O microambiente do tumor de estroma leva a activação de fibroblastos e parácrina de sinalização entre os fibroblastos e células cancerosas [29]. Em nemosis, fibroblastos activados começar a produzir proteínas envolvidas na inflamação, cancro e progressão proteólise e, ao mesmo tempo regular negativamente a expressão de proteínas do citoesqueleto [14] – [19].

O objectivo deste trabalho foi o de investigar a resposta nemosis do normal e fibroblastos associados ao câncer, e para estudar o padrão de expressão de marcadores da CAF e seu comportamento em nemosis pareados por paciente. Apenas uma das estirpes normais de fibroblasto (FB-43) e um dos FAC (FB-74) induzidas COX-2 em nemosis. Isto está em contraste com os resultados previamente publicados, que a indução da COX-2 tem sido considerada uma característica de indicação nemosis. No entanto, nesses estudos fibroblastos ter sido de origem neonatal e fibroblastos aqui temos utilizado obtido a partir de adultos. Este resultado conflituoso indica, portanto, que a COX-2 não deve ser unicamente usado para medir a resposta nemosis, mas outros marcadores, tais como o perfil de proteínas segregadas, deve ser investigada, bem.

O outro elemento-chave de nemosis é a degradação dependente do tempo do citoesqueleto. Em nível de proteína de três das estirpes de fibroblastos expressas α-SMA, surpreendentemente também os fibroblastos de pele normal FB-74. A outra linhagem de fibroblastos normais FB-43 não expressaram α-SMA ao nível da proteína. No entanto, quando se mede os níveis de mRNA com o método mais sensível Q-PCR, todas as quatro populações de fibroblastos mostrou expressão α-SMA e esta foi regulada negativamente em nemosis. A infra-regulação dependente do tempo tanto no nível de proteína e ARNm está em linha com os resultados anteriores sobre nemosis, indicando a decomposição do citoesqueleto. Curiosamente as FAC começou a recuperar a expressão de mRNA α-SMA às 72 h, a diferença foi significativa quando comparada com os seus homólogos normais. Em contraste com os nossos resultados, um estudo realizado por Shannon et al. [30] demonstraram que os fibroblastos de pele normal, mas não fibroblastos orais expressa α-SMA. No entanto, resultados mais recentes mostraram, de acordo com os nossos resultados, que os fibroblastos normais orais expressar α-SMA e esta expressão aumentada quando estas células foram cultivadas em meio condicionado obtido a partir de células CEs [31]. Estes resultados contraditórios pode vir em parte, do método que foi utilizado para medir a expressão α-SMA; em utilizou-se o primeiro immunoblotting, no segundo o método foi a imunohistoquímica um pouco mais sensível.

Nós investigamos também os níveis de mRNA de dois outros marcadores da CAF, FSP1 e FAP. Em nemosis FSP1 níveis diminuiu em FB-43, FB-74 e CAF-74 esferóides, mas aumentou em células CAF-43. O terceiro investigado FAP marcador CAF foi regulada em nemosis, mais em FAC que nos fibroblastos normais, a diferença foi significativa com as estirpes de fibroblastos 43. Com todos os três marcadores CAF a resposta nemosis seguiu o padrão de diminuição da expressão de genes do citoesqueleto (α-SMA e FSP1) e aumento da expressão do gene proteolítica (FAP). Claramente resposta diferente foi visto com células CAF-43, onde, em vez de regulação negativa da FSP1, os níveis aumentaram em nemosis.The heterogeneidade dos fibroblastos torna-se evidente quando se olha para os níveis basais da expressão do marcador CAF; células CAF-43 tinham níveis mais baixos de todos os três marcadores, CAF-74 tinham menos α-SMA, um pouco mais FSP1 e mais de 10 vezes mais FAP. Estes resultados também enfatizar que α-SMA, o marcador CAF /miofibroblastos mais comumente usado, não deve ser utilizado exclusivamente para definir fibroblastos activados.

Outra marca de nemosis é a indução de factores de crescimento. Demonstrou-se que os fibroblastos produzem significativamente mais orais FGF7 e HGF /SF quando comparado com os fibroblastos da pele [30]. Estes dois factores de crescimento, em conjunto com o VEGF, são conhecidos por serem importantes na reparação de feridas e progressão do cancro [32], [33]. A expressão basal de VEGF, HGF /SF e ARNm FGF7 foi menor do que no FAC em fibroblastos normais, e isto está em contraste com os resultados anteriores [30]. No entanto, a taxa de crescimento destas células foi mais lento do que os seus equivalentes normais, o que pode reflectem a diminuição da produção de factores de crescimento. A actividade de SA-β-gal das FAC suporta esta teoria, indicando que estas células são senescente. A necessidade para estes factores de crescimento a ser segregada por fibroblastos poderiam ser reduzidos nos FAC uma vez que as próprias células tumorais, juntamente com os macrófagos e células endoteliais infiltradas, são capazes de produzir estes factores. Como esperado, o VEGF, o HGF /SF e FGF7 mRNAs foram regulados positivamente em nemosis de fibroblastos, e o nível de indução variada entre populações de fibroblastos. indução de VEGF foi maior em CAF-74 esferóides, HGF /SF em CAF-43 esferóides e FGF7 no FB-43 esferóides.

Com base nestes resultados, parece que a capacidade de fibroblastos normais e associados ao câncer para produzir estes factores de crescimento em nemosis é algo relacionado na medida em que são necessários na progressão do cancro. A dependência de tumores em fibroblastos do estroma, e particularmente sobre os factores de crescimento que produzem, diminui no decurso da progressão do tumor. As células epiteliais requerem FGF7 para quebrar a polarização epitelial. FGF7 só é expresso pelas células do estroma e do seu receptor FGFR2IIb apenas pelas células epiteliais, o que indica o papel FGF7 no início da progressão tumoral [34]. Das populações de fibroblastos estudaram as células FB-43, que parecem ser mais normal das cepas estudadas (com base de indução de COX-2 e da falta de α-SMA), teve a maior indução FGF7 em nemosis. HGF /SF é necessária para a migração /espalhamento das células epiteliais a partir do ponto de quebra inicial. células Nemotic CAF-43 produziu mais HGF /SF do que as outras três linhagens celulares. Apoiar esta Kankuri et al. [15] demonstraram que HGF /SF produzido por esferóides de fibroblastos promove directamente a invasão de células do cancro. Também um outro estudo mostrou que os fibroblastos orais conduzir a invasão de células CEs, aumentando a secreção de HGF /SF [35]. O VEGF é necessário mais tarde na progressão de tumores, quando a massa de células de cancro estende-se do ponto em que ele já não pode crescer sem o fornecimento de oxigénio. VEGF, segregada por fibroblastos, induz a angiogênese através do recrutamento de células endoteliais para formar novos vasos sanguíneos [36]. . células CAF-74, que são senescentes, têm, de longe, o maior nível de VEGF no nemosis

Tem sido bem estabelecido que FAC, mas não fibroblastos normais, são capazes de promover a progressão do tumor [37] – [ ,,,0],39]. Resultados mais recentes têm mostrado que, inicialmente, os fibroblastos normais de inibir o crescimento de células cancerosas [2], e os nossos resultados presentes acordo com esta noção. Mostramos aqui que os fibroblastos normais de fato inibir a formação de colónias de células SCC recorrentes, mas curiosamente não foi visto com células de tumor primário. Os FAC parecem ser capazes de influenciar apenas as células SCC primárias e não as células recorrentes. Os FAC produziram níveis mais baixos de factores de crescimento, e pode ser que, por essa razão eles são capazes de influenciar a mais sensível CCEs primária, mas as células menos sensíveis recorrentes não respondem a esta menor quantidade de factores de crescimento segregados.

A formação esferóide espontânea observada de FB-43 e CAF-43 em culturas em monocamada está em linha com os resultados de Kankuri et al. [15], em que o agrupamento espontânea de fibroblastos, isto é nemosis, poderia ser conseguida através da adição de meio condicionado derivado de células de tumor a uma monocamada de fibroblastos. No entanto, não encontramos isso com as estirpes de fibroblastos de outro paciente SCC. Isto pode ser parcialmente devido à indução de p53 supressor de tumores nas células 74A e 74B SCC. No entanto, os fibroblastos fez crescer mais rapidamente sob a influência de células SCC 74B; isso também era verdade com as células CAF-74 que parecem estar em um estado de senescência induzida pelo estresse. Ainda mais, nós não ver o crescimento independente de ancoragem dos fibroblastos, em conflito com os resultados obtidos com carcinoma associado fibroblastos prostático e próstata [40]. Possíveis explicações para isso são variações individuais e a origem dos fibroblastos. Vale a pena notar que, nos experimentos soft-agarose as células SCC e fibroblastos não estavam em contato direto, mas separados por uma camada sólida de agarose, e as culturas não são reabastecidos por meio fresco. Por conseguinte, a sinalização parácrina entre estes dois tipos de células tem de ser mediada por factores solúveis.

Em conclusão, este estudo demonstra claramente que os fibroblastos obtidos a partir de diferentes indivíduos variam na expressão dos genes e que o comportamento e a expressão de marcadores CAF difere entre fibroblastos normais e FAC em nemosis. Tanto os fibroblastos normais e associadas a cancro, modulam as células tumorais, fibroblastos normais por inibição do crescimento de células SCC invasivos e FAC através de uma melhoria do crescimento das células primárias SCC. Nemosis, um

in vitro

modelo de ativação de fibroblastos, pode ter a sua

in vivo

homólogo em fibroblastos associados ao câncer e é uma ferramenta valiosa para estudar as variações entre fibroblastos obtidos de indivíduos diferentes. resposta Nemosis, particularmente dos marcadores CAF ct-SMA e FAP, poderia, por conseguinte, ser utilizada como um marcador de prognóstico para prever a reacção de estroma de tumores.

Materiais e Métodos

estirpes de células e cultura de células

Todas as estirpes celulares utilizadas tinha sido previamente estabelecido [25], [26], [41] e foram fornecidos pelo Dr. Reidar Grenman (Turku University Central Hospital, Finlândia). Em resumo, as células UT-SCC-43A (43A) foram obtidos a partir do tumor primário de uma mulher de 75 anos com ulceração gengival e metástase. Histologia (T4N1M0) era um SCC bem diferenciado. UT-SCC-43B células (43B) foram estabelecidas a partir do tumor recorrente ressecado. UT-SCC-74A células (74A) foram obtidos a partir de um homem de 31 anos ter SCC na margem direita lingual (T3N1M0). UT-SCC-74B (74B) linha celular foi estabelecida a partir de uma metástase encontrado mais tarde no pescoço. Os pacientes combinados-FB-FB-43 e 74 fibroblastos normais foram obtidas a partir da pele e CAF-43 e CAF-74 fibroblastos foram obtidos a partir do estroma da respectiva SCC oral. A origem mesenquimal de estirpes de fibroblastos foi inicialmente confirmado por coloração positiva para vimentina e coloração negativa para citoqueratina usando imuno-histoquímica.

Todas as populações de células foram cultivadas a + 37 ° C em 5% de CO

2 em atmosfera de Dulbecco modificado meio de eagle (DMEM) (Invitrogen, Carlsbad, CA) e suplementado com 5% de soro fetal de vitelo (FCS) (Invitrogen), 0,3 mg /ml de glutamina, 100 ug /ml de estreptomicina e 100 U /ml de penicilina. esferóides de fibroblastos foram formados tal como descrito anteriormente [17]. Em resumo, 150 ul ali quotas /poço de suspensões de células individuais (1,3 × 10

5 células /ml) foram plaqueadas em placas de fundo em U de 96 poços revestidas com agarose (Costar, Cambridge, MA).