Abstract

O

BRAF

oncogene é mutado em 15% dos cânceres colorretais esporádicos. Cerca de metade destes

BRAF

cancros mutantes demonstram mutações frameshift frequentes denominado microssatélites instabilidade (MSI), mas são diplóides e cromossomicamente estável.

BRAF

cânceres do tipo selvagem são tipicamente estáveis ​​microssatélite (MSS) e, em vez adquirir instabilidade cromossômica (CIN). Nestes tipos de câncer, CIN está associada a um mau resultado.

BRAF

cancros mutantes que são MSS, tipicamente presentes em um estágio avançado e têm um prognóstico particularmente ruim. Nós já demonstraram semelhanças clínicas e moleculares entre cânceres MSS com ou sem um

BRAF

mutação e, portanto, a hipótese de que CIN também pode ser frequente em

BRAF

mutantes cancros /MSS.

BRAF

mutante /MSS (n = 60), e

BRAF

tipo selvagem /MSS CRCs (n = 90) foram investigados para CIN usando a perda da análise heterozigosidade mais de doze loci abrangendo cromossômica regiões 5q , 8p, 17p e 18q. CIN era frequente em

BRAF

mutantes cancros /MSS (41/57, 72%), que foi comparável à taxa encontrada em

BRAF

tipo selvagem /cânceres MSS (74/90, 82 %). A maior perda em

BRAF

mutantes cancros /MSS ocorreu no 8p (26/44, 59%), ea menos 5q (19/49, 39%). CIN no

BRAF

mutantes /cânceres MSS correlacionada com estágio avançado (AJCC III /IV: 15/17, 88%; p = 0,02); mostrou altas taxas de co-ocorrência com o CpG Ilha Methylator Fenótipo (17/23, 74%); e CIN em 18q e 8p associada com pior sobrevida (p = 0,02, p 0,05). Este estudo demonstra que CIN comumente ocorre em avançado

BRAF

mutantes cancros /MSS colorretal em que podem contribuir para a sobrevivência mais pobre e mais destaca semelhanças moleculares que ocorrem entre estes e

BRAF

selvagens tipo de cancro.

Citation: James bond CE, Umapathy a, Buttenshaw RL, Wockner L, Leggett BA, Whitehall VLJ (2012) cromossômica instabilidade no

BRAF

Mutant, microssatélites cânceres colorretais estável. PLoS ONE 7 (10): e47483. doi: 10.1371 /journal.pone.0047483

editor: William B. Coleman, University of North Carolina School of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 18 de junho de 2012; Aceito: 12 de setembro de 2012; Publicação: 22 de outubro de 2012

Direitos de autor: © Bond et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiado por uma concessão Nacional de Saúde e Pesquisa médica do Conselho (NHMRC 442.965); Patologia Queensland, Clínica e Statewide Services, Queensland, Austrália; e um prêmio de Pós-Graduação Australian (APA). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

cancro colorretal esporádico (CRC) é uma doença que resulta da diversidade a progressão de diferentes tipos de lesões precursoras que são molecularmente e morfologicamente distinta. Estas lesões adquirir alterações genéticas associando com uma de, pelo menos, duas vias moleculares que conduzem à tumorigénese reconhecidos. O “caminho tradicional” é o mais bem caracterizados e envolve a progressão de um tipo adenoma convencional, que pode adquirir mutação ou perda de

APC

, mutação do

KRAS Comprar e

p53

, e instabilidade cromossómica antes para a formação de um carcinoma de [1], que é tipicamente

BRAF

tipo selvagem. A via de “serrilhada” mais recentemente descrito envolve a progressão de uma lesão serrilhada para o cancro [2], [3], [4], [5]. Isto é acompanhado por uma mutação no início do

BRAF

oncogene [6], [7], e aquisição da CpG Ilha Methylator Fenótipo (CIMP), que envolve a hipermetilação do promotor generalizada e consequente silenciamento de genes supressores de tumor-chave [ ,,,0],8], [9].

BRAF

é um componente integral da cinase de proteína activada por mitogénio (MAPK) cascata de sinalização que promove a proliferação celular e os efeitos anti-apoptóticos [10]. O

BRAF

mutação é considerada um marcador para o caminho serrilhada e é encontrada em aproximadamente 10-15% do CRC [11], incluindo a maioria daqueles que mostra CIMP. Cerca de metade destes cancros terá hipermetilação e silenciamento de um gene de reparo incompatível DNA,

MLH1

, devido à CIMP [8], [12]. Isto resulta em múltiplas mutações em vias de ADN repetidas, denominado instabilidade microssatélite (MSI) [13]. Estes MSI,

BRAF

cancros mutantes foram anteriormente bem descrito como diplóide [14], [15], [16], que ocorrem mais comumente em mulheres mais velhas e do cólon proximal, são muitas vezes mucina produção e pouco diferenciado [ ,,,0],2], [15], [17], [18]. A metade restante da

BRAF

lesões mutantes da via serrilhada que não têm metilação do

MLH1

, são estáveis ​​microssatélite (MSS) [19], [20]. Em contraste com cancros MSI, estes não foram bem caracterizados.

Curiosamente, os dois

BRAF

subgrupos mutantes que diferem pelo status de instabilidade de microssatélites, conferem significativamente prognósticos contrastante. Enquanto

BRAF

mutante /cânceres MSI correlacionam-se com um excelente resultado para o paciente,

BRAF

mutantes cancros /MSS estão associados com um muito mau resultado que é ainda pior do que o

BRAF

tipo selvagem /cânceres MSS decorrente através do “caminho tradicional” [20], [21], [22]. Os mecanismos moleculares subjacentes a esta disparidade são desconhecidos

Duas formas distintas de instabilidade genómica são conhecidos por ocorrer no CRC:. MSI e instabilidade cromossômica (CIN) [23], [24]. MSI afeta a integridade genômica no nível do DNA e se desenvolve na transição pólipo /carcinoma do

BRAF

pólipos serrilhados mutantes que o silêncio

MLH1

por metilação do DNA através do fenótipo CIMP [13], [25] . Alternativamente, CIN, que afeta aproximadamente 70% dos CRCs [18], atua em uma escala genômica ampla, uma vez que se refere a perdas e /ou ganhos de regiões inteiras ou parte cromossômicas, e tem sido associada com a sobrevivência mais pobre [16], [26] , [27], [28]. CIN desenvolve em adenomas convencionais que são

BRAF

tipo selvagem e os progressos para malignidade através do “via tradicional”. A perda de heterozigotia (LOH), que descreve a perda ou redução de um dos dois alelos parentais em uma localização cromossómica particular, indica a presença de CIN. As regiões cromossômicas 18q, 17p, 5q e 8p, que abrigam os principais genes supressores de tumor, foram encontrados para mostrar extensa LOH no CRC [1], [23].

Não está claro se

BRAF

pólipos serrilhados mutantes que se tornam malignas mas não metilar

MLH1 Comprar e não desenvolvem MSI, instabilidade cromossômica manifesto. Por exemplo, alguns estudos recentes têm sugerido que CIMP CIN e são mutuamente exclusivas [29], [30]. Ainda que esta seja concordante com a natureza diplóide de

BRAF

mutante /MSI cancros da via serrilhada com CIMP que o progresso através de uma alta taxa de mutação, ele não explica como

BRAF

mutantes /MSS serrilhada cancros da via progresso e especialmente o fato de que seu prognóstico é particularmente pobre [16], [29], [30], [31], [32].

Nossa hipótese é que, embora CIN podem ser mutuamente exclusivos com a MSI, ele não é mutuamente exclusiva com CIMP e pode ser comum em

BRAF

mutantes cancros /MSS. cancros MSI foram excluídos para análise LOH neste e em estudos anteriores devido aos baixos níveis documentados de CIN anteriormente encontrados, e porque o grau de instabilidade em marcadores microssatélites presente em cânceres MSI não permite a avaliação informativa [26], [30] [31], [32].

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Escrito, o consentimento informado foi obtido de cada paciente envolvido neste estudo. Esta pesquisa foi aprovada pelo Hospital da Real Brisbane e mulheres e Comitês de Ética em Pesquisa com Seres Humanos Bancroft.

Amostras de Pacientes

1052 amostras de mucosa normal esporádicos CRC e combinados foram obtidos após a excisão cirúrgica no Royal Brisbane e Hospital da Mulher (RBWH), Queensland, Austrália. Os dados clínicos, incluindo a idade do paciente de início e sexo, localização anatômica do câncer, o estágio do câncer e o resultado do paciente foram coletadas sempre que possível, a partir de revisão de prontuários, relatórios de patologia ou o registro Morte Queensland. localização anatômica foi especificado como proximal (proximal à flexão do baço) ou distal. estágio do câncer foi classificada de acordo com ambos American Joint Committee on sistemas de estadiamento do Câncer (AJCC) e tumorais Nó metástases (TNM) [33].

Estado da MSI, CIMP, BRAF, KRAS e mutação p53 detecção.

as amostras tinham sido previamente investigado por MSI de acordo com o painel 5 marcador do Instituto Nacional do Câncer constituído por dois marcadores mononucleotídicos, BAT25, BAT26; e três marcadores dinucleotídicos, D5S346, D2S123 e D17S250 [34]. MSI foi classificada se, pelo menos, um dos marcadores de mononucleótido e, pelo menos, um outro marcador (ou mononucleótido ou dinucleótido) foi positivo [34], [35]. CIMP foi previamente investigado utilizando MethyLight com um painel de cinco marcador consistindo de CACNA1G, IGF2, NEUROG1, RUNX3, SOCS1 [36], [37] _ENREF_35_ENREF_35. Cancros foram considerados CIMP positivo se 3 ou mais marcadores foram metilado. Todas as amostras foram rastreadas para a mutação

BRAF V600E

(a1796t) usando um ensaio de discriminação alélica, e

KRAS

mutações nos códons 12 e 13 utilizam a tecnologia Sequenom MassARRAY [37]. A incidência de

p53

mutação através exons 4-8 tenha sido previamente reportados para todos os cancros incluídos neste estudo [37].

Perda de Análise Heterozigosidade

instabilidade cromossómica ( CIN) foi avaliada por análise de perda de heterozigosidade (LOH) ao longo de um total de 12 loci abrangendo 4 regiões cromossómicas conhecidos para abrigar os principais genes supressores de tumores envolvidos na CRC. Estes foram centrado sobre 5q22.2 (contendo o

APC

gene); 8p22 (ligada a uma região supressor CRC); 17p13.1 (que mede o

p53

lócus) e 18q (para

Smad2

,

SMAD4

e

DCC

loci). Três marcadores foram investigados mais de cada uma das quatro regiões (5q: D5S346, D5S1466, D5S489; 8p: D8S258, D8S254, D8S1121; 17p: 17S261, 17S578, D17S926, e 18q: D18S55, D18S460, D18S487). As sequências dos iniciadores para cada um dos marcadores foram obtidas no site da Ensembl (https://www.ensembl.org/index.html). (Para mais informações sobre reações LOH PCR consulte a Tabela 1 na Suplementar Dados S1). Emparelhado normal e produtos de PCR foram sujeitos a electroforese cancro num gel de poliacrilamida a 5% e observados radiologicamente.

LOH em loci individuais foi marcado se um dos dois alelos da amostra de cancro tiveram, pelo menos, uma redução de 40% em intensidade em comparação com a sua amostra normal emparelhado. Um marcador polimórfico onde os dois alelos parentais foram capazes de ser visualizada foi considerado informativo. A extensão total da CIN foi observada ao longo dos 12 loci, e CIN positividade (CIN) foi atribuído, se pelo menos um marcador informativo foi observada com LOH. CIN negatividade foi marcado se, pelo menos, 40% (5 em 12) dos marcadores foi informativo, e nenhum destes demonstrou LOH. Para a análise da CIN em regiões individuais, os 3 loci foram observados e pontuados como CIN se pelo menos um mostrou LOH e CIN negativo se 2 dos 3 loci foram informativo e não demonstrou LOH.

A perda de alelos fraccionada (FAL) foi previamente descrito [38]. Esta abordagem foi utilizada como uma análise mais aprofundada da presença de CIN, onde o número total de eventos de perda alélica foi dividido pelo número total de marcadores informativos por amostra e por coorte. Nós usado para verificar a taxa global de perda de alelos, e as correlações com FAL e estágio na apresentação, a localização do câncer e sexo, e as características moleculares do

p53

e

KRAS

mutação, e CIMP foram determinada

Análise estatística

relações significativas entre dados categóricos foram avaliados pelo teste exato de Fisher. (SPSS versão 19; software Graphpad). Diferenças em dados contínuos foram avaliados através de testes t. modelos de risco proporcional de Cox foram utilizados para investigar os efeitos de vários fatores sobre a taxa de sobrevivência onde a morte devido a cancro foi levado para ser o evento de interesse. Um teste de log rank foi utilizado para avaliar a equivalência das distribuições quando aplicável. valores P ≤0.05 foram considerados significativos.

Resultados

BRAF mutação em cancros MSS colorretais

De 1052 cancros, 128 (12,2%) tinham um

mutação. Destes

BRAF

mutantes, 60 (4,7%) foram MSS (

BRAF

mut /MSS) e formaram o grupo experimental. Este foi comparado com um grupo de controlo seleccionados aleatoriamente de 90 MSS,

BRAF

cancros tipo selvagem (

BRAF

p /MSS).

BRAF

mut /cânceres MSS foram predominantemente localizadas no cólon proximal (33/48, 69%) em comparação com o

BRAF

p /cânceres MSS (25/82, 30,5%) (p 0,0001). Estes proximal,

BRAF

mut /cânceres MSS mais comumente surgiu no sexo feminino (22/33, 66,7% do sexo feminino; p = 0,01) e houve uma tendência não significativa em direção a idade mais avançada (68,6 anos para cânceres proximais contra 63,1 anos para cânceres distal; p = 0,1). O

BRAF

mut /cânceres MSS não mostraram nenhuma diferença na taxa de CIMP na proximal (17/27, 63,0%) versus intestino distal (6/12, 50%), taxa de

p53

mutação na extremidade proximal (14/31, 45,2%) ou intestino distal (14/06, 42,9%), ou em fase de diagnóstico no sentido proximal (10/21, 47,6%) versus o intestino distal (09/04, 44,4 %).

no geral, a coorte BRAFmut /MSS não diferiu pela idade de início, distribuição por sexo ou estágio no momento do diagnóstico para o

BRAF

coorte p /MSS (Tabela 1). Molecularmente, o

BRAF

mut /cânceres MSS não diferem de

BRAF

p /MSS cancros com extensão de

p53

mutação (21/57, 37% versus 42 /90, 47%), mas eram significativamente mais prováveis ​​de demonstrar CIMP (27/47, 57% versus 3/79, 4%) (P 0,0001) (Tabela 1). Na

BRAF

p /coorte MSS, um

KRAS

mutação estava presente em 41/90 (46%) cancros (Tabela 1).

frequência global de instabilidade cromossômica (CIN)

O

BRAF

mut /MSS e

BRAF

p /MSS coortes câncer exibido marcadores altamente informativos para LOH a 95% (57 de 60) e 100% (90 de 90), respectivamente.

Ambos os grupos demonstraram uma alta taxa de CIN independentemente do

BRAF

estado de mutação, com 41/57 (72%)

BRAF

mutante, e 74/90 (82%)

BRAF

tipo selvagem mostrando CIN (Tabela 2). A perda alélica fraccionada (FAL) [38], que descreve a frequência de eventos de perda alélicas entre o número total de eventos informativos, foi analisada como mais um método para quantificar o grau global de CIN dentro de uma coorte.

BRAF

mut /cânceres MSS mostrou uma FAL média ligeiramente mais baixa em comparação com

BRAF

p /cânceres MSS (132/428 = 0,308, contra 286/745 = 0,384, respectivamente), mas esta diferença foi não é estatisticamente significativa (p = 0,1) (Tabela 3).

CIN na individuais cromossômicas Regiões

o

BRAF

mut /cânceres MSS mostrou CIN ao mais alto frequência na região cromossómica 8p (26 de 44, 59%), e o mínimo na região 5q (19 de 49, 39%). O

BRAF

p /cânceres MSS tinha a maior frequência de CIN em 17p (43 de 65, 66%), e as menores taxas de CIN + em 5q (43 de 80, 54%) e 8p (39 de 72, 54%) (Tabela 2).

O

BRAF

p /cânceres MSS apresentaram maior frequência de eventos CIN em comparação com os

BRAF

mut /cânceres que ocorrem MSS nas regiões cromossômicas individuais de 5q, 17p e 18q. Esta relação foi estatisticamente significativa em 18q, com 60% (50 de 83) de

BRAF

p /cânceres MSS mostrando CIN, em comparação com 40% (19 de 48) de

BRAF

mut /cancros MSS com CIN neste loci (p = 0,03) (Tabela 2).

p53 taxa de mutação ea presença de CIN

a mutação de

p53

foi correlacionada com a exclusão de

p53

loco (cromossomo 17p) (Tabela 2). A frequência de

p53

mutação em relação à CIN foi, portanto, investigada com a exclusão de dados 17p, a fim de evitar o excesso de estimar uma associação que pode ser explicada pela inclusão de marcadores LOH positivos em torno do

p53

lócus. Com base no cromossoma 5q, 8p e 18q loci; no

BRAF

p /coorte MSS, 38/70 (54%) dos cancros CIN tinha um concorrente

p53

mutação, em comparação com apenas 4/20 (20%) do CIN-negativos cancros (p = 0,01). O

BRAF

mutantes cancros /MSS demonstrou uma tendência semelhante, mas não significativa, com 16/37 (43%) cancros CIN ter um

p53

mutação em comparação com apenas 4/17 (24% ) cancros CIN-negativos (Tabela 2). Dentro do

BRAF

p /coorte MSS, LOH em todas as regiões cromossômicas individuais significativamente correlacionada com uma maior incidência de

p53

mutação (Tabela 2). Média FAL por coorte mostrou uma maior taxa de perda coincidindo com um

p53

mutação em comparação com aqueles do tipo selvagem para

p53

, de modo significativo para o

cancros BRAF

p /MSS ( p = 0 . 0.001) (Tabela 3)

KRAS taxa de mutação ea presença de CIN em BRAFwt /cancros MSS

BRAF

e

KRAS

mutações foram confirmadas para ser mutuamente exclusivos.

cancros BRAF

p /MSS tinha um 46% (41 de 90)

KRAS

taxa de mutação (Tabela 1). Não houve associação significativa entre um

KRAS

mutação e CIN nestes tipos de câncer, com um

KRAS

mutação presente em 43% (32 de 74) cancros CIN, e em 56% (9 de 16) cancros CIN-negativos (Tabela 2). Curiosamente dos cancros CIN, a FAL média foi significativamente menor no

KRAS mutante

comparação com

KRAS tipo selvagem

cancros (p = 0,045) (Tabela 3).

CpG ilha Methylator Fenótipo (CIMP) e CIN em BRAFmut /cancros MSS

CIMP estava presente em 57% (27 de 47)

BRAF

/cânceres MSS Mut, enquanto apenas 4% (3 de 79 )

cancros BRAF

p /MSS exibido CIMP (Tabela 1). Curiosamente, uma proporção substancial de

BRAF

mut /cânceres MSS demonstrado tanto CIMP e CIN, onde 72% dos altos

BRAF

mut /cânceres MSS CIMP mostrou CIN (Tabela 2).

CIN e correlação clínica dados

A presença de CIN não afetou idade de início e distribuições de gênero (Tabela 2 em S1 dados suplementar). A taxa de CIN não variou, independentemente de o câncer se originou a partir do proximal ou cólon distal em qualquer coorte, com freqüência de perda de alelos (FAL) no

BRAF

mut /MSS cancros em 0,33 e 0,32; e em

BRAF

p /MSS em 0,33 e 0,42 para proximal e distal cancros respectivamente (Tabela 3; Tabela 2 em S1 dados Suplementar).

BRAF

mut /cancros MSS, CIN significativamente associada com o estágio avançado, ocorrendo em 15 de 17 (88%) em estádio III /IV cancros em comparação com 6 de 13 (46%) do estágio I /II cancros (p = 0,02) (Tabela 4). pontuações médias FAL foram consistentes com esta conclusão, com o aumento da FAL correlacionando com o avançar da fase em

BRAF

mut /cânceres MSS CIN (p = 0,03) (Tabela 3). Em contrapartida, o

BRAF

grupo p /MSS tinham altos níveis de CIN em ambos os estágios finais e iniciais de apresentação com 27/33 (82%) no estádio III /IV e 31/37 (84%) de palco I /II cancros CIN (Tabela 4). Isso também foi demonstrado pelas taxas FAL semelhantes encontrados no

BRAF

p /MSS atraso em relação ao câncer em estágio inicial (Tabela 3).

Entre coortes, um significativamente menor número de cancros positivos

BRAF

mut /MSS CIN apresentados nas primeiras fases I /II em comparação com os

BRAF

p /MSS cancros com CIN. Isto foi evidente geral (P = 0,02) e em regiões individuais 5q, 17p e 18q (p = 0,02, p = 0,04, p = 0,01, respectivamente). A taxa de cancros CIN positivos apresentando em estádios avançados (III /IV) foi semelhante nos dois grupos (Tabela 4).

Entre os tumores sem envolvimento de gânglios linfáticos, 6/13 (46%) de

BRAF

mut /cânceres MSS mostrou CIN em comparação com 36/42 (86%) de

cancros BRAF

p /MSS (p = 0,007) (Tabela 4).

BRAF

mut /MSS cancros mostraram uma tendência para as taxas de CIN coincidindo com spread a pelo menos um linfonodo (p = 0,07) aumentando. Embora não seja significativa, estes cancros CIN também teve uma taxa mais elevada de metástases em 100%, em comparação com o número de cancros CIN sem metástases em 65%. O

BRAF

p /cânceres MSS mostraram níveis semelhantes de CIN com ou sem linfonodo spread ou metástases (Tabela 4).

de

BRAF

mut /cânceres MSS mostrando co-ocorrência de CIMP e CIN, uma maioria maior apresentados em estágios tardios (III /IV) (10/16, 63%), em comparação com aqueles que apresentam em fases iniciais (I /II) (13/04, 31%) , embora esta não atingiu significância (Tabela 3 em S1 dados suplementar).

modelos de risco proporcional de Cox foram utilizados para investigar sobrevida específica do câncer global de doentes com cancros CIN. Ter em conta quaisquer efeitos de confusão as variáveis ​​do

BRAF

status (

BRAF

mut /MSS e

BRAF

p /MSS) e estágio (I /II e III /IV ), juntamente com todas as interacções de ordem superior estatisticamente significativas, foram incluídos no modelo. Nenhuma relação significativa entre a presença do CIN global ea sobrevida foram demonstrados em qualquer coorte (

BRAF

mut /MSS p = 0,81,

BRAF

p /MSS p = 0,22). No entanto, a análise de loci individuais revelou o

BRAF

mut /cânceres MSS com CIN em 18q e 8p ter significativamente pior sobrevivência, uma vez ajustada para o estágio (p = 0,02, p 0,05, respectivamente) (Tabela 5).

BRAF

p /cânceres MSS não mostrou diferença nas taxas de sobrevivência, independentemente do status CIN em qualquer loci individuais (Tabela 5).

Os pacientes com

BRAF

mut /cancros MSS tiveram pior sobrevida em comparação com aqueles com

BRAF

p /cânceres MSS, uma vez ajustada para o estágio, independentemente da presença ou não de CIN (HR = 3,4, IC 95% [1,65, 6,99], p = 0,001 ).

Discussão

cânceres colorretais decorrentes através da via neoplásica serrilhada são caracterizados por uma elevada frequência de

BRAF

mutação, MSI e CIMP. cancros MSI têm sido extensivamente estudadas, são diplóides e confere um excelente prognóstico. Na ausência de MSI, um

BRAF

mutação correlacionada com um resultado particularmente pobre paciente. Este estudo relata que um nível elevado de CIN é evidente em

BRAF

mutantes cancros /MSS e isso demonstra pelo menos um mecanismo de instabilidade genómica pelo qual estes cancros formar e progresso. CIN foi avaliada com perda de análise heterozigosidade (LOH) com CIN atribuído, se pelo menos um dos doze marcadores foi positivo para LOH. A perda média fraccionada alélica (FAL) [38], que considera o número de marcadores que mostram LOH em relação ao número de marcadores informativos, também foi calculada para proporcionar mais uma medida quantificável da taxa de CIN. Ambos os métodos encontrados semelhante altas frequências de CIN ocorrendo em cancros MSS independentemente do

BRAF

estado de mutação. Muitos dos CIN positiva

BRAF

mutantes cancros /MSS mostrou CIMP e, assim, este estudo desafia a crença de que CIN e CIMP são mutuamente exclusivos. Ele fornece evidência adicional de que

BRAF

mutante /cânceres MSS são fundamentalmente diferentes com os seus homólogos MSI embora ambos potencialmente surgir a partir de

BRAF

pólipos serrilhados mutantes.

BRAF

mutante /cânceres MSS são um subgrupo importante de cancro colorectal, devido à sua associação com um prognóstico particularmente pobre paciente. No entanto, devido à sua prevalência relativamente baixa de cerca de 5-7% de todos os cânceres colorretais, os mecanismos moleculares subjacentes a este mau resultado não foram bem estudados. Ao identificar 60

BRAF

mutantes /cânceres MSS de uma grande série de 1052 pacientes, o poder necessário foi alcançado para examinar frequência de CIN em relação a outras variáveis ​​clínicas e moleculares. Está bem estabelecido que

BRAF

cancros mutantes ocorrem predominantemente no cólon proximal [12], [18], [37]. Certamente, a maioria dos

BRAF

mut /cânceres MSS neste estudo foram a partir desta região (69%), porém não houve diferença na taxa de CIN encontrado em proximal em relação ao câncer distais (Tabela 3, Tabela 2 em S1 dados suplementar).

temos anteriormente demonstrado que

BRAF

mutantes cancros /MSS têm uma taxa comparável de

p53

mutação para

BRAF

tipo selvagem /cânceres MSS, e esta foi significativamente maior do que o

p53

taxa de mutação encontrada em

BRAF

cancros mutantes /MSI. Além disso, os dados clínico-patológicas entre o

BRAF

mutantes /cânceres MSS e

BRAF

tipo selvagem /cânceres MSS, também se correlacionou em termos de um estágio mais avançado de apresentação, as idades comparáveis ​​de início, e iguais distribuição por sexo [37]. O extenso grau de CIN encontrado em

BRAF

tipo selvagem /cânceres MSS tem sido bem documentada. Como

BRAF

cancros mutantes são pensados ​​para derivar de um pólipo serrilhada, e

BRAF

cancros mutantes que são microssatélite instável são diplóides; pode ser postulado que

BRAF

mutantes cancros /MSS também seria CIN-negativo. No entanto, com base na nossa declaração anterior de múltiplas semelhanças moleculares e clínicas entre os dois subgrupos MSS [37], que a hipótese de que a instabilidade cromossômica poderia contribuir para a progressão de uma proporção substancial de

BRAF

mutantes /cânceres MSS. Os dados aqui apresentados apoiar esta hipótese. É nossa hipótese, ainda, que em

BRAF

, a aquisição de CIN é consistente com a sobrevivência apenas na ausência de instabilidade microssatélite. Para encontrar essas taxas igualmente elevados de CIN que ocorrem em uma grande coorte de

BRAF

mutante /cânceres MSS fornece mais evidências de semelhanças moleculares que ocorrem entre estes dois subgrupos MSS embora se possa progredir de pólipos serrilhados, e outra do convencional adenomas.

A presença de CIN foi examinado mais de doze marcadores abrangendo quatro regiões cromossômicas comumente excluídos no cancro colorectal (cromossomos 5q, 8p, 17p e 18q). Embora a taxa global de CIN foi elevada em ambos

BRAF

coortes mutantes e de tipo selvagem, o exame de loci individuais revelou diferenças entre os grupos na frequência de eventos CIN por loco. O

BRAF

mutantes cancros /MSS teve o maior grau de CIN no braço cromossômico 8p, e menos na região 18q. Em contraste, o

BRAF

tipo selvagem /cânceres MSS tinha a maior frequência de instabilidade no braço 17p, ea menos no 8p e 5q. Uma diferença significativa na taxa de CIN entre os dois grupos era evidente na região cromossômica 18q com a

BRAF

tipo selvagem /cânceres MSS tendo significativamente maior perda na região 18q cromossômica. Cromossoma 18q21.1 abriga o supressor de tumor genes

SMAD4, Smad2 Comprar e genes

apagado no câncer colorretal

(

DCC

). O

SMAD4

/

2

complexo de genes está envolvida na transdução de sinal da via de TGF-beta e, particularmente nas fases iniciais de tumorigénese pode regular a expressão de genes alvo, resultando na interrupção do crescimento e apoptose [ ,,,0],39], [40]. Dentro da via da cinase MAPK, activação aberrante de efectores a jusante de

BRAF

foram encontrados para modular a sinalização de TGF-beta mediada de

SMAD

s [39], [41], em que

ERK

tem sido implicada na inibição

SMAD

translocação nuclear [42]. Como

BRAF

mutantes cancros /MSS têm uma via MAPK constitutivamente ativo, perda do

SMAD

loci pode ser redundante e poderia ajudar a explicar a taxa significativamente menor de supressão encontrados na região 18q em estes em comparação com

BRAF

tipo selvagem /cânceres MSS.

DCC

está sujeita ao silenciamento epigenético [43] e pode ser alvejado por este mecanismo, em vez de exclusão no

BRAF

cancros mutantes. No geral, as diferenças na taxa de CIN encontradas em cada região, indicam que certos loci são preferencialmente excluídos para inativar o gene supressor de tumor residente de acordo com o fundo genético do câncer.

Um evento de perda de um alelo é tipicamente precedido ou seguido por um evento mutacional do segundo alelo na mesma região para inactivar o gene supressor de tumor alvo. Isso ficou evidente no presente estudo, onde em ambos os

BRAF

tipo mutante e selvagem cancros,

p53

mutação correlacionada com a CIN em 17p. pontuações médias FAL foram recalculados com base nos cromossomos 5q, 8p e 18q, a fim de remover a influência de 17p CIN em

p53

taxa de mutação. A mutação do

p53

significativamente correlacionada com uma pontuação mais elevada FAL para CIN no

BRAF

cânceres de tipo selvagem. Uma tendência semelhante, mas não significativa foi observada em

BRAF

cancros mutantes. Estes dados suportam a hipótese de que

BRAF

cancros mutantes não são totalmente distintas daquelas decorrentes através da via adenoma-carcinoma tradicional, mas podem compartilhar várias características moleculares necessários para a progressão do tumor.

Tem sido postulou que CIN e CIMP são mutuamente exclusivas [29], [30]. Curiosamente, este estudo demonstra claramente uma frequência elevada de CIN e co-ocorrência CIMP no

BRAF

mutantes /cânceres MSS (72%), o que sugere estas formas de instabilidades genéticas e epigenéticas podem coexistir dentro deste fundo molecular. Estes resultados destacam a necessidade de estratificação para identificar características moleculares de subgrupos de câncer importantes. Uma relação inversa entre CIN e CIMP, foi observado anteriormente em um predominantemente

BRAF

selvagem coorte câncer de tipo, onde apenas 9

BRAF

mutantes cancros /MSS foram investigadas [29]. Um baixo nível de CIN foi encontrado em cancros positivos CIMP usando uma abordagem ampla gama genoma, no entanto

BRAF

estado mutacional não foi avaliada [44]. A falta de associação relatou nestes estudos provavelmente reflete a baixa frequência de CIMP em

BRAF

cânceres de tipo selvagem. No presente estudo, CIMP ocorreu em apenas 4% dos

BRAF

cânceres do tipo selvagem, impedindo a análise significativa da CIMP correlacionando-se com CIN neste subgrupo.

BRAF

cancros mutantes /MSS, aumentando significativamente os níveis de CIN geral foram encontrados com estágios avançados de apresentação (Tabelas 3 e 4), sugerindo que a CIN pode contribuir para a progressão deste tipo de câncer. Este padrão também foi observado nas regiões cromossomais de 18q e 17p (Tabela 4). Uma considerável taxa de CIN na região 8p que ocorrem em ambas as fases precoce e tardia, podem ser responsáveis ​​por esta região que mostra a maior taxa de CIN dentro deste tipo de cancro, e, além disso, pode implicar um papel para a perda de um gene supressor de 8p do tumor no início desenvolvimento da doença.

Em contraste, para CIN geral e em todas as regiões cromossômicas individuais, o

BRAF

tipo selvagem /cânceres MSS apresentou taxas comparáveis ​​de CIN nas fases inicial e final, e isso sugere que CIN é importante para a iniciação ou progressão precoce dentro deste subgrupo câncer. A maior perda média de alelos fracionada (FAL) registos observados para

BRAF

tipo selvagem contra cancros MSS mutantes pode refletir o início mais precoce da CIN e, portanto, maior acúmulo de eventos CIN (Tabela 3).