Abstract

Fundo

células-tronco cancerígenas representam uma população de células tumorais imaturas encontrados na maioria dos tumores sólidos. Suas características peculiares torná-los modelos ideais para estudar a resistência aos medicamentos e sensibilidade. Neste estudo, nós investigamos se o isolamento de células-tronco do câncer e no ensaio de sensibilidade in vitro são viáveis ​​em um ambiente clínico.

Métodos

câncer de células estaminais foram isoladas de derrames ou tecido de câncer de fresco de 23 pacientes que progrediu após falha terapêutica padrão. condições de cultura específicas seleccionadas para células tumorais imaturas que expressam marcadores de stemness. Estas células foram expostas in vitro a agentes quimioterápicos e orientadas.

Resultados

células-tronco cancerosas foram extraídos de metástases hepáticas em 6 casos (25%), nódulos pulmonares em 2 (8%), As metástases linfonodais em 3 (12,5%) e derrame pleural /peritoneal /pericárdio em 13 (54%). câncer de células estaminais foram isoladas com sucesso em 15 pacientes (63%), incluindo 14 com câncer de pulmão (93,3%). Um ensaio de sensibilidade foi realizada com sucesso em 7 pacientes (30,4%), com mediana de 15 medicamentos /combinações testadas (intervalo 5-28) e um tempo médio necessário para resultados de 51 dias (intervalo 37-95).

Conclusão

a abordagem utilizada para o julgamento do STELLA permitiu o isolamento de células-tronco cancerosas em uma proporção consistente de pacientes. O baixo percentual de casos de concluir o procedimento completo e o tempo médio por muito tempo para obtenção de resultados evidencia a necessidade de um procedimento mais eficiente.

registo julgamento

ClinalTrials.gov NCT01483001

citação: D’Arcangelo M, Todaro M, Salvini J, Benfante A, Colorito ML, D’Incecco A, et al. (2015) células-tronco cancerosas sensibilidade do ensaio (STELLA) em doentes com doença avançada de pulmão e câncer colorretal: um estudo de viabilidade. PLoS ONE 10 (5): e0125037. doi: 10.1371 /journal.pone.0125037

Editor do Academic: Xiaoan Liu, o primeiro hospital afiliada à Universidade Médica de Nanjing, CHINA

Recebido: 06 de agosto de 2014; Aceito: 10 de março de 2015; Publicado em: 08 de maio de 2015

Direitos de autor: © 2015 D’Arcangelo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de informação de apoio

Financiamento:. Este estudo foi parcialmente financiado pela Associação italiana de Investigação do Cancro (AIRC 5×1000) para MatildeTodaro, Giorgio Stassi e Federico Cappuzzo, pela Fondazione Ricerca Traslazionale (ForRT) a Federico Cappuzzo e pelo Istituto Toscano Tumori a Federico Cappuzzo e Armida D’Incecco. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:.. Os autores declaram que não há interesses concorrentes existe

Introdução

o cancro é a segunda causa de morte depois das doenças cardiovasculares em todo o mundo e de pulmão, mama e tumores colorretais são os três jogadores principais. De mama (BC) e cancro do pulmão (LC) são a principal causa de morte por câncer em mulheres e homens, respectivamente, enquanto o câncer colorretal (CCR) é responsável por aproximadamente 10% de toda a incidência de câncer e mortalidade [1]. A ressecção cirúrgica e terapia adjuvante pode curar tumores primários estágio precoce. Por outro lado, a doença metastática é incurável principalmente devido à sua natureza sistémica e a resistência aos agentes terapêuticos. Com efeito, mais de 90% das mortes relacionadas com o cancro pode ser atribuída a recorrência /recidiva e não a lesões primárias [2,3]. Nas duas últimas décadas, o resultado do tratamento foi notavelmente melhorado graças a uma melhor compreensão da biologia do cancro, a introdução de novos agentes alvo /quimioterapêuticos e, mais importante, a selecção de doentes com base em biomarcadores ou ensaios baseados em tumorais. No entanto, mesmo esta nova abordagem provou ser inadequada para curar os pacientes com doença metastática [4-7]. Esta realidade clínica ressalta a necessidade de avaliar novas abordagens para o tratamento de pacientes com câncer e desenvolver novas ferramentas clínicas para a seleção da melhor opção de tratamento para o paciente individual.

Nos últimos anos, uma pequena subpopulação de células indiferenciadas células cancerosas com características estaminais-como foi identificado no interior dos tumores e chamados células-tronco cancerosas (CSC) ou células tumorais iniciar. Eles parecem responsável pela iniciação do câncer, o sustento, a progressão e resistência aos medicamentos antineoplásicos [8]. De acordo com esta hipótese, a CSC originam a transformação de células estaminais normais. Com efeito, devido à sua longevidade, células estaminais acumulam mutações múltiplas que são necessárias para a carcinogénese. Apoiando esta hipótese, as células-tronco normais e partes CSC várias propriedades importantes, incluindo:

(a)

auto-renovação,

(b)

diferenciação,

(c)

ativa expressão da telomerase,

(d)

ativação de vias anti-apoptóticos,

(e)

aumento da actividade transportador de membrana e

(f)

capacidade de migrar e metástase [9] . Além disso, os cancros normalmente exibem extensa fenotípica, a heterogeneidade funcional e molecular que pode ser facilmente explicado pela teoria CSC [10-12]. Dois modelos têm sido propostos para explicar as características variadas de células cancerosas no interior de um tumor: 1) o modelo de evolução clonal, e 2) o modelo de CSC. Enquanto os antigos postulados que todas as células dentro de um câncer têm o potencial de dar origem a novos tumores, este último sugere que as células cancerosas apenas com características estaminais-como pode sustentar a iniciação e progressão tumoral [13-16]. A evidência experimental numa variedade de tumores apoia fortemente a hipótese de CSC. A importância de CSC na iniciação do tumor foi firmemente estabelecida na leucemia e recentemente relatada numa variedade de tumores sólidos, tais como cancro da mama, do cólon, do cérebro, da próstata, do ovário, cancro do pulmão e melanoma [17-24]. O nosso grupo tenha previamente identificados e caracterizados uma subpopulação de células tumorais +

CD133 dotado de auto-renovação e capacidade de diferenciação multi-linhagem assim como as células-tronco normais [25]. Esta pequena subpopulação de CSC mantém capacidade tumorigénica quando transplantadas em ratos imunodeficientes [25,26]. Os xenoenxertos resultantes são histológica e molecular semelhante ao tumor parental a partir do qual se originaram [27]. Esta propriedade faz com que a CSC intrigante um bom modelo para o estudo da biologia e sensibilidade de tumores de pacientes individuais a agentes antineoplásicos.

os níveis de cassete de ligação de ATP de exibição CSC elevados de expressão (ABC) transportadores, factores anti-apoptóticos e uma capacidade ativa DNA-reparo que os tornam particularmente resistente a drogas e toxinas [28-30]. Além disso, o debulk tumor aparente obtido com quimioterapia contribui para o enriquecimento piscina CSC, aumentando assim o risco de desenvolvimento mais fenótipos resistentes a [31]. Esta evidência coletiva sugere que a ineficácia comum de terapias convencionais sobre a população de células-tronco pode explicar em parte a resistência do cancro a tratamentos disponíveis. Consequentemente, sabendo que o espectro de sensibilidade da subpopulação CSC do tumor individual e orientar selectivamente nesta subpopulação poderia proporcionar uma melhoria significativa dos resultados do tratamento.

Considerando a actual falta de agentes específicos visando o CSC ea relatado anteriormente observações, foi realizado um estudo prospectivo, não randomizado (trial STELLA, ClinicalTrials.gov: NCT01483001) para avaliar se isolar e testar CSC contra um amplo espectro de agentes antineoplásicos é viável na prática clínica. Além disso, o estudo procurou determinar se essa abordagem poderia potencialmente identificar drogas com

in vitro

atividade contra a CSC derivado do paciente individual, proporcionando assim novas opções terapêuticas personalizadas. O estudo mostrou que o teste de CSC quimio-sensibilidade é viável na prática clínica, embora um mais eficiente

método in vitro

é necessário.

Métodos

Elegibilidade, recrutamento e acompanhamento

O protocolo para este ensaio e apoiando lista TREND estão disponíveis como informação de apoio; veja Protocolo S1 e S1 TREND Checklist.

O estudo STELLA foi um, não-randomizado, open-label, prospectivo, ensaio clínico avaliando a viabilidade da intervenção do isolamento CSC e ensaio de quimio-sensibilidade na clínica (S1 Protocol). O estudo foi aprovado pelo “Ética Conselho de Revisão de Investigação de Drogas” do Hospital Civil de Livorno. consentimento informado por escrito foi obtido de cada paciente antes da inscrição. Os pacientes que foram seguidos ou que se refere à Oncologia Médica Departamento do Hospital de Livorno e que preencheram os critérios de elegibilidade foram incluídos no estudo. Os pacientes elegíveis tinham confirmado diagnóstico citológico ou histológico de pulmão metastático, câncer de mama ou colorretal; pré-tratados com terapias convencionais e sem opções terapêuticas padrão adicionais; com um status de 100% de acordo com a pontuação de Karnofsky desempenho; funções hematológicas, renais e hepáticas adequadas. inelegibilidade critérios principais incluíram a incapacidade de obter tecido de tumor fresco ou derrame neoplásica adequada para a extracção e CSC comorbidade potencialmente interferir com o estudo. As características clínicas dos pacientes, bem como características moleculares de tumores (quando disponível) foram coletados e registrados em um banco de dados eletrônico do Departamento de Oncologia Médica do Hospital Civil de Livorno. Dois pacientes foram inicialmente diagnosticado com uma CRC e incluídos no estudo, mas uma revisão de patologia mostrou uma histologia diferente (câncer de pâncreas e pequena adenocarcinoma intestino), o que representa um desvio do protocolo do estudo.

O principal objectivo da o estudo foi o de avaliar a viabilidade de um ensaio de sensibilidade sobre CSC num ambiente clínico, tendo em consideração a percentagem de pacientes para os quais foi possível realizar o ensaio e o período de tempo para obter os resultados de sensibilidade. Os objectivos secundários foram a identificação de LC, CRC e BC células-tronco e a avaliação da sua

in vitro

sensibilidade aos agentes anti-tumorais. Este último foi expressa como taxa de mortalidade, ou seja, a percentagem de células mortas após o ensaio de quimio-sensibilidade.

Os doentes foram recrutados durante um período de dois meses de tempo (6 de dezembro

th, 31 de 2011-janeiro

st, 2012), e foram acompanhados até a morte ou a recusa do paciente (Dezembro de 2011-dezembro 2013) em intervalos regulares de acordo com a necessidade clínica e opinião do clínico. As entrevistas por telefone foram realizadas no caso do paciente era incapaz de atender consultas externas.

Recolha de Tecidos, Isolamento e Cultura de células cancerosas

derrame Neoplásicas (se houver) ou tecido tumoral de câncer primário ou do local metastático mais acessível foi obtido de todos os pacientes elegíveis após a assinatura de consentimento informado, no Hospital Civil de Livorno. amostras frescas foram enviado durante a noite à temperatura ambiente para o Laboratório de Fisiopatologia Celular e Molecular da Universidade de Palermo, Itália. espécimes de tumor foram intensamente lavadas em solução de PBS e incubadas durante a noite em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Gibco) suplementado com penicilina (500 U /mL, Gibco), estreptomicina (500 ug /mL, Gibco) e anfotericina B (1,25 ug /ml , Gibco) para evitar a contaminação microbiana. As amostras de tumor foram enzimaticamente digeridas com colagenase e hialuronidase e agitada mecanicamente durante 1 hora a 37 ° C. Alternativamente, efusões neoplásicas foram separadas por centrifugação (1200 rpm, 10 min, 4 ° C). As células recolhidas foram cultivadas em meio isento de soro de células estaminais suplementado com factor de crescimento epidérmico (EGF, 20 ng /mL, Sigma-Aldrich) e factor de crescimento de fibroblasto básico (bFGF, 10 ng /mL, Sigma-Aldrich) e plaqueadas em ultra-baixa placa de fixação (Corning) como anteriormente descrito [25]. Estas condições favorecem o crescimento de células estaminais-como altamente tumorigénicas, ao selecionar negativamente para células tumorais diferenciadas menos tumorigênicos, como mostrado anteriormente pelo Eramo et al [24]. Células sobreviventes tumorais imaturas lentamente proliferam e formam esferas de células. células derivadas de esfera foram expandidas por processos mecânicos e /ou dissociação enzimática e re-plaqueadas em meio fresco completo de células estaminais. As culturas de células foram mantidas a 37 ° C em uma CO 5%

2 incubadora umidificada.

O protocolo de estudo incluiu

in vivo

experiências que nunca foram realizados porque foram utilizadas todas as células disponíveis para os testes chemosensitivity no esforço de testar tantas drogas quanto possível e identificando assim um potencial tratamento para o paciente.

caracterização imunofluorescência das esferas

células Sphere derivados foram provado ser CSC por caracterização de imunofluorescência para marcadores de membrana stemness. Resumidamente, esferas de tumor foram mecanicamente dissociados enzimaticamente e para a obtenção de células individuais. As células foram fixadas e permeabilizadas como descrito anteriormente [25]. células Cytospun foram lavadas em PBS e expostas durante a noite a 4 ° C a anticorpos contra CD133 (AC133, IgG de ratinho

1, Miltenyi), CD166 (IgG1 de ratinho, R D Systems), OCT3 /4 (sc-5279, rato IgG2b, Santa Cruz), ALDH-1 (IgG1, BD Bioscience), CD90 (mouse IgG1k, BD Bioscience), ou controles do mesmo isotipo. Em seguida, as células foram marcadas com anticorpos isotiocianato de fluoresceína (ITCF) conjugadas rato (Invitrogen) e os núcleos foram contrastadas com iodeto de 3-Toto. A coloração fluorescente foi avaliada com um microscópio confocal.

In Vitro sensibilidade do ensaio

Depois de dissociação mecânica e enzimática, as células tumorais foram coradas com azul de tripano e contadas com um hemocitómetro. As células de tumor (2×10

4 por poço) foram expostas a várias drogas anti-tumor, a fim de avaliar a sua sensibilidade para os compostos terapêuticos. A Tabela 1 indica os fármacos ou as combinações utilizadas. Os clínicos empiricamente escolheu as drogas a testar em função dos regimes de tratamento anteriores e a aberração molecular básica do paciente individual. O

in vitro

da sensibilidade do ensaio foi realizado simultaneamente em duas placas de fixação ultra-baixa de 96 poços (Corning). O tempo de tratamento foi determinada com base em medicamentos semi-vida e continuou até 96 horas. Cada regime foi avaliada em triplicado.

A viabilidade celular foi avaliada com /brometo de etídio (AO /EB) coloração laranja de acridina, como descrito anteriormente [34]. A suspensão celular foi incubada em solução AO /EB na proporção 1: 1, respectivamente, e misturou-se suavemente. Este procedimento foi realizado apenas antes da quantificação com um microscópio confocal. Oito ul de suspensão de células foram colocadas sobre uma lâmina de microscópico e coberta com uma lamela de vidro. Um microscópio confocal foi utilizada para examinar a amostra e quantificar a morte das células [34]. Os resultados do ensaio de sensibilidade foram comunicados aos médicos, a fim de seleccionar, quando possível, um regime de terapia otimizada para o paciente individual.

Análise Estatística

O tamanho da amostra foi calculado com o software IBM SPSS Amostra Potência 3,0 com base na percentagem de pacientes para os quais foi possível realizar o ensaio. Utilizando o teste de proporção (teste de duas faces), sob a suposição de uma percentagem de 33% (versus procedimento padrão de 5%), um tamanho de amostra de 18 pacientes foi necessária, com uma potência de 90% e um nível de significância de 0,05 . A estatística descritiva (frequência, porcentagem, mediana e intervalo inter-quartil) foram utilizados para analisar os dados sempre que necessário. Os resultados do

in vitro

procedimento (tipo de amostras colhidas, CSC taxa de falha de isolamento) foram analisados ​​considerando o número total de amostras. Os demais resultados (taxa de sucesso da sensibilidade do ensaio, o tempo para o resultado eo número de fármacos testados) foram analisados ​​considerando os dados individuais dos pacientes da “intenção de tratar” população.

Resultados

Características dos pacientes

a partir de 06 de dezembro

th 2011 a 31 de Janeiro

st 2012, um total de 23 pacientes foram identificados no Oncologia médica Departamento de Livorno e incluídos no estudo (Fig 1). Todos os pacientes selecionados eram elegíveis e iniciou o processo de isolamento CSC. Todos os pacientes foram incluídos nas análises seguintes. A Tabela 2 resume as características clínicas de pacientes individuais. A idade média foi de 66 anos (intervalo interquartil, IQR: 51-72) e a maioria dos indivíduos eram do sexo masculino (n = 15, 65%) e tinha câncer de pulmão (n = 18, 78%). Nenhum paciente BC foi inscrito. caracterização Bio-molecular não estava disponível em 5 casos. Entre os pacientes com cancro do pulmão,

EGFR

mutações foram detectadas em 4 casos,

ALK

translocação em 1 caso e

KRAS

mutação em outro caso. Dois dos três pacientes com CCR abrigava um

KRAS

mutação. Os pacientes receberam uma média de 3 linhas de terapia anteriores (IQR: 1-3). Todos os pacientes completaram o follow-up, com exceção de um paciente, que ainda está vivo. Nenhum paciente foi perdido para seguimento.

isolamento de células-tronco cancerosas e sensibilidade do ensaio

biópsia do tumor ou procedimento de coleta de derrame neoplásica foi repetido mais de uma vez por paciente , exceto em um caso. Não houve complicações decorrentes do procedimento de coleta de tecido tumoral /efusão. Isolamento de CSC foi realizada utilizando derrame peritoneal /pleural /pericárdica em 13 casos (54%), o tecido do tumor a partir de metástases pulmonares em 2 casos (8%), as metástases hepáticas em 6 (25%) e metástases linfáticas em 3 (13% ). CSC foram isolados com sucesso em 15 dos 24 amostras de tumor foram recolhidas (63%). O material não foi adequada em 8 casos e um espécime deteriorou-se durante o transporte. A taxa de falha foi maior com biópsias de tumores (5 falhou casos de 11, a taxa de fracasso: 45%) do que com derrames malignos (3 falhou casos de 13, a taxa de fracasso: 23%). Em particular, a menor produtividade foi obtida com metástases em linfonodos (2 falhou casos de 3, taxa de falhas: 67%). De acordo com o site principal do cancro, taxa de falha foi de 30% para câncer de pulmão e 80% para tumores gastrointestinais.

células tumorais pulmonares recentemente isoladas tinha fenótipo estaminais-como confirmado pela expressão concomitante dos marcadores stemness mais comuns , incluindo CD133, CD166, OCT3 /4, a ALDH-1 e CD90 (Figura 2) [32,33]. A alta expressão concomitante destes marcadores apoia fortemente o fato de que as células isoladas foram CSC. A Tabela 3 mostra o padrão de expressão dos marcadores nos casos em que um ensaio de sensibilidade foi realizada. Nenhum estudo imuno-fluorescente foi realizada em amostras gastro-intestinal para o número limitado de células isoladas e insuficientes

crescimento in vitro

.

O seguinte painel de imagens refere-se à caracterização de células isoladas a partir da amostra de um paciente inscrito no estudo. rotulagem verde é típica de células positivas. Todos os marcadores de stemness (CD133, CD166, Out 3/4, ALDH1, CD90) são positivos nesta amostra CSC.

Entre os 15 casos em que CSC foram isoladas com sucesso,

in vitro de crescimento celular foi observada em 12 e só em 7 casos o número de células disponíveis foi suficiente para realizar um teste de quimiossensibilidade. A taxa de sucesso global de todo o processo foi de 30,4%. O

in vitro

resposta ao tratamento foi avaliada em placas de 96 poços em triplicado com a coloração AO /EB. A coloração AO /EB foi usado para visualizar as alterações nucleares e formação de corpos apoptóticos que são características da apoptose. Considerando AO é um corante vital e manchas tanto células vivas e mortas, manchas EB apenas as células que perderam a integridade da membrana. Portanto, as células viáveis ​​apareceu células uniformemente verdes e mortas incorporada EB e, consequentemente, foram corados em laranja (Fig 3). A resposta ao tratamento, observou na primeira placa marcado com AO /EB, era homogénea em todos os três poços. As células viáveis ​​da segunda placa foram mantidas em cultura por observação e não foi detectado nenhum morfológica ou a mudança fenotípica.

AO é um corante vital e manchas tanto células vivas e mortas. EB penetra nas células com membrana citoplasmática interrompido, a coloração apenas células mortas. Portanto, as células viáveis ​​aspecto uniformemente verde e células mortas são rotulados de laranja. a) A baixa sensibilidade (mortalidade celular 5%). b) sensibilidade média (mortalidade 40% de células). c) de alta sensibilidade (mortalidade de células 80%).

Todos os pacientes cujos tumores foram testados com sucesso

in vitro

teve LC, incluindo 5 adenocarcinomas pulmonares, 1 indiferenciado de pulmão de células não pequenas câncer e um câncer de pulmão de pequenas células. A mediana do tempo entre a recolha da amostra e os resultados do ensaio de sensibilidade foi de 51 dias (IQR: 47-54). A Tabela 1 indica as drogas ou combinações utilizadas para o

in vitro

ensaio de sensibilidade e informações mais detalhadas sobre os testes individuais pode ser encontrada na Tabela 3. O número médio de medicamentos /combinações que foram testados foi de 15 (IQR: 5-22). O

in vitro

CSC taxa de mortalidade variou de 0 a 80%, mas apenas em um caso a taxa de mortalidade foi 50% (Tabela 3)

tratamento de pacientes

o estudo não contemplar o tratamento de pacientes e seus endpoints não incluem se o

in vitro

resultados correlacionam-se com a resposta clínica. No entanto, nenhuma opção terapêutica válida estava disponível para esses pacientes e, quando possível, que ofereceu-lhes um tratamento com um dos medicamentos testados. O regime escolhido foi sempre aquele com o

in vitro

maior taxa de mortalidade. Como não existe um valor de corte reconhecida do

in vitro

resultado definição clínica sensibilidade /resistência, não se pode excluir que os regimes com baixo

in vitro

mortalidade pode produzir respostas clínicas e, portanto, o regime escolhido poderia ter tido uma baixa taxa de mortalidade. Como mostrado na Tabela 3, entre os 7 indivíduos para os quais um ensaio de sensibilidade foi disponibilizado, apenas 3 recebeu um tratamento com base nos resultados do teste. A taxa de mortalidade mais elevada observada

in vitro

foi de 10% em 2 desses pacientes e a doença progrediu logo após o início do tratamento. O primeiro paciente era uma mulher nunca fumante com um adenocarcinoma de pulmão metastático com nenhuma aberração motorista molecular. Ela recebeu uma combinação de paclitaxel e oxaliplatina, mas a progressão da doença depois de apenas dois ciclos. O segundo paciente era um homem fumante primeiro com

KRAS mutado

adenocarcinoma avançado do pulmão. Ele recebeu uma combinação de carboplatina e pemetrexed e sua doença progrediu logo depois. Por outro lado, em um homem jovem com uma metastático

EGFR mutado

adenocarcinoma do pulmão do

in vitro

ensaio mostrou uma mortalidade celular de 40% para a combinação de oxaliplatina e paclitaxel. O doente recebeu 5 ciclos de as drogas quimioterapêuticos acima mencionadas, alcançar uma estabilização da doença. Apesar de o efeito benéfico, uma vez que o paciente já tinha recebido 7 linhas de tratamento, o clínico decidiu interromper o tratamento para aumento do risco de toxicidade. Os outros 4 pacientes para os quais um teste de sensibilidade foi realizado não recebeu o tratamento porque faleceu antes que os resultados se tornaram disponíveis. No geral, estes resultados anedóticos parecem indicar que a maior

in vitro

sensibilidade poderia se traduzir em uma melhor evolução clínica.

provas Discussão

Acumulando suporta a existência de CSCs em tumores humanos. Estas células possuem a capacidade de auto-renovação e diferenciação em células tumorais maduros. Eles parecem conduzir iniciação do tumor, progressão e metástase. Dada a sua alta resistência a fármacos anti-cancerígenos, eles são acreditados para contribuir substancialmente para a recidiva após quimioterapia e representam um alvo terapêutico atractivo para potencialmente alcançar longa duração respostas terapêuticas. Por conseguinte, o reconhecimento das drogas mais activas na subpopulação CSC tem o potencial para identificar a melhor opção de tratamento para o paciente individual ou novas opções de tratamento para pacientes que progridem em terapias convencionais.

Estudos anteriores já descrito o isolamento procedimento do CSC. O estudo STELLA é o primeiro estudo prospectivo que avalia a aplicabilidade deste procedimento em uma clínica com o objectivo de testar a

in vitro

sensibilidade do CSC e potencialmente identificar novas opções terapêuticas para o paciente. Considerando-se que a viabilidade foi o ponto final primário do estudo, um número limitado de indivíduos foi registrado, a grande maioria com diagnóstico de LC, a doença mais freqüente que se refere à nossa Instituição. O estudo mostrou que o procedimento foi possível em 65% dos casos, levando a um resultado quimio-sensibilidade em um terço dos pacientes em um tempo médio de 51 dias. No geral, esta experiência preliminar nos deu informações muito relevantes.

Em primeiro lugar, local da coleta de amostra de tumor foi fundamental para o sucesso do procedimento de isolamento desde efusões neoplásicas foram os mais proficiente para tal fim. Este também é um aspecto relevante para a prática clínica desde a colheita de derrame é relativamente fácil e muitas vezes necessária para o tratamento do sintoma, tem baixo risco e é geralmente bem aceitos pelos pacientes. Em nossa opinião o tipo de amostra, se era biópsia tecidos frescos ou derrame neoplásica, foi o fator que impactou principalmente na baixa percentagem de pacientes que beneficiam do teste. Outros fatores, como o tipo de meio de cultura, pode ter tido um impacto menor.

O tempo médio entre os resultados de colheita de amostras e de análise de sensibilidade foi de 51 dias. Este é um período relativamente longo de tempo para doentes com cancro metastático, explicando por menos do que 50% de indivíduos para os quais o teste de sensibilidade foi disponível recebeu uma terapia com base nos seus resultados. Se este lapso de tempo é suficiente para alterar ainda mais a biologia celular do tumor e sua sensibilidade às drogas não é conhecido e, atualmente, não há nenhuma evidência científica deste. A fim de encurtar este período de tempo, com base na experiência STELLA, um estudo clínico em curso (LUCAS) está usando um ensaio diferente (Tecan Infinito F500 após celular Titer-Glo Luminescent de viabilidade celular Assay; Promega). Este método consiste em determinar o número de células viáveis ​​com base na quantificação de um sinal luminescente que é proporcional à quantidade de ATP; ele requer um número menor de células e proporciona resultados acionáveis ​​em apenas 7 dias a partir da biópsia. Isso pode ajudar a alcançar resultados em um curto período de tempo e testar mais drogas para pacientes com

in vitro

crescimento lento da CSC. Além disso, fornece resultados quantitativos, eliminando a precisão inferior do método semi-quantitativo anterior. Esta nova abordagem pode também melhorar a percentagem de pacientes em que a quimiossensibilidade de teste pode ser realizada com sucesso. Na verdade, no STELLA estudar o ensaio de sensibilidade foi realizada em apenas sete casos, principalmente para os pobres

in vitro o crescimento de células

.

Em nosso estudo CSC apresentou alta resistência a drogas atualmente disponíveis, incluindo agentes padrão de quimioterapia e terapias específicas, com apenas um caso que mostra uma taxa de mortalidade superior a 50%. Isso não é inesperado, considerando a alta resistência da CSC para comumente utilizados agentes antitumorais, destacando a necessidade urgente de medicamentos mais eficazes que visam especificamente esta população celular.

Em conclusão, a abordagem utilizada para o julgamento do STELLA permitiu o isolamento CSC em uma proporção consistente de pacientes. A baixa percentagem de casos que completam o procedimento completo de ensaio de quimio-sensibilidade eo tempo médio por muito tempo para obter os resultados completos destaca a necessidade de um procedimento mais eficiente. Em tal perspectiva, o estudo LUCAS actualmente em curso irá esclarecer as potenciais implicações clínicas de terapias-alvo em CSCs.

Informações de Apoio

S1 protocolo. protocolo do estudo, carta de informação para o clínico geral e formulário de consentimento informado

doi:. 10.1371 /journal.pone.0125037.s001

(PDF)

S1 TREND Checklist. . TREND lista

doi: 10.1371 /journal.pone.0125037.s002

(PDF)