Abstract

macrófagos inibidora das citocinas-1 (MIC-1 /GDF15), um membro divergente da superfamília de TGF-β, é sobre-expresso por muitos tipos de cancro comuns, incluindo os da próstata (CaP) e a sua expressão está associada ao resultado do cancro. Nós avaliamos o efeito da superexpressão MIC-1 /GDF15 no desenvolvimento de CaP e espalhar no modelo transgénico TRAMP de câncer de próstata espontânea. ratinhos TRAMP foram cruzados com MIC-1 /GDF15 superexpressão ratos (MIC-1

FMS) para produzir TRAMP singênica

fmsmic-1 ratos. A taxa de sobrevivência, o tamanho do tumor da próstata, os graus histopatológicos e a extensão de metástases distantes órgãos foram comparados. Metástase de TC1-T5, uma linha celular independente de androgénio TRAMP que carece de MIC-1 expressão /GDF15, foi comparada por injecção por via intravenosa em MIC-1

FMS e singeneicos C57BL /6. Enquanto TRAMP

fmsmic-1 sobreviveram em média 7,4 semanas a mais, tinham tumores significativamente menores do trato geniturinário (GU) e inferiores CaP graus histopatológicos do que os camundongos Vagabundo, mais destes ratos desenvolveram metástases de órgãos distantes. Adicionalmente, um maior número de TC1-T5 colónias tumorais de pulmão foram observados em MIC-1

ratinhos WT SFM que singeneicos C57BL /6. Nossos estudos sugerem fortemente que o MIC-1 /GDF15 tem ações complexas sobre o comportamento do tumor: limita o crescimento do tumor local, mas podem com a doença avança, promover metástases. Como MIC-1 /GDF15 é induzida por todos os tratamentos de câncer e metástase é a principal causa do tratamento do câncer de insucesso e de câncer de mortes, esses resultados, se for o caso para os seres humanos, podem ter um impacto direto no atendimento ao paciente.

Citation : Husaini Y, Qiu MR, Lockwood GP, Luo XW, Shang P, Kuffner T, et al. (2012) macrófagos inibidoras de citocina-1 (MIC-1 /GDF15) Desenvolvimento Retarda o cancro, mas aumenta Metástases em ratos propensos TRAMP do cancro da próstata. PLoS ONE 7 (8): e43833. doi: 10.1371 /journal.pone.0043833

editor: Ming Tat Ling, Universidade de Tecnologia de Queensland, Austrália |

Recebido: 28 de abril de 2012; Aceito: 30 de julho de 2012; Publicado: 27 Agosto 2012 |

Direitos de autor: © Husaini et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pela Fundação do Câncer de próstata da Austrália (https://www.prostate.org.au), Conselho Cancer New South Wales (https://www.cancercouncil.com.au/) e The National Health and Medical Research Council of Australia (https://www.nhmrc.gov.au/). DAB é um companheiro Nacional de Saúde e Pesquisa Médica do Conselho Biomédica Desenvolvimento de Carreira. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. DAB e SNB são nomeados inventores em patentes detidas por Hospital St Vincent que dizem respeito à uso clínico de MIC-1 /GDF15 para ensaio de diagnóstico e terapia moduladora. Essas patentes foram licenciadas a Novo Nordisk e da Roche Diagnostics. Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas de dados e materiais de compartilhamento, como detalhado em linha em https://www.plosone.org/static/policies.action#sharing.

Introdução

o câncer de próstata (PCA) é o câncer mais comumente diagnosticado em homens depois do câncer de pele e é a segunda principal causa de mortes por câncer do sexo masculino. Em 2011, só nos EUA, havia 240,890 novos casos de CaP e cerca de 33.720 mortes [1]. CaP, como muitos cancros, é caracterizado por a expressão alterada de citoquinas e factores de crescimento. Um tal citoquina é MIC-1 /GDF15, um membro do divergente do fator de crescimento transformador-β (TGF-β) superfamília [2], que é sobre-expresso por muitos pacientes com cancros comuns incluindo os da próstata e pode ser ainda mais Induzida por terapias contra o câncer, incluindo cirurgia, quimioterapia e radioterapia da próstata, cólon e cancro da mama [3] – [9].

MIC-1 /GDF15 expressão da proteína é marcadamente aumentada em tecidos de câncer, e câncer linhas celulares . Nos cancros, tais como o da próstata, a principal fonte de MIC-1 /GDF15 é a própria célula epitelial maligna [5], [10], embora também possa ser um contributo a partir de células do estroma do tumor [11] e fagócitos presentes [12]. Esta expressão tumoral do MIC-1 /GDF15 muitas vezes se reflete em seus níveis sanguíneos, que aumentam com o desenvolvimento e progressão [5] cancro, [10], [13] – [27], geralmente na proporção do palco e extensão da doença . Por exemplo, os níveis séricos aumentam progressivamente em pacientes do normal, aos pólipos de baixo grau do cólon, pólipos do cólon de alta qualidade, o cancro do cólon localizada e câncer de cólon finalmente divulgadas [13]. Os doentes com cancro do cólon que têm elevados níveis de soro MIC-1 /GDF15 tem um pior prognóstico geral e doença mais cedo recaída [13], [25]. Resultados semelhantes foram observados para muitas outras doenças malignas, incluindo melanoma [28], [29] e os cancros do pâncreas [12], [19], [30], da tiróide [31], [32], do ovário [26] e endométrio [27]. Em pacientes com câncer de próstata, MIC-1 concentrações séricas /GDF15 prever independentemente metástase óssea e sobrevivência global [14], [21].

Em pacientes com cancros avançados, os níveis de MIC-1 /GDF15 soro subir de uma média em pacientes não-cancerosas de cerca de 450 pg /ml [13] a até 10.000-100.000 pg /ml [5]. Por causa de seus efeitos sobre centros de alimentação dentro do cérebro, a elevação dos níveis séricos de MIC-1 /GDF15 é uma importante causa de associado a um cancro anorexia /caquexia [33]. A quantidade de MIC-1 /GDF15 presente no soro de doentes com cancro é, em parte, dependente da proporção de MIC-1 /GDF15 localizada ao tumor versus a difundir para a circulação [34]. O processamento variável de resultados MIC-1 /GDF15 na secreção de uma forma (sem prop�tido), ambos não transformados (com prop�tido) e um processada [34]. Como o seu domínio de propéptido se liga à matriz extracelular, não transformados MIC-1 /GDF15 permanece localizada ao estroma do tumor, enquanto que a forma processada difunde-se rapidamente na circulação [12], [34]. Na APC, uma maior quantidade de MIC-1 /GDF15 localizada no tumor melhora o resultado do paciente, especialmente naqueles com uma pontuação de Gleason de 6 ou menos [34]

.

Apesar de existirem várias linhas de evidências que ligam MIC-1 /GDF15 ao câncer em dados gerais e PCA especificamente, convincentes e coerentes em seu papel biológico na patogênese e progressão do câncer é limitado [4]. Evidence, em grande parte de

in vitro experimentos xenotransplante de

e fornecer resultados aparentemente contraditórios. A maioria dos estudos têm sugerido que o MIC-1 /GDF15 tem actividade anti-cancro e induz a apoptose de células de tumor [35] – [38]. Por exemplo, MIC-1 /GDF15 transfectadas células de cancro colorrectal humano exibiram aumento da apoptose basal HCT-116,, o aumento da resposta aos medicamentos anti-inflamatórios não-esteróides e reduzida eficiência de clonagem de agar macio [35]. A linha de células DU145 APC, um dos poucos que não expressa MIC-1 /GDF15, sofre apoptose quando tratadas

in vitro

com MIC-1 /GDF15 [36].

Contrariando a os dados acima, há também evidências de

in vitro

experimentos que MIC-1 /GDF15 podem facilitar a progressão do tumor [39] – [42]. Por exemplo, aplicada MIC-1 /superexpressão GDF15 ou tratamento com purificada recombinante MIC-1 /GDF15 aumentou significativamente o

In vitro

invasão de linhas celulares de cancro gástrico. Este foi mediada por um aumento da urocinase do tipo activador do plasminogénio (uPA) e activação envolvida de sinais extracelulares regulada quinase-1/2 (ERK-1/2) [16]. Superexpressão e experiências knockdown na linhagem humana LNCaP-C33 andrógeno-dependentes de células CaP e sua variante altamente metastático, andrógeno-independente LNCaP-LN3 têm mostrado que MIC-1 /GDF15 pode promover a proliferação de receptor de andrógeno (AR

+) – células LNCaP positivas através da estimulação da via de sinalização de ERK-1/2 [20]. Por outro lado, outros não têm sido capazes de identificar qualquer ação do MIC-1 /GDF15 no

in vitro

proliferação de células LNCaP [36].

O

in vivo

actividades relacionadas com o cancro da MIC-1 /GDF15, também foi examinado em um número limitado de estudos de xenotransplante tumoral. Forçada MIC-1 /GDF15 superexpressão no HCT-116 células cancerígenas do cólon, xenoenxerto em ratinhos nus, resultou em redução no tamanho do tumor [35]. Uma linha celular de glioblastoma, sem resposta antiproliferativa ao MIC-1 /GDF15

in vitro

, não conseguiu crescer como um xenotransplante tumoral em ratos nus quando transfectadas com MIC-1 /GDF15 [43]. Em contraste, siRNA knock down do MIC-1 /GDF15 em uma linha de células de melanoma reduziu significativamente o crescimento de tumores xenoenxerto [28].

Porque MIC-1 /GDF15 é tão frequente e substancialmente sobre-expresso em cancros e porque os tratamentos anti-câncer induzir MIC-1 /expressão GDF15 tanto em tecidos de câncer e não-cancerosas, quaisquer efeitos sobre o comportamento do tumor pode ser de grande significado clínico. A fim de obter os dados mais confiáveis ​​sobre o papel global do MIC-1 /GDF15 na biologia da APC, e pelo câncer analogia, em geral, utilizamos

T

ransgenic

A

denocarcinoma de

M

ouse

P

rostate ratos propensos (TRAMP) de câncer de próstata. ratinhos TRAMP expressar SV40 genes precoces (T e T; TAG) no epitélio da próstata sob o controle de probasina rato (RPB) promotor [44]. ratinhos TRAMP macho heterozigóticos desenvolver cancro da próstata progressiva que apresenta o espectro da doença, uma vez que ocorre em homens que é invasivo e capaz de disseminação metastática para locais distantes, principalmente os nódulos linfáticos pélvicos, do fígado, do rim e os pulmões [45]. Atravessamos ratinhos TRAMP com MIC-1 /GDF15 superexpressão ratos (MIC-1

FMS) para produzir ratinhos TRAMP que superexpressam MIC-1 /GDF15 (TRAMP

fmsmic-1). Em MIC-1

FMS ratos expressão do MIC-1 /GDF15 é a partir de células mielóides (macrófagos, células dendríticas e neutrófilos) e é suficiente para aumentar seus níveis séricos em cerca de 10-90 vezes [33]. Nós comparamos a taxa de sobrevivência, padrão de crescimento APC e espalhar em TRAMP e TRAMP

fmsmic 1-ratos. Estes estudos demonstram que, embora TRAMP tumores

fmsmic-1 ratos mais lentamente crescendo, sobrevivem cerca de 1/3 mais longos e têm tumores de grau inferior, eles desenvolvem muito mais metástases. Portanto, como TGF-β, MIC-1 /GDF15 tem um efeito complexo sobre o comportamento do tumor, inibindo o crescimento do tumor local, mas aumentando a propagação metastática.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Todos os procedimentos de pesquisa e de cuidados com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética Garvan Institute /St Vincent Hospital Experimentação animal (Ética no: 07/05 e 10/05) e estavam de acordo com o Código australiano de Prática para o Cuidado e Uso de animais para fins científicos.

ratinhos transgénicos

Homem ratinhos TRAMP heterozigotos para o transgene PB-Tag, foram gerados por meio de cruzamentos TRAMP

+/- fêmeas (C57BL /6 background) com não transgénicos C57BL /6 machos. Nos ratinhos TRAMP, a sequência reguladora mínima probasina de ratos (RPB) segmenta gene precoce de SV40 (T e T; Tag) expressão especificamente ao epitélio prostático [44]. ratinhos singénicos que sobre-expressam MIC-1 /GDF15 sob controlo do promotor celular mielóide específico c-fms (MIC-1

SFM) foram utilizados para produzir ratinhos TRAMP que também superexpressam MIC-1 /GDF15 (TRAMP

fmsmic-1 ). -1 MIC expressão /GDF15 no MIC-1

FMS ratos é a partir de células mielóides, mas é suficiente para também aumentar seus níveis séricos em cerca de 10-90 vezes [33].

O TRAMP transgênicos dupla

camundongos fmsmic-1 foram gerados pelo cruzamento TRAMP

+/- fêmeas com homozigotos MIC-1

FMS machos. O transgene de PB-T de SV40 foi identificado utilizando ADN extraído de amostras de cauda e iniciadores de PCR dirigidos ao PB-antigénio T de SV40 sequência: Pb-forward: 5′-CCGGTCGACCGGAAGCTTCCACAAGTGCATTTA-3 ‘e SV40Tag-inversa: 5′-CTCCTTTCAAGACCTAGAAGGTCCA-3’ . A PCR foi realizada utilizando a mistura de reacção e condições descritas anteriormente [46]. O transgene MIC-1 /GDF15 em TRAMP

fmsmic-1 ratos foi identificada por PCR utilizando iniciadores, para a frente da bandeira-: 5′-GACTACAAGGACGACGATGACAAG-3 ‘e MS8-inversa: 5′-CGAAGCCTACCGCGTGCACCGAG-3’ e as condições de reacção: desnaturação a 95 ° C durante 10 s, emparelhamento a 60 ° C durante 20 s e extensão a 72 ° C durante 30 s.

Survival Study

com base na análise estatística de amostra poder tamanho, fmsmic-1 ratos 35 TRAMP e 35 TRAMP

foram alocados em 4-6 semanas de idade, para um estudo de sobrevivência. A partir desse momento, os ratos foram pesados ​​uma vez por semana e monitorizados duas vezes por semana para o tamanho do tumor e medida por palpação do abdómen. Camundongos morreram ou foram abatidos quando atingiram pontos finais éticos do tamanho do tumor maior do que 11 mm x 11 mm x 11 mm, de perda de peso mais de 20% ou satisfazer quaisquer outros critérios éticos ponto final para a eutanásia. A sobrevida global de ratos indivíduo foi calculado desde o nascimento até ponto final ética ou morte por tumor. distribuição de sobrevivência foi estimada utilizando o método de Kaplan-Meier. Na necropsia o complexo geniturinário (GU) consistindo de próstata (incluindo dorsal, lateral, ventral, e lóbulos anteriores), uretra, glândula ampular, vesículas seminais (SV) e bexiga urinária foi retirada e pesada. Peso do GU, da próstata, e SV de cada rato foi normalizado com o seu peso corporal (peso órgão /peso corporal).

Tumor Primário Tamanho

Num coorte separada para que acima, GU e o crescimento do tumor de próstata foi comparado em TRAMP e TRAMP

fmsmic 1-ratos. No início do estudo, 60 TRAMP e 60 TRAMP

fmsmic 1-ratos, 15 de cada para cada etapa, foram pré-alocada para ser sacrificados em diferentes pontos de tempo a partir do início de estágios tumorais avançados (8, 17, 25 e 33 semanas de idade). Um adicional de 3 ratos foram designados para o vagabundo, um grupo de 33 semanas como 3 dos ratos originais deste grupo morreram ou atingido pontos finais éticos entre 23 e 33 semanas de idade. Para cada um dos 60 ratinhos foram necropsiados e o GU foi excisado. Total de GU, próstata e vesícula seminal de peso foram medidos e dimensões prostáticas gravado. Todas as medições foram normalizadas para o rato dador de peso corporal total. Depois disso, o tecido foi usado para a classificação tumor de próstata.

Prostate Tumor Grading

tecidos da próstata de 8, 17, 25 e 33 semanas velho vagabundo e TRAMP

fmsmic 1-ratos acima , foram colocados numa cassete e fixadas em 10% de formalina tamponada neutra. Foi tomado cuidado para fazer e incorporar próstatas de todos os ratos nesta experiência com a mesma orientação. Os cortes foram tomadas em 200

–

^ m intervalos até que o tecido no bloco estava exausta. As lâminas foram coradas com hematoxilina e eosina e todas as seções para animais individuais foram examinadas utilizando microscopia de luz, por um histopathologist experientes em patologia da próstata. O histopatológico foi cegado como para o genótipo dos ratinhos a partir de onde o tumor foi originado. As seções tecidos foram classificadas de acordo com os critérios de Gingrich et al [47]. Resumidamente, (

a

) epitélio normal foi atribuída uma pontuação de 1; (

b

) de baixo grau neoplasia intra-epitelial prostática (PIN) com inserir tufos do epitélio e aumento do núcleo para citoplasma foram classificados como 2; (

c

) PIN de alto grau com estruturas cribiformes observou e um aumento na mitose e /ou figuras apoptóticos foi classificada como 3; (

d

) adenocarcinoma bem diferenciado com a perda de espaços interductal ea invasão das membranas basais foi classificada como 4; (

e

) adenocarcinoma moderadamente diferenciado com perda total de lumens ductais com evidência de adenocarcinoma foi classificada como 5; e (

f

) adenocarcinoma fracamente diferenciado com folhas de células anaplásicas foram marcados como 6. Cada secção de cada ratinho foi graduada e a proporção da próstata afectado por cada grau foi estimada. Os dados de todas as seções em um determinado rato foram reunidas para fornecer uma proporção média de próstata afetada por cada grau cancro da próstata.

Identificação de metástases tumorais

Estimou-se a ocorrência de metástases no tempo de morte ou abate em TRAMP grupo sobrevivência e TRAMP

fmsmic 1-ratos. No nódulos linfáticos pélvicos necropsia, rim, fígado e tumores rectais (se presente) foram colhidas e fixadas em 10% de formalina tamponada neutra. Os pulmões foram excisados, pesados ​​e fixados em fixador de Bouin (Sigma-Aldrich) para visualizar e contar as colónias de tumor do pulmão. As lesões metastáticas em todos os órgãos foram contadas sob um microscópio de dissecação. Algumas das lesões foram confirmadas por H E coloração e ainda por imunocoloração de cortes de tecidos congelados com anticorpo anti Tag (Santa Cruz) para confirmar a origem prostática do tumor

Para garantir a precisão dos dados metástase obtido. a partir dos ratos do grupo de sobrevivência, examinámos uma outra coorte de ratinhos TRAMP (n = 59) e TRAMP

fmsmic-1 (n = 33). Neste grupo, determinou-se a proporção de ratos com metástases que morreram entre 18-40 semanas, um período em que TRAMP e TRAMP

fmsmic-1 ratos atingir pontos finais éticos na mesma proporção.

Avaliação

MIC-1 /GDF15

expressão por qRT-PCR

-1 MIC /expressão GDF15

em próstatas de 8, 17 e 25 semanas TRAMP (n = 5) e TRAMP

fmsmic-1 (n = 5) ratinhos foi determinada por qRT-PCR e normalizada para

B-actina

(gene de arrumação) expressão. As amostras foram recolhidas e colocadas imediatamente em 1 ml de RNAlater (QIAGEN), para armazenamento a -20 ° C até à extracção. O ARN foi extraído utilizando Trizol (Invitrogen) e Ambion PureLink ARN Mini Kit (Invitrogen) com a etapa de ADNase em coluna realizada utilizando ARN-Free DNase Conjunto (Qiagen). AMV transcriptase (Roche Applied Sciences) reversa foi usada para realizar a transcrição reversa em 2 ug de ARN de cada amostra. Os primers específicos para PCR para rato

MIC-1 /GDF15

foram, Forward: 5′-AGGACTCGATCAGAACCAAG-3 ‘e Reverso: 5′-CGGTTGACGCGGAGTAGCA-3’ e para

B-actina

foram Forward: 5′-TGACAGGATGCAGAAGGAGATTACTG-3 ‘e Reverso: 5′-CCACCGATCCACACAGAGTACTTG-3’. As amostras de ADNc (1:10) foram sujeitos a amplificação por PCR com MgCl 25 mM

2 (Roche Applied Sciences), Taq polimerase (Roche Applied Sciences) e corante SYBR Green I (Invitrogen). qRT-PCR foi realizado no aparelho LightCycler LC480 (Roche Applied Sciences). A mistura reaccional foi desnaturada a 95 ° C durante 10 s, seguido de 60 a 67 ° C para recozimento 15 s e extensão a 72 ° C durante 20 s. A especificidade dos produtos foi verificada por meio de curvas de fusão gerados pelo software LightCycler 480 versão 1.5 e pelo tamanho do produto de PCR em géis de electroforese. número de cópias do gene para ambos

MIC-1 /GDF15

e

B-actina foram calculadas fazendo curvas padrão geradas por amplificação diluídas em série

MIC-1 /GDF15

e

produtos a partir de PCR B-actina. valores Cp das amostras foram determinados utilizando segundo cálculos derivativos realizadas por LightCycler 480 software versão 1.5.

MIC-1 /GDF15

copiar números foram normalizados para

B-actina

número de cópias.

-1 MIC /Expressão relativa GDF15

em TC1- a linha de células T5 também foi estimada por qRT-PCR e comparação com a da TRAMP avançada e TRAMP

tumores da próstata fmsmic-1. células TC1-T5 foram cultivadas em placas de seis poços, como mostrado abaixo. ARN a partir de células TC1-T5 (n = 3) foi extraído utilizando RNeasy Mini Kit (Qiagen). ARN de TRAMP (n = 3) e TRAMP

fmsmic-1 (n = 3) de tumor da próstata foi extraído como descrito acima. 2 ug de ARN de cada amostra foi transcrito reversamente e submetido a qRT-PCR usando o mesmo procedimento e

MIC-1 /GDF15

conjunto de iniciadores como acima.

TBP

foi amplificado como um gene housekeeping usando conjunto de primers Forward: 5′-ACCCTTCACCAATGACTCCTATG-3 ‘e Reverso: 5′-ATGATGACTGCAGCAAATCGC-3’. A especificidade dos produtos foi verificada por meio de curvas de fusão gerados pelo software LightCycler 480 Versão 1.5 ou por tamanho em géis de electroforese. proporção relativa de

MIC-1 /GDF15

para

TBP

foi então calculada usando LightCycler 480 software versão 1.5.

Estimativa de TC1-T5 TRAMP pulmão Tumores

TRAMP C1 (TC1) é uma linha celular dependente de androgénio CaP derivada de tumor da próstata TRAMP por Foster et al. [48]. TC1-T5 é uma sub-linha independente de andrógeno de linha de células TC1 [49]. células TC1-T5 não expressam MIC-1 /GDF15 em cultura e são, portanto, adequados para avaliar os efeitos de MIC-1 /GDF15. células TC1-T5 foram cultivadas em meio DMEM (Invitrogen, Life Technologies) contendo 5% de carvão dextrano soro fetal de vitelo-despojado e 125U L insulina /(Humulin-BD Biosciences). Para testar directamente se células TC1-T5 seria mais metastizar em MIC-1

ratinhos fms, que injectado 5 × 10

5 células em um volume total de 100 ul na veia da cauda de MIC de 9 semanas de idade 1

FMS (n = 17) e ratinhos singeneicos C57BL /6 (n = 14). Dez semanas mais tarde, os ratinhos foram sacrificados; os seus pulmões foram excisadas e fixadas em fixador de Bouin (Sigma-Aldrich). colónias pulmonares na superfície de todos os lobos de ambos os pulmões foram contados sob um microscópio de dissecação.

Análise Estatística

Avaliações estatísticas de todos os experimentos foram realizados com a versão do software GraphPad Prism 5 (GraphPad Software , San Diego, CA, EUA). Todos os dados são apresentados como a média ± erro padrão da média (SEM). As comparações entre os grupos foram feitas usando não pareado

t

testes ou Qui-quadrado, conforme apropriado e os valores de p bicaudais relatado. As curvas de sobrevida foram analisadas por análise de Kaplan-Meier e log-rank estatística é relatado. Para examinar a relação de metástase com tempo de sobrevida foi utilizado a análise multivariada. Todos os fatores significativamente associados à metástase por regressão univariada foram incluídas em um modelo de regressão multivariada com tempo de sobrevida. Um valor p inferior a 0,05 considerado estatisticamente significativo.

Resultados

superexpressão do MIC-1 /GDF15 Prolonga CaP de sobrevivência em camundongos TRAMP

A fim de avaliar os efeitos do MIC -1 /GDF15 na sobrevida global dos ratinhos TRAMP, acompanhámos uma coorte de TRAMP e TRAMP

fmsmic 1-ratos até que a morte ou o ponto final ética. Kaplan-Meier análise de sobrevivência mostrou que a dupla TRAMP transgênico

fmsmic-1 sobreviveram significativamente mais longa do que os ratos TRAMP (Fig. 1A, p

=

0,0002, teste log-rank).

No geral sobrevivência de ratinhos individuais desde o nascimento até à morte é apresentada (painel a). Os dados de sobrevivência para TRAMP (-▴-) e 1 fmsmic-(-Δ-) ratinhos TRAMP

foram plotados utilizando o método de Kaplan-Meier. O log-rank estatística para tempo médio de sobrevivência é mostrado. O geniturinário (GU), vesícula seminal (SV) e próstata tamanhos tumorais em TRAMP

camundongos fmsmic-1 e TRAMP (n = 15 /grupo) sacrificados aos 8, 17, 25 e 33 semanas de idade são apresentados no painel B , C e D. A GU (painel B), SV (painel C) e os pesos da próstata (painel D) são apresentados como média de peso de peso mg /g de corpo ± SEM. os valores de p são mostradas como * p

0,05; ** P

0,01; *** P

0,001

Inicialmente, tanto TRAMP e TRAMP

fmsmic 1-ratos morreram em uma taxa similar.. No entanto, após cerca de 38-40 semanas, os ratinhos TRAMP começou a sucumbir mais rápido do que o vagabundo

fmsmic-1 ratos. A sobrevivência de 50% das 40 semanas em ratinhos TRAMP foi estendido para 51 semanas na TRAMP

grupo fmsmic-1. Além disso, enquanto apenas 9,4% dos ratinhos TRAMP sobreviveu na semana 50, 52% dos TRAMP

fmsmic-1 ratos ainda estavam vivos (Fig. 1A). Acima de tudo, o tempo médio de sobrevivência para TRAMP

fmsmic-1 ratos foi de 47,4 semanas e foi de 41 semanas para os ratinhos TRAMP. Assim, em média, TRAMP

fmsmic-1 ratinhos sobreviveram aproximadamente 7,4 semanas (~ 2 meses) mais longas do que os ratinhos TRAMP. Estes dados indicam que o aumento da expressão do MIC-1 /GDF15 é capaz de melhorar substancialmente CaP sobrevida relacionada em ratinhos TRAMP.

superexpressão do MIC-1 /GDF15 Restringe Crescimento CaP

Para avaliar diretamente o impacto do MIC-1 /GDF15 sobre o crescimento do câncer de próstata, atribuímos 60 TRAMP e 60 TRAMP

fmsmic 1-ratinhos com 4-6 semanas de idade e abatidos-los progressivamente ao longo 8-33 semanas de idade. As comparações foram feitas usando o 15 ratos pré-atribuídos a cada grupo nos quatro pontos diferentes horários (8, 17, 25 e 33 semanas), o que representa muito cedo para estágios tumorais avançados. Dados a partir de ratinhos sacrificados em cada ponto de tempo indicado que TRAMP

fmsmic-1 ratos tiveram significativamente menores complexos GU que TRAMP camundongos (Fig 1B.) Em todas as fases (P = 0,0004, P = 0,0005, P 0,0001 e p = 0,02, respectivamente).

Quando próstata e pesos SV foram analisados ​​separadamente a partir do complexo de GU, tamanhos tumorais SV foram significativamente reduzidos em TRAMP

fmsmic 1-ratinhos em todos os pontos de tempo (Fig. 1C). Foi observado um efeito semelhante, mas mais variada, de MIC-1 /GDF15 sobreexpressão no crescimento do tumor da próstata (Fig. 1D). Havia 17,0% e 26% de redução no peso do tumor de próstata nas semanas 8 e 25, respectivamente, em TRAMP

fmsmic-1, em comparação com ratinhos TRAMP (p

=

0,04 e 0,01, respectivamente). Embora haja foi reduzido peso do tumor em TRAMP

fmsmic 1-ratos com 17 semanas ( 10%), a diferença entre os dois grupos não foi significativa. Aos 33 semanas, embora tenha havido redução de 55% no peso médio da próstata em TRAMP

fmsmic-1 ratinhos em comparação com o que em ratinhos TRAMP, a diferença entre os dois grupos não era significativa, devido à grande variação no tamanho do tumor de próstata no grupo TRAMP. camundongos adicionais necessários para ser atribuído a este grupo como muitos dos ratos originalmente atribuídos morreram /atingiu o ponto final ética entre 23 e 33 semanas, potencialmente polarizar os resultados Vagabundo, pela seleção de ratinhos TRAMP com tumores menores. Estes ratos com tumores menores eram mais propensos a sobreviver a 33 semanas de idade e ser selecionado. No entanto, os dados sugerem, de acordo com os dados de sobrevivência de coorte, que a superexpressão MIC-1 /GDF15 diminui o crescimento do tumor.

TRAMP

fmsmic-1 Os ratos têm cancros de grau inferior

Além a seguir o crescimento do tumor, verificou-se se MIC-1 /GDF15 também pode afetar grau APC, por meio dos escores histopatológicos em TRAMP e duplas TRAMP transgênico

tumores de próstata fmsmic-1. Na semana 8, baixo (grau 2) e alta (Grau 3) grau PIN foram as patologias dominantes em TRAMP e TRAMP

camundongos fmsmic-1. Enquanto a proporção média da próstata afetada por PIN foi maior em comparação com TRAMP TRAMP

fmsmic-1 ratos; no entanto, essa diferença não foi estatisticamente significativa (Fig. 2A).

Prostates de 15 TRAMP e 15 TRAMP

fmsmic-1 ratos foram excisadas na semana 8 (painel A), 17 (painel B), 25 (painel C), e 33 (painel D). As secções em série foram classificados e pontuações para cada série foram a média para todos os ratinhos no grupo. O gráfico representa a proporção média da próstata a partir de todos os murganhos no grupo possuindo cada grau patológico diferente, registados entre 1 e 6 ± SEM. Números sobre as barras indicam o número de ratos no grupo com um determinado grau. os valores de p são mostradas como * p

0,05; ** P

0,01; *** P

.

0,001

Na semana 17, Grau 2 e Grau 3 patologias ainda eram dominantes em ambas as linhas de rato, mas Grau 4, 5 e 6 tumores começou a emergir nas próstatas TRAMP. Neste momento ratos ponto TRAMP tinham significativamente mais Grau 3 da doença (p 0,0001) e significativamente menos doença de grau 2 (p 0,0001). Do que TRAMP

fmsmic 1-camundongos indicam maior progressão rápida do tumor (Fig. 2B)

Com 25 semanas de idade, categoria 4 tumores foram mais proeminentes em ratinhos TRAMP mas regiões de Grau 2 e tumor de grau 3 ainda estavam presentes em ambas as linhas do mouse. Comparação entre os tipos de tumores individuais na TRAMP e TRAMP

fmsmic-1 de próstata mostraram que uma percentagem mais elevada do TRAMP

fmsmic 1 da próstata tiveram os mais baixos graus 2 e 3 tumores (p

=

0,004 e 0,02, respectivamente), enquanto uma porcentagem significativamente menor de TRAMP

fmsmic-1 da próstata teve a nota mais agressivas 4 tumores (Fig. 2C, p

=

0,019).

por 33 semanas de idade (Fig. 2D), a maioria dos ratos, em ambos os grupos, apresentavam doença avançada ea diferença na distribuição de notas de tumor entre o vagabundo e TRAMP

fmsmic-1 ratos não foi significativa. Mais uma vez estes dados podem ter sido influenciados pelo viés de seleção no grupo TRAMP 33 semanas, discutido acima. Os ratos no grupo TRAMP com tumores mais agressivos morreu antes de 33 semanas de idade, e apenas ratos com tumores menos agressivos sobreviveu a esta idade. No geral, estes dados sugerem que TRAMP

fmsmic-1 ratos têm uma proporção maior da próstata com um grau de tumor mais baixa do que os ratinhos TRAMP (Fig. 2A, B, C e D), indicando que a sobreexpressão MIC-1 /GDF15 retarda evolução do tumor local.

TRAMP próstata Lacks MIC-1 /GDF15 expressão

a fim de excluir a possibilidade de que a expressão do MIC-1 /GDF15 por cancros nos ratinhos TRAMP pode ter impacto sobre tumor crescimento e modificar diferenças entre eles e ratos geneticamente modificados para superexpressão dessa citocina, quantificamos MIC-1 expressão /GDF15 nos tumores da próstata e da vesícula seminal de TRAMP e TRAMP

fmsmic 1-ratos. Devido à indisponibilidade de um rato estabelecida MIC-1 /GDF15 ELISA e um anti-rato específica MIC-1 /GDF15 anticorpo monoclonal, usamos qRT-PCR para comparar a expressão MIC-1 /GDF15 em TRAMP e TRAMP

fmsmic-1 próstata e tumores primários. Não foi insignificante expressão /GDF15 MIC-1 em ratinhos TRAMP, que são do tipo selvagem para MIC-1 /GDF15, às 8, 17 e 25 semanas de idade (Fig. 3a) e com tumores avançados (Fig. 3b). Em contraste TRAMP

fmsmic-1 expressa ratinhos 44-166 vezes mais MIC-1 /GDF15 (Fig. 3A) na sua próstata que é consistente com c-fms conduzido a expressão do transgene MIC-1 /GDF15 a infiltração de células mielóides.

(a)

MIC-1 /GDF15

expressão foi quantificado por qRT-PCR na próstata de TRAMP e TRAMP

fmsmic-1 em ratinhos 8, 17 e 25 semanas e normalizada para

expressão B-actina como descrito em materiais e métodos. (B) Relativa

MIC-1 /GDF15

expressão foi quantificado por qRT-PCR na linha de células TC1-T5 (n = 3) e comparada com TRAMP (n = 3) e TRAMP

fmsmic- 1 (n = 3) do tumor de próstata após a normalização com a expressão

TBP

. Os valores são apresentados

-MIC 1 expressão como média normalizada /GDF15

± SEM. valores de p para o bicaudal não pareado

t

teste são mostrados como *** p

.

0,001

Enquanto TRAMP

fmsmic-1 ratos viver mais tempo eles têm mais metástase

uma vez que a metástase é a principal causa de morte por tumores sólidos em pacientes com PCA, que avaliou o efeito do MIC-1 /GDF15 sobre a incidência e extensão de metástase em ratinhos TRAMP. Embora TRAMP

fmsmic-1 machos vivem mais e têm mais lento o crescimento do tumor primário (Fig. 1 A, B, C e D), uma proporção significativamente mais elevada destes ratinhos demonstraram órgãos com metástases. 15 dos 30 (50%) TRAMP

fmsmic-1 ratos tinham metástases órgão distante em comparação com 6 dos 30 (20%) de ratinhos TRAMP (Fig. 4A). Uma proporção significativamente maior de TRAMP

fmsmic-1 ratos tinham lesões metastáticas macroscopicamente detectáveis ​​no fígado, rim e reto. Enquanto a proporção de TRAMP

fmsmic 1-camundongos com tumores de pulmão de superfície foi também aumentou, este ficou aquém de significância estatística (Fig. 4A). Curiosamente metástases rectais desenvolvido em 6 dos 30 TRAMP

fmsmic-1, mas não em qualquer um dos ratinhos TRAMP (Fig. 4A). Não houve diferença no peso do nódulo linfático (dados não mostrados), sugerindo que a disseminação linfática não foi aumentada em TRAMP

fmsmic 1-ratos. Para garantir que o aumento no número de metástases não era apenas devido ao aumento de tempos de sobrevivência foram examinados os dados disponíveis por regressão logística. Esta análise confirmou que o aumento na metástase era independente do tempo de sobrevivência (p = 0,03; regressão multivariada). Além disso, foi notável que esta ocorreu em face de tumores menores e menores graus de tumor em todas as fases da doença, sugerindo mecanismos independentes do efeito de MIC-1 /GDF15 sobre o tumor primário.

(A) comparação entre a proporção de TRAMP (n = 30) e TRAMP

ratinhos fmsmic-1 (n = 30) que tem metástases órgão distante. Os dados são analisados ​​pelo teste do qui-quadrado.