Abstract

Em trabalhos anteriores, demonstramos que fator de transcrição Trim28 (motivo Tripartite contendo 28) desempenha um papel supressor de tumor em adenocarcinoma early-encenado do pulmão devido à sua capacidade para conter a transcrição do ciclo celular -Regulamentação genes. Aqui nós examinamos o papel da Trim28 na transição (EMT) epitelial para mesenquimal, que está fortemente implicada na metástase do cancro. Descobrimos que Trim28 desempenha um papel na EMT induzida por TGF-β em células do cancro do pulmão de células não-pequenas. Silenciamento Trim28 com RNAs inibitórios altera a expressão de numerosos marcadores EMT, tal como E-caderina e N-caderina, enquanto que a sobre-expressão de Trim28 tem um efeito oposto. Trim28 expressão é induzida após tratamento com TGF-β em ambos os níveis de mRNA e proteína. deficiência Trim28 prejudica EMT induzida por TGF-β e diminui a migração celular e invasão. Finalmente, foi demonstrado que a expressão de Trim28 afecta a acetilação e metilação das histonas em E-caderina e N-caderina promotores. Estes resultados sugerem que Trim28 contribui para EMT e pode ser importante para a metástase do tumor no cancro do pulmão. Tomados em conjunto com o nosso trabalho anterior estes resultados sugerem um modelo no qual Trim28 é um supressor de tumor no início do processo de transformação em cancro do pulmão, mas em etapas posteriores que funciona como um oncogene

citação:. Chen L, Muñoz- Antonia T, Cress WD (2014) Trim28 contribui para EMT através de regulamento da e-caderina e N-caderina em linhas celulares de cancro do pulmão. PLoS ONE 9 (7): e101040. doi: 10.1371 /journal.pone.0101040

editor: Olivier de Wever, Universidade de Ghent, Bélgica

Recebido: 11 de dezembro de 2013; Aceito: 03 de junho de 2014; Publicação: 01 de julho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Chen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do Instituto Nacional do Câncer (CA119997 e CA163068) e Moffitt Cancer Center. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a transição epitelial-a-mesenquimal (EMT) é caracterizada por uma perda de adesão célula-célula e a polaridade, a sub-regulação de marcadores epiteliais e mesenquimais aquisição de marcadores e o fenótipo [1]. Acumulando evidências de investigações sobre EMT implicaram muitas vias de sinalização, incluindo TGF-β, Notch, Wnt, EGF e FGF [2]. Entre estes, o TGF-β induz EMT eficientemente numa variedade de linhas de células de modelo e

In vivo

[3]. Tal como muitos outros processos biológicos, em última análise, EMT é regulado transcricionalmente por um número de factores de transcrição, tais como Snail1, Snail2, ZEB1 ZEB2 e [4]. Além disso, modificadores epigenética também demonstraram desempenhar um papel na regulação da EMT. Para exemplos, histona deacetilase SirT1 induz EMT através de fator de transcrição ZEB1 enquanto metiltransferase histona SUV39H1 e G9a reprimir a expressão da caderina-E e induzir EMT de forma Caracol-dependente [5], [6], [7].

Trim28 é membro de uma família evolutivamente conservada de co-factores de transcrição que têm diversas funções [8]; incluindo a regulação da proliferação celular, reparo do DNA, diferenciação e pluripotência [9], [10], [11], [12]. Trim28 tem sido especificamente implicada na activação de EMT em fibroblastos [13] e células de cancro cervical [14]. Dependente de contexto, Trim28 pode activar ou reprimir a transcrição através de mecanismos distintos [15], [16], [17], [18]. silenciamento de genes mediada por Trim28 foi mostrado a envolver uma associação com SETDB1 histona metiltransferase, histona desacetilase NURD complexo e o recrutamento de regiões promotoras através de factores de transcrição específicos de sequência [19], [20]. Este complexo suprime a transcrição de genes-alvo, alterando as modificações de histonas aos promotores [8]. Quando fosforilado em S824, Trim28 foi mostrado para associar com o factor de transcrição OCT3 /4 e activar OCT3 /4 genes alvo transcrição [12]. Outro mecanismo de activação da transcrição Trim28 mediada é através do recrutamento de elementos de resposta específicos, tais como o elemento de glucocorticóides-responsivo (GRE) e elemento de resposta Nur (Nure), por NGFI-B e C /EBP p, respectivamente [17], [18]. Estudos recentes têm sugerido que Trim28 pode desempenhar um papel no desenvolvimento do cancro e metástase [13], [14]. Especificamente, a expressão Trim28 é sobre-regulada em tecidos de cancro em comparação com tecidos normais [9], [21], [22], [23]. Em uma pesquisa de proteínas associadas a metástase do câncer de mama, Trim28 foi identificada como uma das 197 proteínas com expressão elevada em tecidos metastáticos [24].

Em nosso trabalho anterior [9], descobrimos que a alta Trim28 (Tripartite motif contendo 28) proteínas níveis se correlacionam com a sobrevivência global mais longa em pacientes de adenocarcinoma de pulmão primeiros-encenado, mas não em pacientes tardios-encenado. Esta observação sugeriu-nos que Trim28 pode desempenhar um papel duplo no câncer de pulmão. Nós especulamos que o papel em fases posteriores pode se relacionar com EMT [14]. A fim de testar esta hipótese, examinámos o efeito de depleção de Trim28 shRNAi mediada em EMT em linhas celulares de NSCLC (A549 e H358). Descobrimos que contribui para Trim28 EMT-TGF-β induzida, e que favorece alta Trim28 EMT Trim28 sugerindo que pode ser um regulador de metástase de tumor, especialmente na fase posterior de desenvolvimento de cancro do pulmão.

Materiais e Métodos

as linhas celulares, plasmídeos, e reagentes

linhas de células de câncer de pulmão originais foram obtidos a partir da ATCC. As células A549 e H358 foram cultivadas em meio RPMI 1640 com soro bovino fetal a 10%. células Trim28 deficiente A549 (Trim28 shRNA), A549 Trim28-proficientes e células derivadas semelhante linhas de controle foram descritos anteriormente [9]. As células H358 que expressam estavelmente Trim28 shRNA foram seleccionados em 1 ug /ml de puromicina. As células H358 que expressam estavelmente Trim28 foram seleccionados em 500 pg /ml de G418. Os clones individuais foram rastreados quanto à expressão Trim28. As linhas celulares de controlo similarmente derivados foram gerados utilizando os vectores vazios. PcDNA-FLAG-HA-TIF1β e PRL-TK foram descritos anteriormente [9]. pCS2-Myc-Trim28 [25] e pGL3-E-caderina [26] foram os generosos presentes de Ryan Potts (UT Southwestern) e Jia fang (Moffitt Cancer Center), respectivamente. TGF-β foi adquirido a R D Systems (240-B-002)

análise de proteínas

Westerns foram realizados como previamente descrito [27].. anticorpos de E-caderina (# 3195S), N-caderina (# 4061S), e β-tubulina (# 2128S) foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology. anticorpo Trim28 (A300-275A) foi de Bethyl Laboratories. Bandeira (F3165), β-actina (A5441), e os anticorpos γ-tubulina (T6557) eram da Sigma. Os ensaios de luciferase foram realizados como previamente descrito [9]. As células foram colhidas 48 horas após a transfecção e a actividade da luciferase foi determinada utilizando o Sistema de Ensaio Repórter Dual-Luciferase (Promega) seguindo o protocolo do fabricante. Os experimentos foram realizados em triplicado e todos biológica foram repetidas três vezes. Luciferase de Renilla vector pRL-TK foi usada para controlar a eficiência da transfecção.

Q-RT-quantitativo PCR em tempo real

ARN celular total foi colhido utilizando o Kit RNeasy Mini (Qiagen) seguindo o as instruções do fabricante. reacções de transcrição reversa foram realizadas utilizando o kit de síntese de ADNc iScript (Bio-Rad). PCR em tempo real foi realizado utilizando SYBR Green Supermix Perfecta em um sistema de detecção por PCR em tempo real CFX96. Os iniciadores utilizados são listados na Tabela 1.

Microscopia de imunofluorescência

microscopia de imunofluorescência

foi realizada como previamente descrito [9]. Os anticorpos primários utilizados para a coloração foram de Cell Signaling Technology (anti-E-caderina # 3195S e anti-tubulina β # 2128S). AlexaFluor 488 cabra-anti-coelho conjugado (Invitrogen) foi utilizado como anticorpo secundário. As células foram fotografadas pela Microscopia Núcleo em Moffitt Cancer Center usando um microscópio confocal Leica SP5 AOBS conjunto digitalização invertido.

ensaios de imunoprecipitação de cromatina

ensaios ChIP foram realizados conforme descrito anteriormente [9]. Os anticorpos utilizados para imunoprecipitação incluem IgG de coelho normal (12-370, Millipore), anti-histona acetil-H3K9 (07-352, Millipore), anti-histona H3 trimetil K9 (ab8898, Abcam) e anti-histona H3 dimetil K9 (ab1220 , Abcam). O ADN precipitado foi purificado utilizando QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen). PCR em tempo real foi realizado utilizando SYBR Green Perfecta SuperMix em um sistema de detecção por PCR em tempo real da Bio-Rad CFX96. Os iniciadores utilizados são listados na Tabela 1.

ensaios de cicatrização de feridas

As células foram semeadas em placas de 6 poços e cultivadas até que 90% confluentes. Três feridas retas foram riscados em cada poço usando um estéril 200 mL ponta da pipeta. As células foram lavadas suavemente com PBS e 2 ml de meio (sem FBS ou contendo FBS a 10%) adicionado. Fotos foram tiradas na ampliação de 40x logo após coçar e novamente após 24 horas e 48 horas. Todos os ensaios foram realizados em triplicado e todas as experiências repetidas três vezes.

ensaios de invasão

ensaios de invasão foram realizadas na câmara BD BioCoat Matrigel Invasão (354480, BD Bioscences) seguindo as instruções do fabricante. Especificamente, as células A549 foram ressuspensas a 5 x 10

4 células /ml e foram carregados para insertos de câmara (inserções de controlo ou inserções de Matrigel-revestido). As células foram incubadas a 37 ° C durante 22 horas e as células que tinham migrado foram lavadas, fixadas com metanol, coradas com 0,5% de violeta de cristal e contadas três campos microscópicos. A invasão por cento foi calculado dividindo-se o número médio de células que invadem através de um inserto de Matrigel por o número médio de células que migram através de um mecanismo de comando. O índice de invasão foi determinada comparando a percentagem de invasão de células de knockdown com a Trim28 cento invasão de células de controlo.

tridimensionais esferóides multicelulares culturas

tridimensionais culturas esferóides multicelulares foram criados de modo semelhante ao descrito [28]. Resumidamente, as células foram ressuspensas em meio de crescimento a uma concentração de 5 × 10

6 células /ml, 30 ul da suspensão de células foram usados ​​para fazer uma gotícula e 12 gotas foram carregadas sobre a tampa de um tecido estéril de 10 centímetros placa de cultura. A tampa foi invertida cuidadosamente e 20 ul de meio de crescimento foram adicionados a cada gotícula antes de serem colocadas numa placa de cultura de tecidos de 10-cm contendo 6 ml de meio de crescimento e incubadas durante a noite. No dia seguinte, 20 ul de meio foi removido de cada gotícula e 20 ul de meio fresco sem TGF-β ou contendo TGF-β (concentração final: 5 ng /ml) foi adicionado. As células foram incubadas durante 72 horas e colhidas para extracção de RNA.

A análise estatística

As experiências foram realizadas em triplicado e apresentados como a média +/- DP. Os dados foram analisados ​​por Student bicaudal

t

-teste para significância.

P

valores inferiores a 0,05 foram considerados estatisticamente significantes e representados por asteriscos nas figuras.

Resultados

deficiência Trim28 altera a expressão de EMT marcadores

Para abordar o papel da Trim28 em A549 e linhas celulares de cancro H358 não-pequenas células do pulmão, o controlo e células deficientes Trim28 foram desenvolvidas utilizando não-silenciamento shRNA como um controlo e shRNA segmentação Trim28. Primeiro, utilizou um anticorpo E caderina e microscopia confocal para a imagem expressão de E-caderina em células A549 de controle e, em A549s Trim28 deficientes. FIG. 1A demonstra que células A549 de controlo expressam níveis relativamente baixos de E caderina, enquanto que as células deficientes em Trim28 expressar uma grande quantidade de caderina E localizada na membrana plasmática. Níveis de β-tubulina não foram afectadas pela Trim28-deficiência. PCR em Tempo Real foi utilizado para examinar a expressão de marcadores de células de EMT adicionais em H358 controlo e A549s Trim28-deficientes e. Como mostrado na Fig. 1B, a E-caderina de ARNm é aumentada enquanto que o N-caderina e Snail2 foram diminuídas nas células knockdown Trim28. Em células H358 (Fig. 1B inferior) E-caderina é aumentada enquanto fibronectina, Snail1, Snail2 e TWIST1 estão diminuídos em células knockdown Trim28. Western blot confirmou que Trim28 knockdown resultou num aumento da expressão de E-caderina e uma redução da expressão de N-caderina ao nível da proteína (Fig. 1C). A redução da proteína N-caderina foi também evidente por microscopia confocal (Fig S1). As respectivas correlações positivas entre a expressão Trim28 e expressão N-caderina e a correlação negativa entre a expressão Trim28 e expressão da caderina-E são também evidentes quando uma série de linhas de células não manipuladas são examinados por Western blot (ver Fig S2).

Um

, controlo e Trim28 knockdown células A549 foram corados (como descrito em “Procedimentos experimentais”) e examinadas utilizando microscopia confocal de imunofluorescência, como se segue: e-caderina (verde, painel superior), β-tubulina ( verde, painel inferior) e DAPI (azul). imagens fundidas estão na parte inferior de cada painel.

B

, extractos de ARN de controlo e Trim28 knockdown A549 e H358 células foram sujeitas a PCR em tempo real para determinar a expressão de genes alvo, tal como indicado.

Os asteriscos

representam significativas

valores p

, *:

p Art 0,05.

C

, a expressão de EMT marcadores de E-caderina e N-caderina foram medidos no controle e Trim28 A549 knockdown e H358 células por western blot.

Trim28 superexpressão altera a expressão de marcadores EMT

Desde que o trabalho anterior tenha relatado que Trim28 pode actuar como um co-factor de transcrição [16], [17], foi perguntado se Trim28 pode regular a actividade do promotor da E-caderina utilizando uma construção repórter de luciferase dirigido pelo promotor de E-caderina. Vector vazio pcDNA ou pCS2-Myc-Trim28 plasmídeos foram transfectados em células A549 e H358 em conjunto com um repórter de luciferase dirigido pelo promotor de E-caderina e um repórter controlo de transfecção (pRL-TK luciferase de Renilla). FIG. 2A mostra que o promotor da E-caderina é significativamente reprimido por Trim28 sobre-expressão em ambas as linhas celulares. Para tratar um maior número de células A549 e H358 marcadores que expressam estavelmente Trim28 foram derivadas, juntamente com as linhas de controlo de modo semelhante utilizando derivados de vector vazio. Como esperado, a sobre-expressão Trim28 resultou em níveis de expressão de E-caderina reduzidas enquanto que os níveis de N-caderina foram aumentados (Fig. 2B). resultados semelhantes (Fig. 2C) foram obtidos ao nível do ARNm utilizando PCR em tempo real. Colectivamente, estes dados sugerem que Trim28 pode promover EMT em linhas celulares de cancro do pulmão.

A

, A549 e H358 foram transfectadas em triplicado com a E-caderina repórter promotor luciferase, repórter PRL-TK, e plasmídeos de expressão indicado na figura. As células foram colhidas 48 horas após a transfecção para a determinação de níveis de luciferase.

B

, controle (pcDNA3) e Bandeira-Trim28 estavelmente expressa A549 e H358 células foram analisadas para E-caderina e N-caderina níveis por western blot.

C

, extratos de RNA de controle e Trim28 A549 expressa de forma estável e H358 células foram submetidas a PCR em tempo real. Determinou-se a expressão de genes alvo.

Os asteriscos

representam

valores significativos p

, *:

p Art 0,05

expressão Trim28 é induzida por TGF-β

sabe-se que a expressão Trim28 e sinalização de TGF-β são ambos aumentada numa variedade de cancros incluindo pulmão [9], [23], [29]. Para determinar se estas observações são ligados no cancro do pulmão, utilizou-se duas linhas celulares de cancro de pulmão de células não-pequenas que passam por cima de EMT tratamento TGF-β como modelos [30], [31]. Como pode ser visto na Figura 3A, os níveis de proteína Trim28 são aumentados depois do tratamento TGF-β em ambas as linhas celulares. Embora o nível basal de Trim28 foi muito baixa em células Trim28 knockdown, no entanto, a sua expressão foi induzida a seguir a incubação de TGF-β. PCR em tempo real mostrou o resultado similar em níveis de mRNA (Figura 3B).

A

e

B

, A549 e H358 expressam de forma estável não silenciar shRNA e Trim28 shRNA foram tratados com TGF-β (2 ng /ml) durante 3 a 10 dias. Os lisados ​​de células inteiras e extractos de ARN foram submetidos a transferência Western usando os anticorpos indicados (A) e PCR em tempo real (B).

Os asteriscos

representam

valores significativos p

, *:

p Art 0,05

Trim28 participa de EMT induzida por TGF-β

TGF-beta células tratadas serão submetidos a EMT que pode ser caracterizada por alterações morfológicas celulares do seixo-como a forma fusiforme [32]. Para determinar se é necessário para Trim28 EMT induzida por TGF-β, que tratada de controlo e células Trim28 knockdown com TGF-β (2 ng /ml) e observou-se a alteração morfológica ao longo do tempo. FIG. 4A demonstra que a aquisição da morfologia mesenquimal no controle H358 induzida por TGF-β não foi observada em células Trim28 knockdown sob a mesma condição sugerindo fortemente que Trim28 está envolvido na EMT induzida por TGF-β. Usando PCR em tempo real, examinou-se o nível de ARNm de caderina-E e outros marcadores conhecidos em mesenquimais controlo A549 e células guarnição KD após o tratamento de TGF-β. Embora em células knockdown Trim28 alguns genes mesenquimais mostrar ligeiro aumento da regulação, a indução robusto de marcadores mesenquimais N-caderina, fibronectina, vimentina, e TWIST1 causada pelo tratamento TGF-β foi significativamente atenuada (Fig.4B). resultados de Western blot (Fig.4C) confirmam que o TGF-β é capaz de reduzir a E-caderina e up-regular a expressão de N-caderina nas células de controle, mas ele não consegue fazê-lo em células Trim28 knockdown.

Um

, controlo e células Trim28 knockdown foram tratados com TGF-β ou deixada sem tratamento. As células foram fotografadas em ampliação de 40 ×.

B

, o ARN foi extraído a partir de células A549 knockdown Trim28 controlo e tratados com TGF-β como acima ou deixada sem tratamento. PCR em tempo real foi realizado e foi determinada a expressão dos genes alvo.

C

, células de controle e Trim28 knockdown A549 e H358 foram tratados com TGF-β (2 ng /ml) até que as mudanças na morfologia foram observadas ou não tratada. Os lisados ​​celulares totais foram submetidos a transferência Western utilizando anticorpos, tal como indicado.

A depleção de Trim28 reduz a migração celular e invasão

O papel de Trim28 na migração celular e invasão foi avaliada por wound- cura ensaio e o ensaio Transwell invasão baseada em Matrigel. Nos nossos estudos anteriores, verificou-se que Trim28 afecta a proliferação celular em células A549, mas não de forma significativa em células H358 (dados não publicados e [9]). Aqui, utilizou-se meio de cultura com ou sem FBS a excluir a contribuição da proliferação de células na determinação da migração de células A549. células Trim28 knockdown mostrou menos de fecho de feridas de células de controlo (Fig.5a e 5B) com ou sem soro. Além disso, o ensaio de invasão Transwell com base em Matrigel mostraram que Trim28 invasão celular inibida knockdown de células A549 (Fig.5C).

Um

, controlo e Trim28 knockdown H358 células foram sujeitas a ferida -healing ensaio. As células foram fotografadas logo após zero, e 24 horas e 48 horas após o início.

B

, controlo e células A549 knockdown Trim28 foram submetidos a cura de feridas ensaio na ausência ou na presença de soro. As células foram fotografadas logo após zero e 24 horas mais tarde.

C, controle e células Trim28 knockdown foram semeadas em triplicado no topo poços de câmaras Matrigel-revestidas ou não-revestidos. Após 18 horas, as células que tinham invadido através da camada de Matrigel foram fixadas e coradas. A percentagem de células invasivas é mostrado no gráfico de barras.

Os asteriscos

representam significativas

valores p

, *:

p Art 0,05.

D

, o controlo e as células A549 foram cultivadas Trim28 knockdown num modelo tridimensional e tratados com TGF-β (5 ng /ml) durante 72 horas. O ARN foi extraído a partir das células e submeteu-se PCR em tempo real. Determinou-se a expressão de genes alvo.

culturas celulares tridimensionais foram mostrados para sofrer EMT de forma mais eficiente do que as células em monocamada [28]. Para examinar se Trim28 knockdown reprime EMT num modelo tridimensional, que semeadas células A549 de controlo e Trim28 knockdown nas tampas de placa de cultura P100 e permitiu-los para formar gotas de suspensão tal como descrito em

Materiais e Métodos

. Depois de 72 horas, na presença de TGF-β, as células foram colhidas e o RNA extraído para análise em tempo real de PCR de marcadores EMT. FIG. 4B revela que após o tratamento de TGF-β a expressão de vimentina, Snail1, e Snail2 em células A549 controlo mudado mais drasticamente (6 a 10 vezes) no modelo 3D (Fig. 5D) do que aqueles em monocamadas (1,5 a 2,5 vezes). No entanto, estes marcadores EMT não foram regulados positivamente em células Trim28 knockdown após o tratamento de TGF-β. Juntos, estes resultados suportam nossa conclusão de que Trim28 é um regulador de EMT.

Trim28 altera histonas 3 modificações no E-caderina e promotores N-caderina

Trim28 foi demonstrada para regular a expressão gênica através modificação de histonas de promotores de genes-alvo [8]. parceiros conhecidos de Trim28 incluem SETDB1 [19], uma histona 3 lisina metiltransferase e histona desacetilases 9-específicos, tais como HDAC1 [8]. Em nosso trabalho anterior, descobrimos que Trim28 knockdown aumenta histona 3 lisina 9 acetilação em determinados promotores alvo [9]. Aqui, nós exploramos se Trim28 afeta histona 3 modificação dos E-caderina e N-caderina promotores. ensaios ChIP foram empregadas e foram usados ​​anticorpos IgG, acetil-H3K9, dimetil-H3K9, e trimetil-H3K9. Como mostrado na Fig. 6A, em células deficientes Trim28, acetilação é aumentada enquanto que a metilação é diminuída em histona 3 lisina 9 do promotor de E-caderina em comparação com células de controlo shRNA. Foi observado um efeito oposto sobre N-caderina nas mesmas células.

A

, ensaios ChIP foram realizados em células A549 knockdown Trim28 controle e. PCR quantitativa foi realizada para examinar a ocupação de IgG, histona acetilada 3 K9, dimetilado histona 3 K9, e trimetilada histona 3 K9 em E-caderina e N-caderina promotores. B, ensaios de ChIP foram conduzidos em células A549 Trim28 expressos de forma estável e de controlo. PCR quantitativa foi realizada para examinar a ocupação de IgG, acetilação das histonas 3 K9, dimetilado histona 3 K9 e trimethylated histona 3 K9 sobre E-caderina e N-caderina promotores.

Além disso, para demonstrar se Trim28 superexpressão pode afetar os e-caderina e N-caderina promotores, usamos o controle pcDNA3 e células A549 Trim28-proficientes e ensaio ChIP realizada. Na Fig. 6B, contrariamente aos resultados observados em células Trim28 knockdown, a acetilação de histona H3K9 metilação é diminuída e é aumentada em células Trim28-proficientes. No promotor de N-caderina, a acetilação de histona 3 H3K9 é aumentada e metilação é diminuída. No total, estes resultados indicam que Trim28 altera E-caderina e N-caderina (pelo menos em parte) por modificação das histonas, que por sua vez, regulam a sua transcrição.

Discussão

Nós mostramos que Trim28 pode afectar a modificação pós-translacional de histona 3 em e-caderina e N-caderina promotores. Neste ponto, nós não elucidaram os mecanismos específicos envolvidos. Trim28 podem mediar essas modificações direta ou indiretamente. O mecanismo direto envolveria modificadores histonas Trim28 e Trim28-associados que são recrutadas para caderina promotores por fatores de transcrição EMT-regulam. Trim28 tem sido demonstrado que se ligam e regulam muitos factores de transcrição desta maneira [16], [19], [33]. primers No entanto, temos projetados visando a -2 kb a +0,5 kb de E-caderina e N-caderina promotores e não conseguiu detectar uma região de ligação Trim28 por ensaio chip (observações não publicadas). Outra possibilidade é que Trim28 regula a expressão de fatores de transcrição relacionados com o EMT que regulam mais genes EMT. Os factores de transcrição que podem residir directamente no promotor da E-caderina incluem Snail1, Snail2, ZEB1, ZEB2, TWIST1 FOXC2 e [4]. Em nosso estudo, descobrimos que a expressão de muitos fatores de transcrição é alterado com Trim28 superexpressão ou deficiência que fornece evidência para apoiar a possibilidade. Investigações posteriores irão explorar este mecanismo.

O componente mais notável do nosso trabalho aqui descrito é que Trim28 influencia EMT TGF-β induzida por no câncer de pulmão através de regulação da transcrição de múltiplos marcadores epiteliais e mesenquimais. Rato estudos knockout condicional indicaram claramente que Trim28 e membro da família relacionada pode se comportar como supressores de tumor [34]; Contudo, outros estudos indicam que Trim28 tem níveis elevados e efeitos oncogénicos em uma variedade de cancros [21], [35]. Propomos o modelo mostrado na Fig. 7 para explicar o duplo papel de Trim28 em desenvolvimento e metástases de cancro do pulmão. Nós supomos que Trim28, através da regulação de várias vias alternativas podem ter tanto supressores de tumor e as actividades oncogénicos bem como a via de sinalização de TGF-β é conhecida por desempenhar um papel complexo tumorigénese. Por um lado, o TGF-β1 regula negativamente ciclo celular e serve como um supressor de tumores em tecidos normais e pré-malignment. Por outro lado, TGF-β, segregado pelas células tumorais, promove a invasão tumoral e metástase [36]. Propomos que Trim28 contribui significativamente para a capacidade de TGF-β para restringir o crescimento celular e para o TGF-β1 para induzir EMT. Estas possibilidades não são mutuamente exclusivas e esta rede pode ser ainda mais complexo quando as fases e tipos de câncer são considerados. Como mostrado na Figura 7, em tecidos normais e cancros da fase inicial, Trim28 é responsável pela regulação do ciclo celular através de factores de transcrição E2F e HDAC; Portanto, Trim28 mostra uma função anti-proliferativa e actua como um supressor de tumor. No estágio ou metastáticos cancros tarde, de alto nível de Trim28 contribuir para EMT através da regulação da transcrição de genes epiteliais e mesenquimais, como resultado, as células com elevado nível de Trim28 tendem a ter uma natureza mais invasivo e metastático. Este modelo é apoiado por relatos na literatura [13], [24] e as nossas conclusões [9]. Nossos resultados podem lançar luz para compreender o duplo papel de sinalização TGF-β em tumores.

Este modelo explica este trabalho e nosso trabalho anterior demonstrando um papel supressor de tumor para Trim28 [9].

Informações de Apoio

Figura S1. deficiência

Trim28 reduz a expressão de N -cadherin.

C

ontrol e células A549 knockdown Trim28 foram coradas (conforme descrito em “Procedimentos Experimentais”) e examinadas através de microscopia confocal de imunofluorescência, como segue: N-caderina (verde, painel superior), β-tubulina (verde, painel inferior) e DAPI (azul). imagens fundidas estão na parte inferior

doi:. 10.1371 /journal.pone.0101040.s001

(TIF)

Figura S2.

Trim28 correlação negativa expressão show com caderina E e correlação positiva com a expressão de N-caderina em uma série de linhas pequenas não cancro do pulmão de células. A, os lisados ​​de células inteiras foram submetidas a transferência de Western utilizando os anticorpos indicados. B, intensidades de banda foram quantificados e representados graficamente numa escala logarítmica. Correlações não são estatisticamente significativos

doi:. 10.1371 /journal.pone.0101040.s002

(TIF)