Abstract

Fundo

O objetivo deste estudo foi avaliar a atividade dos inibidores seletivos de Exportação Nuclear (SINE) compostos que inibem a função da proteína exportação nuclear exportina 1 (XPO1 /CRM1) contra linhas de células tumorais caninas e realizar uma Fase I de ensaios clínicos de KPT-335 em cães com câncer espontânea para fornecer uma avaliação preliminar da atividade biológica e tolerabilidade.

métodos e resultados

linhas caninos de células tumorais derivadas de linfoma não-Hodgkin (NHL), tumor de mastócitos, melanoma e inibição do crescimento osteossarcoma expostos e apoptose em resposta a concentrações nanomolares de compostos SINE; células NHL foram particularmente sensível com IC

50 concentrações que variam de 2-42 nM. A Fase I de ensaios clínicos de KPT-335 foi realizada em 17 cães com NHL (ingênuo ou recorrente), tumor de mastócitos ou osteossarcoma. A dose máxima tolerada foi de 1,75 mg /kg administrada por via oral, duas vezes /semana (de segunda /quinta-feira) embora a actividade biológica foi observada a 1 mg /kg. O benefício clínico (CB), incluindo a resposta à terapia parcial (PR, n = 2) e doença estável (SD, n = 7) foi observada em 9/14 cães com NHL com um tempo mediano até à progressão (TTP) para respondedores de 66 dias (intervalo 35-256 dias). Um estudo de expansão dose foi realizado em 6 cães com LNH administrado 1,5 mg /kg KPT-335 Segunda /Quarta /sexta-feira; CB foi observado em 4/6 cães com um TTP mediano para atendentes de 83 dias (intervalo 35-354 dias). Toxicidades foram principalmente gastrointestinal constituído por anorexia, perda de peso, vômitos e diarréia e foram resolvidas com cuidados de suporte, a modulação da dose e administração de baixa dose de prednisona; hepatotoxicidade, anorexia e perda de peso foram a dose limitante toxicidades.

Conclusões

Este estudo fornece evidências de que o romance biodisponível oralmente inibidor XPO1 KPT-335 é segura e exposições atividade em um relevante, grande espontânea modelo animal de câncer. Os dados deste estudo fornece novas informações crítico que estabelece as bases para avaliação dos compostos SINE no câncer humano

Citation:. Londres CA, Bernabe LF, Barnard S, Kisseberth WC, Borgatti A, Henson M, et al. (2014) pré-clínica Avaliação da Novel, biodisponível oralmente inibidor selectivo de Exportação Nuclear (SINE) KPT-335 no espontânea Câncer Canine: Resultados de um estudo de Fase I. PLoS ONE 9 (2): e87585. doi: 10.1371 /journal.pone.0087585

editor: Kristy L. Richards, da Universidade de Carolina do Norte em Chapel Hill, Estados Unidos da América

Recebido: 10 de junho de 2013; Aceito: 28 de dezembro de 2013; Publicação: 04 de fevereiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Londres et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os financiadores (Karyopharm Therapeutics) assistido no desenho do estudo e editaram o manuscrito após a sua preparação. Karyopharm Therapeutics não teve nenhum papel na coleta de dados, análise de dados ou preparação real do próprio manuscrito

Conflito de interesses:. Eu li a política da revista e tem as seguintes conflitos. J S-M, DM, MK, e SS são todos os funcionários da Karyopharm Therapeutics. O trabalho ensaio clínico foi financiado pela terapêutica Karyopharm. CAL recebeu honorários da Karyopharm Therapeutics. Isto não altera a nossa adesão a todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

A troca de proteínas entre o núcleo eo citoplasma é um processo bem regulamentado que envolve várias proteínas responsáveis para transportar a carga dentro e para fora do núcleo. Existem sete proteínas nucleares conhecidos exportação (exportina 1-7) que transportam as macromoléculas a partir do núcleo para o citoplasma [1], [2], [3]. Exportina 1 (XPO1, também chamado Cromossoma proteína Região Manutenção 1 [CRM1]) é um membro da carioferina β família de receptores de transporte que se liga a um conjunto muito variado de cerca de 220 proteínas-alvo através de um sinal de exportação nuclear rica em leucina hidrofóbica (NES) presente na carga [4]. Interação da carga de proteína NES-dirigido com a molécula pequena GTPase Ran leva ao transporte citoplasmática através de um complexo do poro nuclear [5]. XPO1 é o único exportador nuclear de vários supressores de tumor e proteínas reguladoras de crescimento principais (TSP e GRP, incluindo p53, p75, Rb, p21, p27, STAT3, FOXO IkB e entre outros) [6], [7]. Expressão de XPO1 é conhecido por ser sobre-regulada numa variedade de ambas as doenças malignas hematológicas e tumores sólidos e isso correlaciona-se com um mau prognóstico [1], [2], [3], indicando que as alterações no tráfico de núcleo-citoplasma resultando em localização aberrante de proteínas chave pode contribuir para a tumorigénese e potencialmente resistência à terapia.

várias pequenas moléculas inibidoras de XPO1 foram desenvolvidos e testados contra uma variedade de células neoplásicas, principalmente

in vitro

. Estes incluem Leptomycin B, ratjadone, anguinomycin, goniothalamin, entre outros, que se ligam de forma covalente a um resíduo de cisteína reactivo (Cys528) localizada no sulco de ligação de NES XPO1 [1], [2], [3]. Esta ligação funcionalmente inactiva XPO1 de forma irreversível e tem como alvo a proteína para a degradação do proteassoma [8], resultando na restauração da TSP e localização celular GRP e função. Por exemplo, Leptomycin B provoca retenção nuclear da proteína de fusão BCR-ABL1 e induz a apoptose quando co-administrada com imatinib para células CML

in vitro

[9]. Enquanto Leptomycin B apresenta actividade contra várias linhas celulares de cancro

in vitro Comprar e xenotransplante de rato modelos de tumor, induz toxicidade sistémica significativa em ambos os animais e seres humanos, resultando em interrupção do desenvolvimento clínico [10]. Mais recentemente, os análogos de Leptomycin B foram desenvolvidos que demonstram maior potência

in vitro

e

in vivo

com um perfil de toxicidade significativamente reduzida em ratos [11]. No entanto, estes agentes requerem a administração intravenosa, o que limita a frequência da administração da droga.

Recentemente, romance,, biodisponíveis por via oral, pequenas moléculas de droga como inibidor selectivo de exportação nuclear (SINE) compostos que especificamente se ligam a e irreversivelmente XPO1 no local reactivo Cys 528 resíduos têm sido desenvolvidos [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18]. Estes são lentamente reversível com um t

1/2 de cerca de 24 horas, e conduzir a inactivação funcional da proteína XPO1. compostos SINE foram mostrados para induzir a apoptose e a proliferação de bloco em várias linhas celulares de cancro, incluindo aqueles derivados de cólon [6], pâncreas [12], e carcinomas da mama [16], bem como leucemia linfocítica crónica (CLL) [15], enquanto poupadores células normais [19]. Outros estudos têm demonstrado actividade anti câncer potente e boa tolerabilidade do SINE

in vivo

usando o mouse xenoenxerto humano (subcutânea, ortotópico, ou leukemograft) modelos de câncer de pâncreas [12], o câncer renal [20], CLL [15 ], linfoma das células do manto (MCL) [18], mieloma múltiplo [8] e leucemia mielóide aguda (LMA) [17]. Estes dados suportam a noção de que compostos SINE terá atividade biológica em humanos com câncer.

cânceres canina espontâneas apresentam muitas semelhanças clínicas e moleculares para cancros humanos e, como tal, servir como um modelo atraente para estudos pré-clínicos que avaliam o atividade biológica e toxicidades de terapêuticas anti-romance cancro. Tais estudos foram utilizados para validar a actividade dos inibidores multi-alvo do receptor tirosina-quinase (toceranib) [21], [22], os novos agentes quimioterapêuticos (GS-9219) [23], e vários outros inibidores de moléculas pequenas (Ibrutinib, STA -1474) [24], [25]. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos dos compostos SINE em cancros espontâneos caninos. Especificamente, a sua actividade foi avaliada primeira

in vitro

contra linhas celulares de tumores caninos com uma ênfase específica em tumores hematopoiéticas, após o qual um estudo de Fase I do romance SINE KPT-335 foi realizado em cães com osteossarcoma metastático, mastro e tumor de células de linfoma não-Hodgkin (NHL). Estes estudos lançou as bases para a atual fase I de avaliação do composto SINE KPT-330 em seres humanos com câncer e para um estudo potencialmente crucial da KPT-335 para cães com NHL.

Materiais e Métodos recém-diagnosticados ou recaída

tumor primário amostras e Cultura celular

células tumorais criopreservadas obtidos a partir de amostras de biópsia de linfonodo estéril de cães com linfoma de grandes células B difuso (DLBCL) foram cultivadas com 100 ng /mL de megaCD40L (Enzo Ciências da vida, Plymouth Meeting, PA), como descrito anteriormente [26], [27]. A linha celular de leucemia de células T humana, Jurkat, foi a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) e cultivadas em meio RPMI 1640 (Gibco /BRL, Grand Island, NY) contendo soro de bovino fetal a 10% (FBS; Atlas Biologicals, Fort Collins, CO), 2-mercaptoetanol (Gibco /BRL), HEPES, L-glutamina, piruvato de sódio (Mediatech Inc., Manassas, VA), aminoácidos não essenciais (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) , e Primocin (Invivogen, San Diego, CA). A linha celular canina CLBL1 DLBCL obtido do Dr. Barbara Rütgen (Universidade de Viena, Áustria) [28], [29] e linhas de células humanas DLBCL OCI-Ly3 [30], [31] e OCI-Ly10 [32] obtido a partir de Dr. Ana Novak (Mayo Clinic Cancer Center, Rochester, MN) foram cultivadas em meio completo de Iscove Modified de Dulbecco (IMDM) contendo 20% de FBS, L-glutamina, e Primocin. Todas as células foram mantidas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 atmosfera. As seguintes linhas de células tumorais adicionais canino foram usadas para avaliar a resposta a compostos SINE: C2, linha de mastocitoma fornecido pelo Dr. George Caughey, UCSF, San Francisco, CA [33]; OSA16, linha de células de osteossarcoma, fornecido pelo Dr. Jaime Modiano, UM, Minneapolis, MN [34]; e 323610-3, linha celular de melanoma maligno, fornecida pelo Dr. Michael Kent, UCD, Davis, CA [35]. Todas as linhas celulares foram cultivadas em meio RPMI completo contendo 10% de FBS, /antimicóticos, Hepes, piruvato de sódio, aminoácidos não essenciais e antibióticos Glutamax (Gibco suplementos de meios de comunicação).

viabilidade e proliferação Ensaios

a viabilidade celular para linhas linfóides foi determinada pela MTS (3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) -2H-tetrazólio) ensaio utilizando CellTiter 96 AQ ®

ueous Uma solução de Proliferação celular Assay Kit (Promega, Madison, WI). Resumidamente, para as linhas de células linfóides, 5 × 10

4 células (ou 1 × 10

5 DLBCL células primárias) foram cultivadas em 100 ul de meio completo em placas de 96 poços na presença de compostos de seno. Após 72 horas, 20 ul de solução de MTS foi adicionado a cada poço e as células foram incubadas durante mais 4 horas antes da medição da absorvência a 490 nm utilizando um Wallac Victor 1420 Multilabel Counter (Perkin Elmer, Waltham, MA). A IC

50 de SINE foi calculada utilizando o software Prism 6 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA).

Para as linhas celulares não linfóides, placas de 96 poços foram semeadas em triplicado em 90 mL com 2500 células /poço de OSA16, 5000 células /poço de C2, e 2500 células /poço de 323610-3. placas semeadas foram cultivadas durante a noite, em seguida, tratada no dia seguinte com 10 mL de KPT-214 em meio de C10 em concentrações de 0,0001, 0,01, 0,1, 1,0, e 10 fiM. As placas foram recolhidas em 92 horas, centrifugadas a 1300 rpm, e o sobrenadante foi removido invertendo as placas sobre papel absorvente. As placas foram então seladas e imediatamente colocado a -80 ° C durante um mínimo de 12 horas. As placas foram, em seguida, descongeladas e CyQUANT ®Cell Ensaio de Proliferação (Life Technologies) foi realizada seguindo o protocolo do fabricante. Resumidamente, 200 ul da solução de trabalho CyQUANT diluída foi adicionada a cada poço e protegida da luz. A fluorescência foi a medida utilizando um leitor de microplacas SpectraMax M2 a 480 nm de excitação e 520 nm de emissão. Os resultados foram representados como percentagem de controlo, ou plotados para calcular IC

50 valores em 92 horas.

Apoptosis Assay

As células Jurkat e células LDGCB caninas primárias foram cultivadas durante 24 horas na presença de 100 nM KPT-335 ou o dimetilsulfóxido (DMSO). As células foram coradas com anexina V (eBiosciences, San Diego, CA) de acordo com as instruções do fabricante. A citometria de fluxo foi realizada utilizando um fluxo BD LSRII citômetro (Immunocytometry Sistemas de BD, San Jose, CA) e os resultados foram analisados ​​utilizando software FlowJo (árvore da estrela, Ashland, OR).

Immunoblotting

criopreservado células DLBCL canino primária e CLBL1 foram lisadas em tampão RIPA contendo NaCl 150 mM, Tris 50 mM, pH 7,4, 0,1% sulfato de dodecilo e sódio (SDS), 1,0% de Triton X-100, 1,0% desoxicolato de sódio, 5 mM de EDTA, 1 mM ditiotreitol e um cocktail inibidor de proteinase (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). O material insolúvel foi removido por centrifugação, e as concentrações de proteínas dos lisados ​​celulares foram determinadas utilizando o kit de ensaio de proteína BioRad (BioRad, Hercules, CA). As proteínas (100 ug) foram separadas por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) e transferidos para membranas de nitrocelulose (BioRad, Hercules, CA). coloração com anticorpo foi realizada utilizando o SNAP d.i. sistema (Merck Millipore, Billerica, MA) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, a membrana foi bloqueada em 50% LI-COR tampão de bloqueio (LI-COR, Lincoln, NE) e coradas com anticorpo de coelho anti-XPO1 (1:66 diluição, Santa Cruz, Santa Cruz, CA) e anticorpo anti-actina de rato (1:1666 diluição, Sigma-Aldrich), seguido por anticorpo anti-coelho de burro conjugado com IRDye800 secundário e anticorpo anti-rato conjugada com IRDye680 (1:3,333 diluição, LI-COR). A detecção foi realizada utilizando o Sistema de infravermelho Odyssey de imagem (LI-COR).

KPT-335 Formulação

KPT-335 foi preparado na forma de cápsulas de gelatina cheias em dosagens que variam de 2,5 mg a 20 mg de ingrediente farmactico activo (API). O API foi molhado branqueado com Lutrol F68 NF (BASF) e água num Microf micro-fluidificador, combinado com Plasdone K29 /30 (ISP Technologies), e liofilizado. pós liofilizados continha 70-75% de API. As cápsulas foram individualmente mão cheia com pó liofilizado para a força de dosagem desejada. Todos os excipientes foram de graus adequados para utilização em produtos farmacêuticos.

A análise farmacocinética em cães saudáveis ​​

KPT-335 foi administrado como uma dose única por via oral na formulação de cápsula de 6 cães beagle machos, aproximadamente 1,5 mg /kg, após uma refeição. amostras seriadas de sangue foram recolhidos de cada cão antes do doseamento e às 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 18, 24 e 48 horas pós-dosagem e colocadas em tubos contendo K

2EDTA. As amostras de sangue foram armazenadas em gelo húmido até ser transformado ao plasma por centrifugação a 3500 rpm durante 10 minutos a 5 ° C. As amostras de plasma foram armazenadas em a -80 ° C até à análise em Agilux Laboratories (Worcester, MA). As amostras de plasma foram analisadas para a concentração do fármaco pai usando a preparação das amostras por precipitação da proteína e, em seguida, a análise por LC-MS /MS usando o propanolol como o padrão interno. O método foi qualificada para uso (um único lote para avaliar o desempenho do método: precisão e exatidão; linearidade da diluição; e especificidade matriz) antes do início da análise da amostra. Critérios de aceitação para os padrões de calibração e amostras de controle de qualidade estavam dentro concentração nominal ± 30%. os valores dos parâmetros farmacocinéticos de animais individuais foram obtidos por um programa de análise farmacocinética Phoenix versão 6.3 WinNonlin (Pharsight Corporation), utilizando o Modelo 200 não compartimental com ponderação uniforme. Os parâmetros farmacocinéticos de dose única avaliadas incluem: C

max (concentração máxima observada); T

max (tempo da concentração máxima observada); ASC

0 → ∞ (área sob a curva de concentração-tempo desde o tempo zero extrapolado ao infinito); ASC

0 → última (área sob a curva de concentração-tempo desde o tempo zero ao tempo da última concentração quantificável); e t

1/2 (meia-vida terminal). Os dados descritivos estatísticos (média, desvio padrão e erro padrão da média) foram calculados a partir dos números não arredondados em um (Microsoft) planilha Excel. resultados de concentração, meios e parâmetros calculados foram relatados para 3 algarismos significativos.

Ensaios Clínicos Elegibilidade

Este ensaio clínico foi aprovado pela Ohio State University (OSU) Veterinary Medical Center (VMC) Clinical Comité Consultivo da Investigação e da OSU IACUC; aprovação IACUC também foi obtido na Universidade de Minnesota e Texas A M University. consentimento informado por escrito do proprietário de cada cão foi obtida antes da entrada no estudo. KPT-335 foi administrada a cães com osteossarcoma metastático, tumor de mastócitos ou NHL que falharam a terapia convencional ou para os quais não havia alternativas terapêuticas, ou para os quais a terapia convencional não era desejada pelo proprietário. Para serem elegíveis para o estudo, cada cão deve ter sido definitivamente diagnosticados através de citologia ou histopatologia e conheceu todos os critérios de inclusão e nenhum dos critérios de exclusão. Critérios adicionais de elegibilidade incluíram: 1 ano de idade no início do estudo; a função do órgão adequado; pelo menos 2 semanas após a quimioterapia ou radioterapia prévia com recuperação completa das toxicidades agudas destes tratamentos (3 semanas para um procedimento cirúrgico); pelo menos 1 semana desde que o tratamento prévio com qualquer outra droga em investigação; e nenhuma evidência de metástases cerebrais ou qualquer doença sistêmica grave incompatível com o estudo, a critério do investigador.

Design Estudo

Este estudo foi um estudo de Fase I dose de escalada, avaliação de rótulo aberto do segurança e atividade biológica de KPT-335 no cliente possuía cães com neoplasias espontâneas. Avaliação das toxicidades clínicas e a resposta do tumor foi realizada em cada visita. Os cães foram avaliados para toxicidade hematológica e bioquímica a cada 7 dias, com exame de sangue de rotina. A dose inicial de 1 mg /kg por via oral duas vezes por semana (de segunda /quinta ou terça-feira /sexta-feira) baseou-se em dados anteriores a partir de cães normais de laboratório (dados não mostrados) e o escalonamento da dose foi fixada em incrementos de 0,25 mg /kg em grupos de três até limitador de dose de toxicidade (DLT) foi identificada. O DLT foi considerado qualquer grau 3 ou 4 hematológica ou toxicidade não hematológica com base em critérios estabelecidos os VCOG-CTCAE [36]. Além disso, qualquer não-grade crônica 3 ou 4 toxicidades que impedirá significativamente a qualidade de vida (ou seja, letargia, inapetência) foram qualificados como DLTs. progressão ou sinais e sintomas relacionados com a doença definitivamente a doença não foram considerados eventos adversos (AEs). A dose máxima tolerada (MTD) foi considerada como sendo uma dose abaixo daquela a que ocorreu DLT.

Toxicidade Avaliação

Cada paciente foi submetido a uma linha de base história completa, exame físico, e de laboratório pré-dosagem avaliação que incluiu um hemograma completo (CBC), perfil bioquímico sérico, parâmetros de coagulação (PT /PTT) e urinálise. Os pacientes foram avaliados para eventos adversos nos dias 7, 14, 21 e 28, ea cada 2 semanas depois, altura em que todas as avaliações laboratoriais foram repetidos. Estipulações relativas aos requisitos mínimos para continuar hematológicas dosagem foram incluídos no protocolo: hematócrito 25%, os neutrófilos 1500 /G, plaquetas 100000 /L. Além disso, transaminases hepáticas foram obrigados a ser . 4X limite superior do normal com uma bilirrubina e creatinina sérica total de normal a continuar a terapia KPT-335

concomitantes Medicamentos

Para tratar de drogas relacionadas toxicidades gastrointestinais, cuidados de suporte foi administrado como necessária para cães inscritos neste estudo. Este consistiu tipicamente de famotidina, omeprazole, metronidazole, loperamida, metoclopramida, ondansetron, e /ou de maropitant. Os anti-histamínicos foram administradas a cães com tumores de células mastro, uma vez que estes tumores são conhecidos para liberação de histamina. Outros cuidados de suporte administrado a cães consistiu de prednisona e não-esteróides anti-inflamatórios medicamentos para tratar a inflamação associada ao tumor, inapetência, e para o controle da dor.

Tumor Response Assessment

As avaliações do tumor foram concluídas antes da entrada no estudo, e dias 7, 14, 21, e 28. para os cães que prosseguir para além de 4 semanas, as avaliações da resposta foram realizadas a cada 2 semanas, posteriormente, ou na altura da progressão do tumor suspeita. As respostas foram avaliadas pelo investigador de acordo com os critérios do protocolo pré-definido. A resposta em cães com doença avaliável foi realizada através de exame clínico, ultra-sonografia, ou radiografia torácica. Muitas lesões não eram passíveis de imagem radiográfica quantitativa, mas foram seguidos através de exame de série clínica (lesões superficiais; linfonodos palpáveis) ou por ultra-sonografia (gânglios linfáticos abdominais). lesões torácicas foram avaliados por radiografia torácica.

A resposta em cães com doença mensurável foi julgado pelo investigador com base nos Critérios de Avaliação de Resposta para Peripheral Nodal linfoma em cães (v1.0) [37]. Uma resposta completa (RC) foi definida como o desaparecimento de toda a doença em duas medições separadas por um período mínimo de 3 semanas. Uma resposta parcial (PR) foi definida como uma redução superior a 30% na soma do diâmetro maior das lesões alvo documentados por duas avaliações separados por pelo menos 3 semanas. Um aumento de 20% no tamanho de todas as áreas tumorais mensuráveis ​​como medido pela soma dos maiores diâmetros das lesões alvo tomadas como referência a menor soma desde o início do tratamento, ou o aparecimento de uma nova lesão (s) poderia requerer como doença progressiva (DP). Doença estável (SD) foi definida por ausência de critérios de resposta ou um ou progressão; para ser considerada SD, cães deve demonstraram nenhuma evidência de DP na avaliação de 28 dias. Cães que não tinham evidência de progressão do tumor e que não tinham experimentado qualquer toxicidade inaceitável eram elegíveis para ciclos de tratamento prolongados. O aumento da dose de duas vezes por semana a administração a três vezes por semana em administração de cada cão foi permitido se o cão estava tolerando terapia.

Qualidade de Vida

Uma ferramenta para avaliar a qualidade de vida nas cães com câncer durante o tratamento foi publicado anteriormente [38]. Este foi utilizado para avaliar alterações proprietário percebido em cães submetidos a tratamento KPT-335 durante estudos tanto o aumento da dose e da dose de expansão. Uma qualidade geral do (QV) pontuação a vida foi criada com base nas respostas às perguntas sobre o questionário de qualidade de vida. Os escores de cada questão foram somados, resultando em uma qualidade geral de pontuação vida que pode variar de 23 a 115. Tendências da Qualidade de Vida (QV) durante o estudo foram examinadas por meio de modelos lineares mistos contendo os efeitos fixos de tempo e uma estrutura de correlação autoregressive para os erros aleatórios. testes de Wald foram usadas para testar para uma mudança significativa na qualidade de vida, com graus de liberdade calculados pelo método Kenward-Roger [39]. Medidas obtidas após 90 dias não foram incluídos na análise para o estudo o aumento da dose e as medidas após 70 dias não foram incluídos na análise dos dados de expansão da dose devido a alguns pontos de dados após esses momentos.

Resultados

Atividade de SINE compostos contra células tumorais caninas

in vitro

o primeiro avaliou o efeito da KPT-185, que é um dos compostos SINE mais potentes, mas com limitada por via oral a biodisponibilidade e, por conseguinte, apenas adequado para o

in vitro

estudos, em células Jurkat (leucemia de células T humana) e 6 amostras DLBCL caninas primárias (5 tumores distintos com um par do mesmo tumor). KPT-185 inibiu eficazmente a viabilidade das células de Jurkat e DLBCL canina (Figura 1A e da Tabela 1). A IC

50 de KPT-185 contra células Jurkat (n = 3) e amostras DLBCL canino primário (n = 6) foram de 8,7 ± 0,7 nM e 13,3 ± 6,2 nM, respectivamente. KPT185-trans isómero (que tem ~ 100 vezes menos actividade de inibição XPO1 como o cis-isómero), mostraram muito menos toxicidade quando foi testado utilizando células Jurkat e uma das amostras DLBCL caninas primárias (IC

50 1000 nM em ambas as células de tumor). Em seguida, avaliou-se o efeito de KPT-335, um composto candidato clínico com boa exposição oral utilizado neste ensaio clínico, no canino e as células DLBCL humanos. KPT-335 inibiu a viabilidade de OCI-Ly3, OCI-Ly10, e CLBL1 no ic

50 de 2,1 ± 1,3 nM, 41,8 ± 21,0 nM e 8,5 ± 4,1 nM, respectivamente (Figura 1B e Tabela 1). Também demonstramos KPT-335 induziu apoptose em células e células CLBL1 DLBCL caninas primárias utilizando citometria de fluxo. O tratamento de células com KPT-335 durante 24 horas aumentou células apoptóticas (

+ células anexina V) em comparação com as células tratadas zombar (Figura 1C). Finalmente, confirmou-se a expressão de XPO1, que foi detectado por o tamanho estimado de XPO1 (~123 kDa), em células de cão usando a linha de células CLBL1, DLBCL linhas celulares humanas e células primárias DLBCL canina (Figura 1D). Tomados em conjunto, DLBCL tanto humana e canina expressar XPO1 e compostos SINE mostram potente atividade contra estas células tumorais, sugerindo um potencial benefício terapêutico para pacientes humanos e caninos com DLBCL.

As células Jurkat e caninos primária células LDGCB (A) (amostra # 5/1, # 5 foi testado duas vezes de forma independente) foram cultivadas em placas de 96 poços durante 72 horas com diluições em série log de KPT-185 e a viabilidade celular foi analisada utilizando o ensaio de MTS. Cada experiência foi realizada em cavidades em duplicado e as experiências foram repetidas três vezes (B) células DLBCL humana e canina foram cultivadas numa placa de 96 poços durante 72 horas com 3 vezes diluições em série (0-1000 nM) de KPT-335 e analisadas utilizando o ensaio de MTS. Cada experiência foi realizada em cavidades em duplicado e as experiências foram repetidas três vezes. (C) As células CLBL1 e células caninas DLBCL primário (Amostra # 1) foram tratadas com 100 nM KPT-335 durante 24 horas e analisadas quanto à apoptose por citometria de fluxo. As experiências foram realizadas três vezes, independentemente, e os resultados médios são mostrados. (D) A expressão de XPO1 em linhas de células LDGCB humanos e caninos. Os lisados ​​de proteína preparado a partir de OCI-Ly3, OCI-Ly10, e CLBL1 foram separadas por SDS-PAGE e sujeito a imunotransf erência para XPO1; β-actina serviu como controle.

Para fornecer uma avaliação preliminar da atividade potencial de antagonistas SINE XPO1 contra cancros caninos adicionais, a linha de tumor de células C2 mastro, a linha de células OSA16 osteosarcoma , e a linha de células de melanoma foram utilizados 323610-3. Para estes estudos um análogo anteriormente, KPT-214, estavam disponíveis para as experiências in vitro (Figura 2). O IC

50 de KPT-214 contra o C2, OSA16 e 323610 foram 490 nM, 89 nM e 70 nM, respectivamente. Em resumo, o SINE exibem actividade biológica

In vitro

contra uma ampla variedade de linhas celulares tumorais caninas, com linhas linfóides, sendo o mais sensível na gama nanomolar baixa. Estes dados apoiaram a subsequente

in vivo

avaliação do SINE em cães com cancros espontâneos, com uma ênfase particular em cães NHL

.

linhas de células tumorais Canine C2 (mastócitos), OSA16 (osteossarcoma) 323610-3 e foram cultivadas em placas de 96 cavidades, em triplicado, com diluições em série de KPT-214 durante 92 horas, após o que foram recolhidos das placas, meios removida, e as placas foram congeladas a -80 ° C. Análise para efeitos na proliferação das células foi então realizada utilizando o ensaio de CyQUANT de acordo com as especificações do fabricante. As experiências foram repetidas três vezes; o IC

50 para cada linha de células é mostrado.

Farmacocinética de KPT-335 em cães saudáveis ​​

Para avaliar a farmacocinética de KPT-335, seis cães beagle saudáveis ​​foram administrada uma dose única de droga a 1,5 mg /kg depois de ser alimentados com uma refeição. As amostras de sangue foram obtidas ao longo de um período de tempo de 48 horas e analisadas por plasma KPT-335 concentrações. Os resultados são apresentados na Tabela 2. A média T

max foi de cerca de 4 horas com um C

max de cerca de 250 ng /ml e uma AUC média de 1800 ng /ml.

o aumento da dose estudo

demografia dos doentes.

a demografia dos doentes e tipos de tumores estão listados na Tabela 3. Um total de 17 cães foram inscritos para a parte de aumento da dose do estudo. A idade média foi de 7,5 anos eo peso médio foi de 35 kg. A maioria dos cães tinha inscrito NHL (n = 14), e a maioria (n = 12) também tinha recebido terapêutica prévia, incluindo cirurgia, quimioterapia e /ou prednisona. Prednisona foi administrada a 10 cães durante o curso do tratamento KPT-335 a 0,5 mg /kg, uma vez por dia ou em dias alternados; em 8/10 casos, os cães foram incluídos no estudo depois de ter progressão da doença experiente na cara de terapia com prednisona e, consequentemente, o fármaco não foi interrompida. Os dois animais restantes foram colocados em prednisona após os primeiros 28 dias de tratamento para tratar inapetência /anorexia associada com o tratamento. Estes cães receberam prednisona 0,5 mg /kg a cada dois dias para a duração do tratamento com KPT-335.

toxicidades clínicas e dose máxima tolerada.

Para todos os cães inscritos no dose de escalada da porção do estudo, as toxicidades clínicas primárias consistiram principalmente de grau 1 e 2 eventos gastrointestinais incluindo anorexia, vómitos e diarreia, assim como letargia (resumidos nas Tabelas 4 e 5). O MTD foi estabelecido como 1,75 mg /kg administrada duas vezes por semana (segunda /quinta-feira). Todos os três cães no 2 mg /coorte kg experimentaram DLT incluindo grau 3 anorexia (n = 2), de grau 3 vómitos (n = 1), diarreia de grau 3 (n = 1), grau 3 elevação ALT (n = 2), grau 3 AST (n = 1), e o grau de elevação 3 ALP (n = 1). Portanto, o perfil de efeitos adversos de KPT-335 foi limitado principalmente ao trato gastrointestinal e hepatotoxicidade clinicamente relevante foi observado principalmente em doses acima do MTD.

Em 4 casos, os cães que estavam no droga por mais de 4 semanas tiveram uma mudança no regime de duas vezes por semana para três vezes por semana (segunda /quarta /sexta-feira) como droga foi bem tolerada e os cães estavam experimentando doença estável. Isto ocorreu em um cão receber 1 mg /kg, dois cães que receberam 1,25 mg /kg, e um cão recebendo 1,5 mg /kg. Elas permaneceram nesta aumentada regime de frequência de dosagem para a duração da terapia (mediana de 68,5 dias), sem qualquer aumento na toxicidade clínica. Em 4 casos foram feitas modificações da dose para os cães que experimentaram eventos adversos. Duas delas ocorreu em cães que receberam a droga de 2 mg /kg e de grau 3 eventos adversos experientes; Em ambos os casos, a dose foi reduzida para 1,5 mg /kg, duas vezes por semana. Nos outros dois casos, um cão foi reduzida de 1,75 mg /kg a 1,5 mg /kg, em seguida, 1,25 mg /kg devido a problemas com a anorexia contínua, e o outro cão foi reduzida de 1,5 mg /kg a 1,25 mg /kg, também devido à anorexia. Este último paciente permaneceu em terapia para 246 dias.

A resposta à terapia.

O TTP mediana para todos os cães foi de 35 dias (intervalo 14-246 dias). Um total de 7 cães experimentado PD nas primeiras 4 semanas de tratamento.