Abstract

CDA-2 (célula agente de diferenciação 2), uma preparação urinária, tem proliferativa anti potente e propriedades pró-apoptóticos em células cancerosas. No entanto, os mecanismos de acção inibidora de tumor de CDA-2 estão longe de ser evidente e, especialmente, não houve relato de cancro do pulmão. Aqui demonstramos que a CDA-2 e o seu principal componente fenilacetilglutamina (PG) reduzir o crescimento do tumor metastático do pulmão, e aumenta o tempo de sobrevivência após a inoculação com células de carcinoma do pulmão de Lewis (LLC) de uma forma dependente da dose em ratinhos C57BL6. análise programa proliferativo em células de cancro revelou um impacto fundamental de CDA-2 e PG na proliferação e apoptose, incluindo Bcl-2, Bcl-XL, cIAP1, Survivina, PCNA, Ki-67 proteínas e ensaios de TUNEL. CDA-2 e PG significativamente reduzida actividade de NF-kB de ligação ao ADN em células de cancro do pulmão e nos macrófagos alveolares de ratinhos portadores de tumores e, especialmente, diminuiu a libertação de factores inflamatórios, incluindo TNFa, IL-6, e KC. Além disso, CDA-2 e PG diminuir as expressões de TLR2, TLR6, e CD14, mas não TLR1, TLR3, TLR4 e TLR9 em macrófagos osso derivadas de medula (BMDM) de ratos estimulados por meio LLC condicionado (LLC-CM ). Sobre-expressam TLR2 em BMDM impedido CDA-2 e PG a partir de inibição da activação do NF-kB, bem como a indução de TNFa e IL-6. TLR2: TLR6 complexos de mediar o efeito de NF-kB por inactivação CDA-2. Em conclusão, a CDA-2 inibe potentemente o desenvolvimento de tumores do pulmão pela redução da inflamação no pulmão através da supressão da activação do NF-kB em células mielóides, associar-se com a modulação de sinalização de TLR2

citação:. Wang X, Jiang CM, wan HY, Wu JL, Quan WQ, Bals R, et al. (2012) CDA-2, uma preparação urinária, inibe o desenvolvimento do cancro do pulmão através da supressão do NF-kappaB Activation em células mielóides. PLoS ONE 7 (12): e52117. doi: 10.1371 /journal.pone.0052117

editor: Hiroshi Shiku, Mie University Graduate School of Medicine, Japão

Recebido: 26 Abril de 2012; Aceito: 09 de novembro de 2012; Publicação: 17 de dezembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa da Comissão de Ciência e Tecnologia de Putuo District, Shanghai (PTKW09-B02). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é a principal causa de mortes por câncer no mundo, causando mais de um milhão de mortes em todo o mundo [1]. Apesar dos avanços na detecção precoce e tratamento padrão, o cancro do pulmão é muitas vezes diagnosticada em fase avançada e tem um prognóstico pobre. Portanto, a prevenção e tratamento de câncer de pulmão são o foco de intensa investigação actual [2].

CDA-2 (agente de diferenciação celular 2) é uma preparação urinário que isolado da urina humana saudável na China. É uma nova droga multifuncional que é útil para a prevenção e tratamento de vários tumores, incluindo leucemia, cancro da mama, cancro do fígado, e feocromocitoma, em investigações pré-clínicos [3] – [5]. No entanto, os mecanismos de acção inibidora de tumor de CDA-2 estão longe de ser evidente e, especialmente, não houve relato de cancro do pulmão. CDA-2 contém vários componentes activos, incluindo fenilacetilglutamina (PG) (41%), glycocoll de benzoílo (35%), péptidos (PM 400-2800) (17%), 4-OH-ácido fenilacético (6%), e 5 ácido -OH-indolacético (1%), o qual com diferentes mecanismos de anticancerígeno [5]. Embora a inibição do tumor pode ser atribuída a estes componentes, PG é provável que seja uma componente importante inibidora tumoral [3]. Fase I /II /III de ensaios clínicos de CDA-2 foram concluídos na China em 2003. Em agosto de 2004, a Administração Estatal de Drogas (SDA) da China aprovou o uso do CDA-2 como uma droga anticâncer em tumores sólidos. Embora CDA-2 foi sugerida para contribuir para a inibição de tumores por meio da sobre-regulação de peroxissoma receptor-γ activado por proliferador (PPAR-γ) e repressão de PI3 /Akt em células tumorais de sinalização, o efeito de inibição de tumores de CDA-2 foi até agora demonstrado principalmente em células cancerosas e sua ação no microambiente do tumor, especialmente para as células imunitárias /inflamatórias no estroma tumoral, não foi avaliado criticamente [6], [7].

NF-kB é uma chave coordenador de resposta inflamatória e imunitária e foi recentemente encontrada para um papel crucial na carcinogénese de um certo número de cancros de pulmão, incluindo carcinoma do cólon ou [8], [9]. É digno de nota que as citoquinas pró-inflamatórias e as quimiocinas têm sido associados a processos cancerígenos em seres humanos e ratinhos, e são regulados pela via de NF-kB. Por exemplo, o NF-kB-impulsionado a produção de citoquinas por células mielóides (por exemplo, macrófagos, células dendríticas maduras, e neutrófilos), tais como TNF-α e IL-6 são necessários para o crescimento do tumor do pulmão [9]. Num modelo de ratinho de cancro associado a colite (CAC), IKKβ foi suprimido em células mielóides (levando a uma diminuição da actividade de NF-kB), o tamanho do tumor foi consideravelmente menor em comparação com controlos e expressão de citoquinas pró-inflamatórias, tais como TNFa, IL -6 e IL-1, também foi acentuadamente reduzido [10]. Assim, em células mielóides, a activação de NF-kB promove o crescimento do tumor. Este efeito deve-se principalmente a proliferação de células de tumor melhorada através da produção de TNFa, IL-6, e outras citoquinas que são regulados pela via de NF-kB em células mielóides [10], [11].

Aqui , relatamos nosso trabalho recente sobre a supressão do tumor e os mecanismos moleculares da CDA-2 e seu principal constituinte, PG, ao câncer de pulmão. Utilizou-se modelos experimentais de cancro do pulmão de murino em que CDA-2 e PG reduz o crescimento do tumor de pulmão, e demonstraram que a inactivação do NF-kB em células mielóides é responsável pela regressão tumoral induzida CDA-2. Verificou-se que a inibição da sinalização de TLR-2 é um mecanismo-chave de induzida por CDA-2 inactivação de NF-kB. Nossos resultados sugerem uma nova teoria para a terapia de cancro por CDA-2, com base na inibição da NF-kB em células mielóides de microambientes tumorais.

Materiais e Métodos

Cultura de Células

o carcinoma de Lewis do pulmão do rato (LLC), as células foram obtidas a partir da American Type Culture Collection e cultivadas em meio de Eagles modificado de Dulbecco (DMEM, laboratórios Hyclone. Inc, sul, Utah, EUA) suplementado com soro de vitelo fetal a 10% (FCS) (Invitrogen, Grand Island, NY, EUA), 100 U /mL de penicilina e 100 U /mL de estreptomicina (laboratórios Hyclone. Inc, Sul, Utah, EUA). As culturas de células foram realizadas a 37 ° C em ar humidificado com 5% de CO

2.

Animais

fêmea C57BL /6 foram obtidos a partir do National Resource animal Rodent Laboratory (Xangai ramo , RPC) e mantida sob uma isento de agentes patogénicos Facilidade Central animal da Universidade de Tongji. Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações das Diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade Tongji sobre o Uso e tratamento dos animais.

Todos cirurgia foi realizada sob anestesia pentobarbital de sódio, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.

Geração do pulmão modelo câncer em camundongos e Tratamento do CDA-2 e PG

Um modelo de metástase de câncer de pulmão em camundongos C57BL /6 foi gerado por injecção intravenosa de células LLC. Resumidamente, subconfluentes de células LLC ou de células A549 foram colhidos e passados ​​através de um 40 um filtro celular (BD Biosciences, Bedford, MA, EUA), lavou-se três vezes com PBS, ressuspensas em meio DMEM isento de soro e injectados a uma concentração de 2 x 10

5 células por ratinho LLC na veia da cauda. After14 dias, os ratinhos foram injectados intraperitonealmente (ip) com 500 mg /kg, 1,000 mg /kg e 2000 mg /kg CDA-2 (gentilmente fornecido por vida sempre Pharmaceutical Co. Ltd. Hefei, Anhui, China) ou 200 mg /kg, 400 mg /kg, e 800 mg /kg de PG (Sigma Aldrich, Steinheim, Alemanha) em PBS ou PBS por si só uma vez por dia durante 10 dias.

Avaliação de tumores do pulmão

designada os pontos de tempo, os ratinhos foram mortos, e os seus pulmões foram removidos, pesados ​​e examinados histologicamente. Alguns ratos foram mantidos até a obtenção de dados de mortalidade e de sobrevivência. nódulos tumorais pulmonares foram microdissectados usando uma agulha G 18 sob um microscópio para análise de proteínas. a multiplicidade de tumores e tamanhos máximos foram determinantes como descrito [9]. Resumidamente, os pulmões inteiros portadores de tumor foram insuflado manualmente com e fixados em paraformaldeído a 4% e embebidos. pulmões embebidos em parafina foram seccionados em 350 mm e histologicamente examinadas com hematoxilina e eosina (H E).

Análises de imuno-histoquímica

A imuno-histoquímica foi realizada como descrito anteriormente [12]. De ratinho anti-Ki-67 (Abcam, Cambridge, Reino Unido) foi usado como anticorpo primário. incubação do anticorpo secundário e a coloração foram efectuadas utilizando o kit enVision® + System-HRP (AEC) (Dako, Carpinteria, CA, EUA) de acordo com as recomendações do fabricante. Para o ensaio de TUNEL, um sistema de TUNEL ™ Colorimétrico deadend (Promega) foi utilizado de acordo com as recomendações do fabricante. O número de Ki-67 ou TUNEL positivos células tumorais e as células totais número do tumor foi medido em seis campos microscópicos de tumores seleccionados aleatoriamente e, em seguida, o valor da média foi calculada como a percentagem da Ki-67 ou células de tumor de TUNEL positivos.

Western Blotting

Lung nódulos tumorais foram cuidadosamente microdissectados usando um 18 G agulha da pulmões sob um microscópio. Para o isolamento de proteína total, 10 mg do nódulo de tumor foram homogeneizadas no tampão 500 ul de lise celular (Cell Signaling Tecnologia, Danvers, MA, EUA) contendo PMSF 5 mM e inibidores de protease, utilizando rotor-estator homogeneizador. A análise por Western blot foi realizada tal como descrito anteriormente [13]. Resumidamente, extratos de proteína total foram carregados em géis de 10% SDS-poliacrilamida, submetido a electroforese, e transferidas para membranas Hybond C extra-(Amersham Bioscience, Buckinghamshire, Reino Unido). Os anticorpos primários incluíram: de ratinho anti-Bcl-XL, de ratinho anti-Bcl-2 (ambos a partir de Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA); de ratinho anti-PCNA, anti-coelho cIAP1, de coelho anti-Survivina (a partir de todos os três Abcam, Cambridge, Reino Unido); de ratinho anti-β-actina (Sigma Aldrich, Steinheim, Alemanha). Conjugado com HRP de cabra anti-coelho (Santa Cruz Biotechnology) ou de coelho anti-rato foram utilizados como anticorpo secundário (Dako, Glostrup, Dinamarca).

lavado broncoalveolar (LBA), a contagem de leucócitos e macrófagos alveolares Isolamento

BALF foi determinada como descrito anteriormente [14]. Percentagens de subpopulações de leucócitos foram determinados pela contagem de 100 leucócitos em uma parte selecionada aleatoriamente da lâmina de citocentrifugação. O número total de leucócitos no LBA foi determinado usando um hemocitómetro (Beckman Coulter, Miami, FL, EUA). macrófagos alveolares foram isolados por EMSA como descrito anteriormente [15]. Resumidamente, o BALF foi semente em DMEM e mantidas no prato de cultura de células. As células foram incubadas a 37 ° C em ar humidificado com 5% de CO2 durante 1 hora. O prato foi então lavada 3 vezes com PBS, e as células aderentes, predominantemente macrófagos, foram recolhidos para extracto de proteínas nucleares.

Deslocamento Electrophoretic Mobility Assay (EMSA)

As proteínas nucleares foram isolados a partir de pulmão tumores e macrófagos alveolares utilizando o kit de extracto nuclear (Activo Motif, Carlsbad, CA, EUA) e actividade de ligação a ADN de NF-kB foi medida por EMSA como descrito [13]. Resumidamente, as proteínas nucleares foram incubadas com [

32p] marcado com sonda de consenso NF-kB de cadeia dupla (Promega), à temperatura ambiente durante 30 min. complexos DNA-proteína foram resolvidos em géis de poliacrilamida 4% equilibrada em 0,5 x TBE sob 300V. Os géis foram secos e expostos a Hyperfilm ECL (Amersham Bioscience) a -80 ° C e desenvolvido usando filme Kodak (Eastman Kodak, Rochester, NY, EUA).

Citocinas ELISA Ensaio

amostras BALF foram preparadas como descrito acima. TNFa, IL-6, e KC foram medidos por disponível comercialmente do tipo sanduíche de ELISA (R D Systems, Minneapolis, MN, EUA), seguindo o fabrica ‘instruções

Mouse Bone Marrow-macrófagos derivados (BMDMs. ) Isolamento e luciferase Reporter Assay

as células da medula óssea de ratos C57BL6 foram cultivadas em meio DMEMs (10% FCS) suplementado com 10 ng /ml de ratinho recombinante de M-CSF (eBioscience, San Diego, CA, EUA ) durante 7 dias para permitir a diferenciação para macrófagos. construções adenovirais que codificam o comprimento total do ADNc de TLR2 foram criadas utilizando o sistema de AdEasy como descrito anteriormente [16], [17]. O NF-kB adenovírus luciferase plasmídeo PNF-kB-Leu (BD Clontech) contendo múltiplas cópias da sequência de consenso NF-kB para monitorizar a activação de NF-kB. BMDMs (1 × 10

5 por cavidade de placas de 12 poços) foram infectadas com os plasmídeos adenovirais TLR2 e plasmídeos de controlo, depois de 5 horas, as células foram infectadas de novo com luciferase do plasmídeo de adenovírus PNF-kB-Leu. Seguido por 24 horas de incubação, as células infectadas foram estimuladas durante 24 horas com LLC-CM ou /e CDA-2, e, em seguida, foram lisadas e a actividade do gene repórter de luciferase foi determinada pelo ensaio de repórter de luciferase (Promega, Madison, WI, EUA) .

LLC condicionado

médio

O meio condicionado foi colhido a partir de células LLC incubadas em DMEM isento de soro (SFM) por 24 h, e filtrada através de um filtro de 0,2 um. amostras de meio condicionado foram adicionados a BMDMs durante 24 h, após as quais genes TLRs expressão foram ensaiadas.

Isolamento RNA e PCR em tempo real

tecido pulmonar total e BMDMs RNA foram preparadas com RNeasy além de mini kit (Qiagen, Santa Clarita, CA, EUA) de acordo com a recomendação do fabricante. tempo real misturas reaccionais de PCR foram descritos anteriormente [18]. Resumidamente, o ADNc foi sintetizado por reacção de transcrição reversa utilizando o estojo de síntese de primeira cadeia de ADNc (Invitrogen). PCR em tempo real foi realizado utilizando o QPCR SYBR Green Mix (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) em tempo real de uma máquina de PCR sistema AB 7300 (AB Applied Biosystems, Singapura). Foram utilizados os seguintes iniciadores de PCR: rato β-actina, 5′- AGCCTCGCCTTTGCCGA-3 ‘e 5′-CTGGTGCCTGGGGCG-3′; Il1β rato, 5’-CAACCAACAAGTGATATTCTCCATG-3 ‘e 5′-GATCCACACTC TCCAGCTGCA-3′; rato IL6, 5’-CCGGAGAGGAGACTTCACAG-3 ‘e 5′-TCC ACGATTTCCCAGAGAAC-3′; TNFa de ratinho, 5’-AGCCCCCAGTCTGTATCCTT-3 ‘e 5′-CTCCCTTTGCAGAACTCAGG-3′; Kc rato, 5’-CTTGGGGACACCTTT TAGCA-3 ‘e 5′-GCTGGGATTCACCTCAAGAA-3′; rato MIP1, 5’-TGGAG CTGACACCCCGAC-3 ‘e 5′-ACGATGAATTGGCGTGGAA-3′; rato MCP1, 5’-GCAGGTCCCTGTCATGCTTC-3 ‘e 5′-TCCAGCCTACTCATTGGGATCA-3′; rato TLR2, 5’-TGGTGTCTGGAGTCTGCTGTG -3 ‘e 5′-CGCTCCGTACGAA GTTCTCAG -3′; TLR6, 5’-CAACTTAACGATAACTGAGAG -3 ‘e 5′-CCAGAG AGGACATATTCTTAG -3′; CD14, 5’- ACA TCT TGAACC TCC GCA AC-3 ‘e 5’AGGGTTCCTATCCAGCCTGT -3’. Especificidade de RT-PCR foi controlado por ” sem transcrição reversa ” controlos e análise da curva de fusão. Os resultados da PCR quantitativas foram obtidas usando o método ΔΔCT (limiar de ciclo). Os dados foram normalizados para p-actina níveis em cada amostra.

Análise Estatística

Os valores são apresentados como média mais ou menos SEM. As comparações entre os grupos foram analisadas pelo teste t (frente e verso) ou ANOVA para experimentos com mais de dois subgrupos ou análise de sobrevivência de Kaplan-Meier. Os resultados foram considerados estatisticamente significativos para valores de p inferior a 0,05.

resultados

CDA-2 diminui Lung crescimento de tumores em ratos Tumor Models

Para investigar o efeito da CDA-2 e o seu principal componente PG no crescimento de tumor de pulmão, os tumores foram gerados por injecção intravenosa de 2 x 10

5 células LLC em ratinhos C57BL6. After14 dias, os ratinhos foram injectados intraperitonealmente (ip) com 500 mg /kg, 1,000 mg /kg e 2000 mg /kg CDA-2 ou 200 mg /kg, 400 mg /kg, e 800 mg /kg de PG em PBS ou PBS só uma vez por dia durante 10 dias. Os ratinhos foram sacrificados, e a sua multiplicidade de tumores e os tamanhos do tumor máximas de tumores de pulmão foram avaliados. Em contraste com o controlo, a administração de CDA-2 aos ratos reduziu significativamente a multiplicidade de tumores do pulmão e os tamanhos do tumor máxima (Fig. 1A, B). H E confirmou a coloração massiva redução da carga tumoral em ratinhos tratados com 2-CDA. (Fig. 1A). Existem também diferenças significativas na carga de tumor de pulmão após administração de diferentes doses CDA-2, indicando CDA-2 inibiu o crescimento do tumor metastático de um modo dependente da dose (Fig. 1A, B). Da mesma forma, a PG também teve um efeito inibidor significativo sobre o crescimento metastático do tumor de pulmão, como revelado pelo exame macroscópica e microscópica (Fig. 2A, B). Também foram avaliadas as tempos de sobrevivência de ratos tumorais injetadas que foram tratados com CDA-2 por análise de sobrevivência de Kaplan-Meier. tempos de sobrevivência Ratos foram avaliadas e mostrou que a expectativa de vida de ratinhos portadores de tumor foram prolongados quando dada concentração diferente de CDA-2 do tratamento (Fig. 1C). Há também uma diferença significativa na taxa de sobrevivência de ratinhos portadores de tumor tratados com CDA-2 concentrações diferentes (Fig. 1C). Estes resultados confirmam os obtidos examinando a multiplicidade de tumores, os tamanhos do tumor máximas, H E de coloração de modelos de carcinomas metastáticos do pulmão

(a) Aspecto pulmonar (acima) e histologia. (H E mancha; abaixo) na LLC inoculado C57 /BL6 ratinhos 10 dias após tratamento CDA-2 com as doses indicadas. 2 × 10

5 células LLC foram injectados intravenosamente em sexo correspondentes ratinhos C57 /BL6 de veia da cauda, ​​14 dias mais tarde, os ratos foram tratados com PBS ou CDA-2 durante 10 dias, no dia 25, os pulmões foram removidos. tamanhos (B) a multiplicidade tumoral pulmão e tumor máxima foi determinada por cortes seriados em 350 mm intervalos. Os resultados são a média ± SEM, n = 5, diferença significativa, * p 0,05. (C) As curvas de sobrevida de ratos (p 0,001; teste log-rank para análise estatística; n = 10).

(A) aparência Lung (para cima) e histologia (H mancha E; para baixo) em ratinhos inoculados LLC C57 /BL6 10 dias após o tratamento com doses indicadas PG. 2 × 10

5 células LLC foram injectados por via intravenosa em sexo correspondentes ratinhos C57 /BL6 de veia da cauda, ​​14 dias mais tarde, os ratos foram tratados com PBS ou PG durante 10 dias, no dia 25, os pulmões foram removidos. a multiplicidade de tumores (B) e os tamanhos do tumor pulmonar máximas foram determinados tal como na Figura 1B. Os resultados são a média ± SEM, n = 5, diferença significativa, * p . 0,05

CDA-2 reduziu a proliferação e induziu apoptose em células de câncer pulmonar

Em seguida, para investigar se CDA-2 induzida por alteração da carga de tumor de pulmão era devido à proliferação celular alterada ou apoptose, examinámos a proliferação celular por meio de análise imuno-histoquímica de Ki-67 e células de apoptose por no terminal-transferase rotulagem final entalhe mediada-dUTP in situ (TUNEL) ensaio. 2 × 10

5 células LLC foram injectadas em ratinhos e 14 dias mais tarde 2,000 mg /kg CDA-2, 800 mg /kg de PG ou PBS foram administrados como anteriormente durante 5 dias. Consistente com as mudanças na carga de tumor de pulmão, células de Ki-67-positivas foram menores em CDA-2 ou PG-tumores tratados, em comparação com os tumores de animais tratados com PBS (Fig. 3A). Por outro lado, a apoptose foi significativamente regulada positivamente após tratamento CDA-2 ou PG, enquanto que muito pouca apoptose foi observada após tratamento PBS (Fig. 3B).

(A) ratinhos portadores de tumores foram tratados com 2000 mg /kg CDA- 2 ou 800 mg /kg durante 5 dias PG, e pulmões foram removidos, fixados e embebido em parafina. secções de pulmão portador de tumor embebidas em parafina foram examinados por imunocoloração com anti-Ki-67-anticorpos para detectar células em proliferação. Barra = 100 um. Os resultados são médias ± SEM, n = 5, diferença significativa, * p 0,05. células (B) apoptóticas foram identificados por coloração TUNEL. Barra = 200 um. tumores (C) excisadas de pulmão foram analisados ​​para a expressão de proteínas proliferativas e apoptóticos indicados por análise de imunotransferência. A expressão de β-actina foi utilizada como controlo interno para a quantidade de proteínas.

Examinámos algumas proteínas e genes conhecidos por estarem envolvidos na proliferação celular e apoptose. Os tumores foram cuidadosamente microdissecados usando agulhas de pulmões, lisadas e examinadas por imunotransferência. Em contraste com o grupo de tratamento com PBS, a expressão das proteínas anti-apoptóticas Bcl-2, Bcl-XL, cIAP1, e survivina foram fortemente reduzidos em resposta à CDA-2 do tratamento (Fig. 3C). tratamento CDA-2 também diminuiu a expressão de proliferação de antigénio nuclear celular (PCNA), outro marcador de fase S do ciclo celular (Fig. 3C). A análise de imunotransferência de lisados ​​de tumor de ratos também revelaram a regulação negativa da proteína Bcl-2, Bcl-XL, cIAP1, e Survivina, bem como PCNA em tumores pulmonares após o tratamento PG (Fig. 3C). Estes resultados são consistentes com os observados através da análise de Ki-67 e TUNEL.

CDA-2 inibe a NF-kB ativação e pulmonar inflamação no pulmão de ratos

Tem sido demonstrado que a NF -κB activação desempenha um papel central na regulação da resposta inflamatória e imunitária, apoptose, e oncogénese que está associada com a inflamação de promoção do crescimento tumoral [19], [20]. Para elucidar os mecanismos de efeito de inibição de tumores de CDA-2, que em primeiro lugar em relação a activação do NF-kB de cancro dissecados a partir de ratinhos com CDA-2, PG ou tratamento de PBS. De nota, tecido ressecado contido tecido tumoral, incluindo células inflamatórias do tumor e. extractos nucleares foram preparados e ativação de NF-kB examinado por EMSA. Como mostrado na Fig. 4A, o tratamento CDA-2 diminuiu significativamente a actividade de ligação de NF-kB de ADN em comparação com o controlo após 5 dias de 2,000 mg /kg CDA-2 de tratamento. Importante, a actividade de ligação do ADN de NF-kB também foram fortemente inibida em resposta ao tratamento CDA-2 em macrófagos alveolares de fluido de lavagem broncoalveolar (LBA) (Fig. 4B). Em seguida, o tratamento com 800 mg /kg de PG por 5 dias em ratinhos portadores de tumor também inibiu eficazmente a ADN de NF-kB tanto na actividade de ligação a células tumorais e macrófagos alveolares (Fig. 4C). Este resultado sugere que PG tem efeito semelhante na inibição da activação do NF-kB.

EMSA de extractos nucleares a partir de células tumorais isoladas e macrófagos alveolares mostrando a ligação nuclear de NF-kB depois de 5 dias de 2,000 mg /kg de 2-CDA (A e B) ou PG tratamento kg 800 mg /(C). número total de células e população de leucócitos no LBA recolhidos a partir de ratinhos C57BL6 3 ou 5 dias de 2,000 mg /kg CDA-2 (d) e 800 mg /kg de PG (E) ou o tratamento de PBS. composição celular foi determinada utilizando preparações de Cytospin. Os resultados são médias ± SEM, n = 5, diferença significativa, * p . 0,05

Em seguida, foi perguntado se a inactivação induzida CDA-2 de NF-kB em células mielóides muda a situação inflamatória nos pulmões. Nós caracterizado células inflamatórias e mediadores em pulmões de ratos submetidos a ratos modelo de cancro. número total de células e os números absolutos de macrófagos, neutrófilos, e linfócitos no BALF diminuíram significativamente de 3 e 5 dias após a 2000 mg /kg CDA-2 do tratamento (Fig. 4D) ou 5 dias após 800 mg /kg Tratamento PG (Fig. 4E ). CDA-2 ou PG tratamento reduziu eficazmente a expressão de diversas citocinas e quimiocinas mRNAs inflamatórias, tais como IL1B, IL6, Kc, TNFa, Mip1α, e MCP1 no pulmão (Fig. 5A, B). CDA-2 ou PG tratamento também uma diminuição da secreção de TNF-α, IL-6, e por KC células do pulmão (Fig. 5C, D). Estes resultados sugeriram que a redução da resposta inflamatória pela inibição da activação do NF-kB, são susceptíveis de ser um importante mecanismo de inibição de tumores de CDA-2 e PG.

A indução de citocinas inflamatórias e ARNm de quimiocina em homogenatos de três ou pulmões 5 dias 2,000 mg /kg CDA-2 (A) ou 800 mg /kg de PG (B) tratado foi medida por PCR em tempo real. Os resultados são médias ± SEM, n = 5, diferença significativa, * p 0,05. Concentração de citocinas inflamatórias em LBA de 3 ou 5 dias de 2,000 mg /kg CDA-2 (C) ou 800 mg /kg de PG (D) ratinhos tratados foi avaliada por ELISA. Os resultados são médias ± SEM, n = 5, diferença significativa, * p . 0,05

CDA-2 inibe TLR2 Sinalização em macrófagos Bone-derivadas da medula

Estudos anteriores mostraram que semelhante a Toll (TLRs) mediada por sinalização favorecer a activação de NF-kB, que conduz a uma resposta pró-inflamatória [21]. Para abordar se CDA-2 inibiu o NF-kB através de TLR via de sinalização, examinámos a expressão de membros da família de TLR em macrófagos osso derivadas de medula (BMDM) que foram estimuladas por meio condicionado isento de soro de células LLC (LLC-CM) . LLC-CM induzida significativamente a expressão de TLR2 e o seu co-receptor TLR6 e CD14 (Fig. 6A, B), mas não TLR1, TLR3, TLR4, e TLR9 em BMDM (dados não mostrados). Importante, a adição de 2-CDA ou PG suprimiu significativamente a expressão de TLR2, TLR6, e CD14 num modo dependente da concentração (Fig. 6A, B). A incubação de BMDM com CDA-2 ou PG sozinho não teve efeito sobre o TLR2, TLR6, e expressão de CD14 (Fig. 6A, B). Estes resultados sugerem que o TLR2 signiling poderia actuar como mediador e contribui para a inactivação de NF-kB pela CDA-2 e PG

.

BMDMs foram tratados durante 24 h por DMEM isento de soro (SFM) ou LLC-CM ou combinação com 2-CDA (A) ou de PG (B). Os ARNs totais foram isolados a partir BMDMs, e a expressão do gene foi avaliada por PCR em tempo real. Os resultados são a mudança de dobragem média ± SEM, n = 3, diferença significativa, * p . 0,05

A inibição da CDA-2 a A activação de NF-kB foi anulada pela sobre-expressão de TLR2

Para melhor avaliar TLR2 sinalização mediada por activação de NF-kB foi regulamentado pela CDA-2, foi realizado ensaio de gene repórter luciferase-driven NFkB. Os vectores adenovirais recombinantes foram gerados que codifica TLR2 expressa em BMDM. TLR2 ou vetor de controle infectado BMDM foram infectados com NF-kB repórter luciferase plasmídeo adenovírus. Ambos tratamento BMDMs infectados com LLC-CM resultou em aumentos significativos na ligação de NF-kB para a sua sequência de ADN de consenso, como indicado por um aumento na activação de luciferase (Fig. 7A). TLR2 BMDM infectadas mostrou activações basais significativas deste factor de transcrição e maiores valores de LLC-MC quando comparada com os valores de controlo (Fig. 7A). O tratamento de 2-CDA ou PG causou redução significativa do induzida LLC-CM transactivação NF-kB em BMDM controlo infectado, enquanto não há nenhuma mudança na actividade repórter pela CDA-2 ou PG em células infectadas TLR2 (Fig. 7A). Consistente com os resultados de transactivação de NF-kB, estas construções também produziram efeitos semelhantes sobre a expressão de IL-6 TNFαand (Fig. 7B). Assim, a inibição da expressão de TLR2 por CDA-2 e o seu componente de PG é necessária para a inactivação de NF-kB em células mielóides.

BMDMs (A) foram co-infectadas com TLR2 e de NF-kB do gene repórter da luciferase construções adenovirais . 24 horas após a infecção, as células foram tratadas com SFM ou LLC-CM e /ou CDA-2 ou PG, tal como indicado. actividades de luciferase foram determinadas 24 horas após o tratamento. Os dados são apresentados como média ± EPM relativa dobra de controlar. n = 3, diferença significativa, * p 0,05; ns, não significativo. (B) A indução de ARNm de citocinas inflamatórias em BMDMs infectadas como acima descrito. Os resultados são a mudança de dobragem média ± SEM, n = 3, diferença significativa, * p 0,05; ns, não significativo.

Discussão

A principal conclusão deste estudo é que CDA-2, uma preparação urinária, inibe o crescimento do tumor de pulmão através de uma célula mielóide intermediária. CDA-2 reduz a inflamação no pulmão através da supressão da activação do NF-kB em células mielóides associar-se com a modulação de sinalização de TLR2. O principal constituinte do CDA-2, PG, é susceptível de desempenhar um papel central para o efeito anti-tumoral de CDA-2.

Este estudo testou directamente o efeito inibidor do tumor importante de CDA-2 usando pulmonar experimental modelos de tumor. Estudos anteriores tinham mostrado que a CDA-2 é de valor como potencial agente anti-cancro [3], [7]. CDA-2 tem sido estudado e mostrado para inibir o crescimento de células de cancro da mama humano, células de glioma, e células de leucemia humana in

in vitro

e

In vivo

[3], [7]. Clinicamente, a CDA-2 mostrou efeitos significativos na melhoria das respostas de quimioterapia em glioma, hepatoma, cancro do pulmão de células não pequenas, e pacientes com câncer de mama [7]. PG é um dos principais constituintes bioactivo em CDA-2. Estudos anteriores sugerem que PG possui um efeito inibidor potencial de um tumor, e que também é um componente importante de antineoplaston AS2-1, uma mistura de sais de sódio do ácido fenilacético e PG, a qual é um medicamento anti-tumoral [3], [22] . Os dados deste estudo confirmam que o tratamento primeira CDA-2 directamente resulta numa paragem do crescimento de tumor do pulmão e um tempo de vida prolongado em ratinhos, indicando a actividade anti-tumoral potente de CDA-2 na inibição do crescimento do tumor de um modo dependente da dose. Tanto a proliferação de inibição e os efeitos indutores de apoptose foram observadas em tumores de pulmão, tal como demonstrado por imuno-histoquímica e análise de transferência de Western. PG também exibe um efeito directo sobre o crescimento do tumor de pulmão, e tem resultados semelhantes de inibição do tumor como CDA-2. Estes resultados sugerem que a CDA-2 pode ser um remédio potencial terapêutico para o tratamento de cancro do pulmão, e acredita-se que PG contribuir para a maior bioactividade de CDA-2, devido à elevada percentagem (41%) e efeito de supressão tumoral clara.

O microambiente do tumor desempenha um papel crítico na iniciação e promoção de tumores e células do sistema imunológico e contém tecido conjuntivo, tais como fibroblastos, células endoteliais, pericitos, e células mesenquimais [23]. As células do sistema imunológico mais freqüentemente encontrados dentro do microambiente do tumor são os macrófagos associados a tumores (TAMs). TAM principalmente promover o crescimento do tumor e pode ser obrigatório para a angiogênese, invasão e metástase pela liberação de citocinas e quimiocinas inflamatórias, e sua presença no cancro do pulmão tem sido correlacionada com mau prognóstico de pacientes com câncer de pulmão [24], [25] e outros resultados tais como um aumento da contagem de microvasos [26]. Como partes de loops de feed-forward positivos, quimiocinas produzidas por TMAs atrair células /imunes adicionais inflamatórias, incluindo macrófagos para microambiente do tumor [27]. Nossos dados mostram tratamento dos resultados CDA-2 ou PG em uma diminuição do total de células no BALF, que macrófagos mais afetadas, reduziu a inflamação. Assim, é provável que a CDA-2 inibe o crescimento do tumor de pulmão através da supressão da população de células imunitárias /inflamatórias e inflamação no pulmão.

A activação de NF-kB é responsável pela indução de uma variedade de genes alvo que são importantes para a tumorigénese [28], [29]. activação de NF-kB em células inflamatórias controla a produção de citocinas pró-inflamatórias, incluindo TNFa, IL-1, IL-6, e IL-23, que medeiam a promoção e progressão do tumor, bem como a activação de NF-kB em células tumorais [ ,,,0],8], [11]. activação de NF-kB também é encontrada em células tumorais, onde regula a proliferação celular, sobrevivência, angiogénese, invasão e metástase [30] – [32]. O efeito promotor da activação do NF-kB na carcinogénese pulmão já foi mostrado com diferentes abordagens e relatado por diversos grupos, e o esgotamento de mielóide celular ou epitelial do NF-kB parecem ter um efeito na redução da tumorigenese do pulmão [9], [ ,,,0],33] – [36].