Sumário
bactérias individuais e mudanças na composição do microbioma têm sido associados com doenças humanas, incluindo câncer. Para investigar mudanças no microbioma associados com câncer oral, nós perfilado cancros e anatomicamente combinado tecido normal contralateral do mesmo paciente por sequenciação 16S rDNA amplicons região hipervariável. Em amostras de câncer de ambos uma descoberta e uma subsequente coorte confirmação, abundância de
Firmicutes
(especialmente
Streptococcus
) e
Actinobacteria
(especialmente
Rothia
) foi significativamente diminuída relativamente a amostras normais contralateral do mesmo paciente. reduções significativas na abundância desses filos foram observados para pré-cânceres, mas não quando se comparam amostras de sites contralateral (de língua e assoalho da boca) de indivíduos saudáveis. Ponderada principais UniFrac análise de coordenadas com base em 12 taxa separada a maioria dos cânceres de outras amostras com maior separação dos casos positivos de nós. Estes estudos começam a desenvolver um quadro para a exploração do microbioma oral para o acompanhamento da evolução do câncer oral, progressão e recorrência
Citation:. Schmidt BL, Kuczynski J, Bhattacharya A, Huey B, Corby PM, Queiroz ELS, et al . Muy-Teck Teh (2014) mudanças na abundância de Oral microbiota associada com o cancro oral. PLoS ONE 9 (6): e98741. doi: 10.1371 /journal.pone.0098741
Recebido: 21 de agosto de 2013; Aceito: 07 de maio de 2014; Publicação: 02 de junho de 2014
Direitos de autor: © 2014 Schmidt et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte por uma concessão de um GS Júnior 454 Sequência prazo da Roche, o Centro Nacional de Recursos de pesquisa, do Centro Nacional para a Promoção da Ciência translacional, e do Gabinete do Director, Institutos Nacionais de Saúde, através da Universidade de San Francisco ( UCSF) – número de concessão CTSI UL1 RR024129 e prêmios investigador individuais a partir da concessão do National Cancer Institute (R01 CA131286, R21 CA 941.186.215) e do Instituto Nacional de pesquisa Dental e Craniofacial (R01 DE019796). O seu conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente a posição oficial do NIH. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:. O recebimento de um prêmio para o sequenciamento da Roche, um financiador comercial, não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento. Dr. Justin Kuczynski é um funcionário da Segunda Genome, Inc. Seu emprego não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.
Introdução
Anualmente, ~ 22.000 americanos são diagnosticados com câncer de boca, dos quais 90% são carcinomas de células escamosas (SCC). A sobrevivência de cinco anos, em 40% não melhorou nos últimos 40 anos, e é um dos mais baixos dos principais locais de câncer, o que resulta em mais pessoas morrem de câncer oral de melanoma, o cancro do colo do útero ou ovário nos EUA. Em todo o mundo existem 350.000-400.000 novos casos diagnosticados a cada ano. Diferentemente da maioria dos outros locais anatômicos, que diminuíram na incidência de câncer, a incidência de câncer de boca está aumentando, especialmente entre os jovens e as mulheres [1], [2]. O principal uso fatores de risco, tabaco e álcool, não pode explicar as mudanças na incidência, porque o cancro oral também ocorre comumente em pacientes sem história de exposição ao tabaco ou álcool [3]. Recentemente, o vírus do papiloma humano (HPV) tem sido identificada como um agente etiológico para o câncer de orofaringe, mas a infecção pelo HPV não é um contributo significativo para o câncer oral, como o vírus é raramente encontrada em esses tipos de câncer (2-4% dos casos) [4] . Assim, as contribuições de outros, possivelmente, fatores ambientais continuam a ser encontrados.
Um papel para a infecção bacteriana em causar ou promover o câncer é bem conhecido em relação à associação de
Helicobacter pylori
com câncer gástrico [5], e outros cancros, incluindo os da vesícula biliar, cólon, pulmão e próstata, têm sido associados com infecções bacterianas específicas [6], [7], [8]. É razoável perguntar, portanto, se as mudanças na composição do microbioma cavidade oral normal, composta por mais de 600 diferentes espécies bacterianas [9] e infecção bacteriana /ou crónica poderia ser promotores ou causas de câncer bucal. Com efeito, as mudanças na comunidade microbiana são comumente associados com doenças dentárias, tais como a doença periodontal, o que é mais provável de uma doença polimicrobiana caracterizada pelo crescimento de certos organismos patológicos [10], e a periodontite crónica tem sido relatada como sendo um factor de risco para o pré-malignas por via oral lesões e cânceres [11]. Níveis elevados e mudanças na composição da microbiota bacteriana e fúngica da cavidade oral tem sido relatada em associação com os pré-cancros e cancros orais [12]. Há, no entanto, não há consenso entre os relatórios referentes às mudanças associados ao câncer no microbioma oral. Esta confusão pode ter surgido porque os primeiros estudos foram limitados a análise dos números relativamente pequenos de espécies de bactérias orais conhecidos e cultiváveis [13], [14], e estudos posteriores utilizando métodos moleculares focados em especial filos [15] ou clonado e sequenciado pequena número de clones por exemplo [16], [17].
Cultura métodos independentes, particularmente as que utilizam próxima sequenciamento geração da região hipervariável da subunidade ribossômica 16S, fornecer um meio de perfil mais abrangente e com precisão o microbioma na saúde e na doença [18]. Tais estudos da microbiota oral [16], [19], [20], [21], [22], [23], [24], [25], [26], [27], [28] revelam , por um lado, que o microbioma saudável oral é caracterizada por um número relativamente pequeno de filos bacteriana (9-13), o mais comumente reportados filos abundante sendo
Firmicutes
,
Proteobacteria
,
Bacteroidetes
,
Actinobacteria
, e
Fusobactérias
[16], [19], [20], [21], [22], [23], [24 ], [25], [26], [27], [28]. Por outro lado, a maior parte da variação inter-individual tem sido atribuída a diversidade nas espécies ou nível de tensão [24].
Streptococcus
é mais frequentemente observado para ser o gênero dominantes no microbioma saudável oral e, com menos frequência
Prevotella
,
Veillonella
,
Neisseria
e
Haemophilus
dominar microbioma via oral de um indivíduo [19], [24]. Variação também é observada na composição da comunidade microbiana de biofilmes em cada habitat intraoral (
por exemplo
., A superfície do dente, lateral e dorsal da língua, etc.), provavelmente refletindo as diferentes propriedades da superfície e microambientes [21], [24].
para investigar adequadamente possíveis mudanças na composição do microbioma oral em câncer oral, portanto, é necessário controlar as diferenças entre subsites orais e variação inter-individual. Além disso, altas taxas de recorrência e prevalência de um segundo câncer orais primários apoiar a proposta de que esses tipos de câncer desenvolvem a partir de um campo de células geneticamente alteradas, o conceito de “cancerização de campo” [29]. Tais campos têm sido relatados para estender tanto quanto sete centímetros de um tumor e a aparecer clinicamente normais [30]. Por estas razões, foi investigada a cancro associada microbioma por via oral de forma não invasiva a amostragem da lesão do cancro e uma região anatomicamente contralateral correspondente de tecido normal a partir de cada indivíduo. Nós ADN submetido isolado a partir destas amostras para ribossomal 16S subunidade amplificação e sequenciação. O objectivo destes estudos era começar a estabelecer uma base que permita a exploração do microbioma oral para tratamento e monitorização da iniciação do câncer oral, progressão e recorrência.
Resultados
Para investigar as mudanças na o microbioma oral associada com o câncer oral, que prospectivamente coletados de câncer e pacientes anatomicamente combinado amostras clinicamente normais a partir de cinco pacientes (Tabela 1, Estudo 1 Descoberta Cohort, Tabela S1). Para confirmar e estender nossas observações iniciais, foi realizado um segundo estudo (Estudo 2, Tabelas S2 – S6, o número total de amostras = 83) em que foram coletados prospectivamente um conjunto independente de amostras clinicamente normais lesional e anatomicamente combinados de câncer oral (Tabela 2, Estudo 2 Cohort confirmação, Tabela S2), carcinoma
in situ
(CIS, Tabela S3) e os pacientes pré-cancerosas (Tabela S4), bem como dos lados esquerdo e direito da língua lateral e assoalho da boca de indivíduos normais saudáveis (Tabela S5). No Estudo 2, também incluímos uma análise independente dos cinco pacientes com câncer inicial de Estudo 1 e seis pares de amostras idênticas (três cancerosas e três pacientes pré-cancerosas, Tabela S6). Estes últimos foram incluídos para avaliar a reprodutibilidade de coleta e processamento de amostras e não foram incluídos em nenhuma das análises (ver discussão em Métodos).
Estudo 1. Descoberta coorte
Nós limpou a lesão câncer bucal e uma correspondente anatomicamente combinado área clinicamente normais do tecido a partir da descoberta de coorte de cinco pacientes (Tabela 1). Usando o instrumento Roche GS Júnior para executar pyrosequencing, obtivemos, em uma única corrida, um total de 104,380 sequências de fragmentos amplificados que se estendeu região hipervariável do V4 do 16S bacterianas pequena subunidade ribossômica (Tabela S7). O número de sequência em bruto lê variada por 10 vezes através de amostras, que vão desde 1231 até um máximo de 17,682 leituras em bruto. seqüências filtradas qualidade foram pesquisadas no banco de dados de referência Greengenes de sequências 16S, agrupadas em 97%, e unidades taxonômicas operacionais (Otus) foram atribuídos classificação taxonômica usando classificador Bayesian do mothur. Dos 92,987 sequências que passaram filtragem qualidade, 81.308 eram semelhantes a bactérias conhecidas e mais poderia ser classificada ao nível de gênero (65.037) com menos classificados em nível de espécie (17.115). cobertura sequência foi variável em toda amostras; o número de leituras por amostra atribuído a OTUs (excluindo aqueles filtrada devido à má qualidade ou a falta de uma sequência relacionada no banco de dados de referência Greengenes) variou de 1.038 a um máximo de 14.359, e composta por 76-85% de sequências de matérias-(Tabela S7 ). Um total de 276 OTUs foram identificados (por faixa de amostras, 37-161, (Tabela S8). Análise Rarefação realizada a nível familiar demonstrou uma gama bastante ampla da diversidade α com o número de famílias detectados variam de ~15-28 (Figura .. S1a) Três amostras de doentes, normal e cancro do paciente 117 e a amostra normal de paciente 142, estabilizou em menos famílias do que as outras amostras, indicando diversidade algo reduzida nestas amostras Todas as amostras estabilizado, em certa medida, mas não completamente; mais sequenciamento provavelmente revelam famílias adicionais. por outro lado, pyrosequencing ruído e erros de PCR poderia erroneamente aumentar o número de OTU [31]. Um efeito semelhante foi visto no nível de gênero (Figura S1b).
Diversidade das microbiomes associado com câncer oral, anatomicamente combinados e amostras normais
o OTUs das amostras de câncer e clinicamente normais na coorte de descoberta foram classificados em 12 filos (Tabela S7). a maioria pertencia a um dos cinco filos (99,2%, normais , 98,0% cancros), com os filos mais abundante sendo
Firmicutes
,
Bacteroidetes
,
Proteobacteria
,
Fusobactérias
, e
Actinobacteria
(Tabela 7, Figura 1). Embora a distribuição no cancro e amostras clinicamente normais destes cinco filos comum variou entre os indivíduos (Figura 1), em todos os pacientes, observou-se uma redução significativa na abundância de
Firmicutes
e
Actinobacteria
em cancro, em comparação com a amostra anatomicamente combinados contralateral clinicamente normais do paciente, (p = 0,004, ajustado FDR p = 0,02 e p = 0,028, ajustado FDR p = 0,07, respectivamente). Observamos também que a proporção de
Fusobactérias
foi aumentado em todos os pacientes, mas a mudança em abundância não alcançou significância estatística (p = 0,074, Figura 2). Notamos, no entanto, que para observar mudanças consistentes na abundância dos três filos neste pequeno grupo é altamente significativo. Ignorando as interacções entre as abundâncias relativas dos diferentes filos, um rendimento de ensaio binomial p = 0,0022 como a probabilidade (sob a hipótese nula) de ter três ou mais filos onde (todos os cinco pacientes compartilhar um aumento) ou (todos os cinco partes de um decréscimo).
a distribuição relativa dos filos (cento das sequências) é mostrado para cada amostra com amostras clinicamente normais mostrados juntos em amostras superior e câncer no fundo
(a -. e ) abundância relativa de cada um dos cinco filos mais abundante em cancros em comparação com amostras clinicamente normais a partir de cada um dos cinco pacientes. Note-se, que os dados são apresentados em diferentes escalas, o que reflecte a abundância dos filos. As magnitudes das mudanças na abundância são claramente maior do que o ruído de contagem estatística, como indicado pelas estimativas barra de erro, que são baseados na raiz quadrada do número real de leituras. (F) Mudança na abundância relativa como a diferença na abundância de filos associado a cânceres em comparação com anatomicamente combinado amostras normais contralateral clinicamente. Nos cancros, reduções na abundância relativa de
Firmicutes
e
Actinobacteria
foram observados em todos os pacientes, enquanto a abundância relativa de
Fusobactérias
foi elevada em cancros de todos os pacientes.
Estudo 2. confirmação coorte
Para confirmar estas observações iniciais, foi realizada Estudo 2. Como antes, limpou tanto da lesão (câncer ou pré-câncer) e um anatomicamente contralateral local correspondente clinicamente normal. Nós limpou os lados esquerdo e direito da língua lateral e assoalho da boca dos indivíduos saudáveis. Usando o instrumento Illumina MiSeq, nós sequenciado amplicons abrangendo região hipervariável do 16S rDNA V4. Obtivemos 4.486.196 sequência cru lê com uma gama de 31.109 a 125.847 leituras por amostra após a exclusão de duas amostras que falharam na sequenciação (Tabelas S9 – S13). Nós atribuímos classificação taxonômica ao OTUs como antes. Das sequências que passaram filtragem qualidade, 4.444.432 foram semelhantes a bactérias conhecidas e mais poderia ser classificada ao nível de gênero (4.148.785) com menos classificados em nível de espécie (1.650.037). Foram identificados um total de 2.107 OTUs (por faixa de amostras, 90-482, tabelas S9 – S13). análise de rarefação demonstrou uma gama bastante ampla da diversidade α com quase todas as amostras plateauing até certo ponto (Figura S2). Como discutido acima, ruído sequenciamento e PCR erros podem aumentar o número de OTU [32].
Diversidade das microbiomes associados com amostras anatomicamente pareados por câncer oral, pré-câncer e indivíduos normais saudáveis no Estudo 2
em primeiro lugar, determinou que os dados recolhidos em nove das amostras de 10 Descoberta de coorte que foram perfilados com sucesso no Estudo 2 (Tabela S9) foram altamente correlacionados com os dados originais obtidos por 454 pyrosequencing (Figura S3). Nós, então, considerado o Cohort Confirmação composto apenas de amostras de pacientes com câncer não incluídos na descoberta de coorte,
i
., Foram excluídos das amostras de coorte nove Descoberta (Tabela 2, Tabela S9). Encontramos novamente que a maioria dos OTUs (61-100%) pertencia a uma das mais de cinco filos abundante (
Firmicutes
,
Bacteroidetes
,
Proteobacteria
,
Fusobactérias
, e
Actinobacteria
) (Figura 3a, Tabela S14). Em seguida, perguntou se houve reduções significativas na abundância de
Firmicutes
e
Actinobacteria
em cancro, em comparação com a amostra do paciente contralateral clinicamente normais anatomicamente correspondido. Com efeito, como se tinha observado na coorte de Descoberta (Estudo 1), houve uma redução significativa na abundância destes dois filos em cancros em comparação com as amostras anatomicamente combinados contralateral clinicamente normais de pacientes (p = 0,042 e p = 0,004, respectivamente), confirmando nossas observações iniciais (Figura 3B, Figura S4).
(a) é mostrada a distribuição relativa dos filos (cento das sequências). Para cânceres, foram incluídos apenas os pacientes para os quais tanto o câncer e amostras normais clinicamente contralateral estavam disponíveis. (B) Mudança na abundância relativa de filos como sua diferença na abundância de filos associado com câncer ou pré-cânceres em comparação com anatomicamente combinado amostras normais contralateral clinicamente. Para amostras normais saudáveis, que comparou os lados da língua lateral ou assoalho da boca esquerda e direita.
No Estudo 2, também observamos que a maioria dos OTUs em amostras de pacientes pré-cancerosas e saudáveis normais (Figura 3a) pertencia a um dos cinco filos
Firmicutes
,
Bacteroidetes
,
Proteobacteria
,
Fusobactérias
, e
Actinobacteria
(pré-cânceres = 99-100%, normal e saudável = 87-100%). Mais uma vez perguntou se reduções significativas na abundância de
Firmicutes
e
Actinobacteria
pode também estar presentes quando se compara pré-cânceres e anatomicamente combinado amostras contralateral clinicamente normais do paciente. Nós encontramos que a abundância de
Firmicutes
e
Actinobacteria
foi reduzida (p = 0,048 e p = 0,037, respectivamente), o que sugere que as mudanças na abundância de estes dois filos pode ocorrer no início (Figura 3b ). Em contraste, não encontramos diferenças significativas na abundância de estes dois filos ou qualquer um dos cinco filos mais abundante na comparação entre os lados esquerdo e direito da língua lateral e assoalho da boca de indivíduos normais saudáveis (Figura 3b).
para investigar mudanças na abundância no nível de gênero para os cinco filos mais abundante, foram considerados pacientes amostras emparelhadas desde a confirmação de coorte e também incluiu quatro dos casos de cinco Descoberta de coortes que foram analisadas com sucesso no Estudo 2 (14 cânceres de 13 pacientes, Tabela S9). Nós normalizou o número de UTOs para um milhão de contagens, (Tabela S15) e para cada filo, determinou-se mudanças na abundância dos géneros que representada 10% de UTOs em mais de 20% das amostras (Figura S5 e S6). Foi observada redução significativa em abundância para
Streptococcus
(p = 0,003) e
Rothia
(p = 0,021) em cancros em relação a amostras clinicamente normais anatomicamente pareadas (Tabela S16). Por outro lado, observamos aumento da abundância de
Fusobacterium
(p = 0,044) em relação a amostras clinicamente normais correspondentes em pacientes com câncer. Na pré-cânceres, observamos reduziu significativamente abundância de
Streptococcus
(p = 0,042) (Tabela S16). Não foram encontradas diferenças significativas na abundância destes gêneros mais comuns quando se compara a abundância em amostras retiradas dos lados esquerdo e direito da língua lateral e assoalho da boca de indivíduos saudáveis (Tabela S16).
Nós também observou que embora não encontramos mudanças consistentes na abundância de
Bacteroidetes
quando se comparam dentro dos indivíduos (Figura 3b), amostras de pacientes com câncer e pré-cancerosas (tanto lesão e anatomicamente combinados tecido contralateral clinicamente normais) foram associados com o aumento da abundância de
Bacteroides
em comparação com amostras de indivíduos saudáveis normais (Figura 3A).
Prevotella
espécies, em particular, diferente e incluiu, por exemplo, OTUs correspondente a
P. intermedia
,
P. melaninogenica
,
P. nanceiensis
,
P. oris
,
P. tannerae
e as espécies não classificadas (Figura S5, S15 Tabela). Níveis elevados de
P. melaninogenica
foram relatados anteriormente como um potencial biomarcador salivar de câncer oral [33] e
P. intermedia
é um agente patogénico periodontal [34]. serão necessários mais estudos para compreender as contribuições de geral (
Bacteroidetes
) e alterações específicas de lesão (
Actinobacteria
,
Firmicutes
) no microbioma do câncer bucal e pré pacientes -Câncer.
câncer distintiva OTUs de anatomicamente combinados amostras contralateral de pacientes normais
para atender à necessidade de biomarcadores para prever o comportamento dos cancros orais que poderiam ser analisadas por testes não-invasivos, pedimos se amostras de câncer poderiam ser distinguidos pela composição bacteriana. Considerando câncer /amostras pareadas normais, foram identificados 11 OTUs do filos
Actinobacteria
(
Actinomyces
e
Rothia
, 2 OTUs de cada gênero) e
Firmicutes
(
Streptococcus
, 7 OTUs), que foram significativamente menores em cancros e uma OTU do filo
Fusobactérias
(
Fusobacterium
), que foi aumentada em cancros em comparação com anatomicamente amostras emparelhadas contralaterais normais de pacientes (Tabela S17). Ponderada principais UniFrac análise de coordenadas (PCoA) com base neste conjunto de OTUs separados maioria dos cânceres de amostras normais e pré-cancerosas com cinco dos casos positivos de sete nódulos linfáticos que formam um conjunto apertado no canto inferior direito do gráfico (Figura 4). Metástase para os cervicais gânglios (pescoço) linfáticos é um dos principais determinantes da sobrevida do paciente câncer oral [35]. A atual falta de métodos fiáveis para avaliar o risco de resultados de metástases em pacientes que estão sendo rotineiramente submetidos a cirurgia adicional para remover os gânglios linfáticos, embora a maioria não vai beneficiar do procedimento. O agrupamento apertado de amostras de pacientes positivos nó na Figura 4 sugere que mudanças na composição do microbioma câncer bucal podem também realizar promessa como um biomarcador associado a tumor de risco de metástase.
PCoA com base na distância UniFrac ponderada entre amostras dada a abundância de 12 OTUs. Eixo 1 (PCoA1): 54% da variação explicada. Eixo 2 (PCoA2): 24% da variação explicada. N0 e N + indicar o status nodal do paciente com câncer, N0 = nó negativo, N + = nódulo positivo. controle do câncer e controle pré-câncer são amostras de pacientes clinicamente normais contralaterais. Outras amostras identifica de indivíduos normais saudáveis
micrbiome todo -. Beta diversidade
Para investigar dissimilaridade amostra-a-amostra, subsampled os dados selecionando aleatoriamente 31,109 sequências de cada comunidade para ajuste para a variação na profundidade de sequenciamento (Tabela S18). Ao considerar os três grupos de amostras (cancros, normais saudáveis e pré-cânceres), observamos diferenças microbioma significativas para a identidade do paciente com base em ambas as métricas ponderados UniFrac (abundância) e não ponderada UniFrac (presença /ausência) (Tabela S19, Figuras S7 e S8). Não há outras comparações, como a esquerda versus direita, número de sequências ou lesão (câncer ou pré-câncer) vs. controlo locais normais revelou diferenças significativas. Estas observações são consistentes com outros estudos que têm destacado as diferenças inter-individuais no microbioma oral [24]. Além disso, eles apoiar o nosso projeto de estudo, que mede as mudanças no microbioma dentro dos indivíduos,
ou seja
., Usando cada paciente como seu próprio controle.
Discussão
Para estudar mudanças microbioma associada à malignidade orais, foi realizada uma tela Descoberta cancros (Estudo 1), em que nós não invasiva incluídos na amostra e amostras de tecido clinicamente normais contralaterais de cada indivíduo. Comparação da composição das comunidades microbianas em pacientes identificou alterações na abundância de
Actinobacteria
e
Firmicutes
. Nós confirmaram estas observações em uma segunda coorte de confirmação (Estudo 2) e ainda encontraram alterações significativas na abundância do
Actinobacteria
género
Rothia
e
Firmicutes
género
Streptococcus
quando se consideram todos os cânceres no estudo 2 (Tabela S16). Embora nós não ver uma mudança significativa na abundância do filo
Fusobactérias
tanto na descoberta ou coortes de confirmação, nós encontramos um aumento significativo na abundância do
Fusobactérias
género,
Fusobacterium
quando se consideram todos os pacientes com câncer no Estudo 2. Notamos que enquanto os grupos de doentes estudados aqui são pequenas e heterogêneas, nossos achados em relação abundância de filos são semelhantes aos estudos publicados, que incidiu sobre a análise abrangente do microbioma oral. Além disso, o uso de diferentes tecnologias de sequenciamento para medir a abundância de amplicons 16S rDNA em Estudos 1 e 2 suporta a robustez das nossas observações. No entanto, mais estudos maiores devem ajudar a definir melhor as cancerosas mudanças associadas orais em abundância destes filos e gêneros. Além disso, foram observadas mudanças na abundância de
Firmicutes
(
Streptococcus
) em associação com pré-cânceres orais, sugerindo que mudanças lesão bucal associadas na composição da comunidade microbiana pode ocorrer no início da via oral desenvolvimento de câncer e /ou progressão do câncer arauto.
O tabagismo é um fator de risco para doenças orais, incluindo câncer e periodontite. Estudos têm demonstrado que os impactos fumadores a composição das comunidades bacterianas presentes na cavidade oral, incluindo, por exemplo, o microbioma salivar dos fumadores saudáveis e não-fumadores [36] e os microbiomas subgengivais de pacientes com doença periodontal [37], bem como a formação de biofilme da placa [38]. Em nosso estudo, não encontramos nenhuma evidência de diferenças globais nos microbiomes que pudessem ser atribuídas ao tabagismo, mas com apenas três fumantes atuais e quatro não-fumantes em nosso cancro coortes de pacientes, por exemplo, não podemos tirar qualquer conclusão neste momento. Por um lado, porque usamos cada paciente como sua /seu próprio controle, não seria de esperar para ver diferenças associadas fumadores em abundância de microbiota associada ao câncer, uma vez que fumar afetaria tanto o local de controle e que o câncer. Por outro lado, em fumantes, as células nos locais clinicamente normais e os cancros minha respondem diferentemente a fumar mudanças induzidas na formação de biofilme, por exemplo, levantando a possibilidade de que as mudanças enquanto o câncer associados na abundância de microbiota em fumantes e não-fumantes parecer semelhante, a formação e as consequências funcionais de microbiomas alterados podem diferir nestes grupos de pacientes. Considerações semelhantes podem ser aplicadas a indivíduos imunodeprimidos.
A presença de bactérias em cancros e /ou diferenças nas comunidades bacterianas associadas com câncer oral, têm sido relatados anteriormente orais usando tanto dependente da cultura [13], [14] ou molecular métodos [15], [16], [17], ainda não há observações consistentes foram relatados através destes estudos. É, no entanto, difícil fazer comparações, mesmo entre dois estudos recentes relatórios abundância de bactérias [16], [17] e este estudo, devido a diferenças no (a) tipo de amostra (swab, este estudo vs. amostra de tecido [16] [17]), (b) site de cavidade oral, (c) fonte de paciente combinado amostras de controlo normais (anatomicamente combinado contralateral clinicamente normais, este estudo, trato aerodigestivo superior mucosa [16], normal adjacente [17]), (d ) região amplificada do gene ribossomal 16S (V4, neste estudo, V4 V5-[16] ou V1-V4 [17]), (e) a metodologia (Sanger [16], [17] vs pyrosequencing ou MiSeq, este estudo ), e (f) número de clones ou sequência lê atribuído a OTUs por amostra (média de 8000 e 55.000 leituras por amostra, Estudo 1 e 2, respectivamente, em comparação com -90 ou -250 clones por exemplo [16], [17] ). Por exemplo, Pushalkar e colegas [16] relatando em 10 doentes mostrou que 75 e 80% dos clones (normais e de cancro, respectivamente) foram atribuídos ao filo
Firmicutes
. Esta proporção não é apenas maior do que o 40-0% relatado em outros estudos da cavidade bucal de pacientes saudáveis ou câncer, mas uma vez que apenas ~ 90 clones foram sequenciados por amostra, há muito poucos clones para determinar com fiabilidade relativa abundância de outros filos para comparações. A análise de nível de filo de apenas 16 língua, assoalho da boca e cânceres da cavidade oral relatados por Bebek e colegas [17], no entanto, revelou aumento câncer associado em abundância do filo
Fusobactérias
, consistente com nossas observações, mas diminuiu abundância de
Streptococcus
não podia ser visto, como alguns clones foram atribuídos a este gênero.
não podemos distinguir se as mudanças observadas na comunidade microbiana reflectir o facto de certas bactérias são mais adequado para aderir e crescer no microambiente do cancro ou se são cancro promoção. Além disso, não está claro como a pesar as contribuições potenciais de mudanças nos géneros abundantes tais como
Streptococcus
comparado ao menos abundante
Actinobacteria
gêneros. papéis potenciais para bactérias e fungos na promoção do câncer incluem a geração de substâncias cancerígenas, como nitrosamina ou outros produtos químicos pró-cancerígenos, inflamação crônica e efeitos diretos sobre a sinalização em células epiteliais resultando na proliferação ou supressão de apoptose [6] reforçada, [7] [12], [39]. Apenas uma minoria da comunidade microbiana oral podem aderir aos tecidos orais moles e duros, e montagem do biofilme bucal complexo é realizado pela adesão posterior de colonizadores secundários.
Streptococcus
é um colonizador precoce e
Fusobacterium
(
por exemplo
.,
F. Nucleatum
) tem uma propensão para a co-agregação com muitos gêneros, formando uma ponte entre colonizadores iniciais e tardios no biofilme oral [40]. Assim, por um lado, a diminuição observada na prevalência de
Streptococcus
e aumento da abundância de
Fusobacterium
gêneros em pré-cânceres poderiam refletir as propriedades da superfície alterados de as células cancerosas e estroma, que pode já não suportam adesão de
estreptococos
. Por outro lado, podemos supor que mudanças na abundância desses dois gêneros poderia resultar em um ambiente pró-inflamatória aumentada, uma vez que
Streptococcus
espécies têm sido relatadas para atenuar
Fusobacterium nucleatum
induzido pro -inflamatória respostas de células epiteliais por via oral [41], [42]. Observamos também que
Fusobacterium nucleatum
crescido como um biofilme é capaz de invadir culturas organotípicas [43] e, por outro, que o organismo recentemente tem sido relatada em cancros do cólon [44], [45], apoiando ainda mais a papel potencial no câncer oral.
a cavidade oral oferece uma oportunidade única relativamente a tela em indivíduos de risco para câncer (oral), porque as lesões podem ser vistas, e como nós relatamos aqui, a mudança no microbioma de as lesões cancerosas e pré-cancerosas, em comparação com o tecido clinicamente normais anatomicamente combinados a partir do mesmo indivíduo pode ser detectado em amostras de esfregaços colhidos de forma não invasiva. A saliva é uma outra amostra oral, não-invasiva recolhidos composto em grande parte de células bacterianas, mas também lançar as células epiteliais e do sistema imunológico.